安俐瑤，姜英子* ，徐雅娟

(1.延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

射干麻黃湯出自《金匱要略》，由射干、麻黃、生姜、細(xì)辛、紫菀、款冬花、大棗、半夏、五味子組成[1]，臨床上常用于治療痰飲咳嗽，寒痰、濕痰引起的喉中痰鳴[2]。郝文梅[3]發(fā)現(xiàn)射干麻黃湯治療痰濕阻肺型咳嗽療效較佳，該方能夠清除由長(zhǎng)期咳嗽產(chǎn)生的咽喉部郁熱從而達(dá)到很好的鎮(zhèn)咳效果。脾為生痰之源，肺為儲(chǔ)痰之器，咳嗽不止則中不安，中不安則痰飲續(xù)生，因此，治痰飲應(yīng)先鎮(zhèn)咳，止住咳嗽，溫肺化飲之藥才能更好地發(fā)揮作用。射干作為方中主藥苦寒清熱、解毒化痰[4]。五味子收斂肺氣，用于久咳虛喘，細(xì)辛溫肺化飲[5-7]。本研究對(duì)射干麻黃湯中的次野鳶尾黃素、五味子醇甲、細(xì)辛脂素同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，為射干麻黃湯的質(zhì)量控制提供參考。

1儀器與試劑

高效液相色譜儀SHIMADZU LC-20AT；METTLER AG245十萬(wàn)分之一天平、甲醇、乙腈為色譜純(TEDIA)，水為娃哈哈純凈水；次野鳶尾黃素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，111557-201703)，五味子醇甲對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，110857-201714)，細(xì)辛脂素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，111889-201705)，射干麻黃湯干膏(自制)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為SHIMADZU VP-ODS(250 mm×4.6 mm×5 μm)。流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，0～20 min，35%A～45%A；20～30 min，45%A～50%A；30～30.5 min，50%A～70%A；30.5～45 min，70%A～100%A。檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm，流速1 mL/min，柱溫40 ℃。

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取次野鳶尾黃素對(duì)照品、五味子醇甲對(duì)照品、細(xì)辛脂素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含44 μg次野鳶尾黃素、168.8 μg五味子醇甲、35.2 μg細(xì)辛脂素的混合溶液。

2.3供試品溶液的制備

取約2.50 g射干麻黃湯的干膏粉，加入10 mL甲醇超聲30 min，用甲醇補(bǔ)足減失重量，樣品過(guò)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

2.4陰性樣品溶液的制備

按照最佳工藝制備陰性樣品干膏，樣品1不加射干，樣品2不加五味子，樣品3不加細(xì)辛。按照“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，得陰性1、陰性2、陰性3樣品。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL，注入高效液相色譜儀，得到6組峰面積，以進(jìn)樣量μg為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到次野鳶尾黃素的回歸方程為y=2 045 185.37x+73.39，r=0.999 9，表明次野鳶尾黃素在0.088 0～0.880 0 μg之間具有良好的線性關(guān)系；五味子醇甲的回歸方程為y=326 122x-100.66，r=0.999 9，表明五味子醇甲在0.337 6～3.376 0 μg之間具有良好的線性關(guān)系，細(xì)辛脂素的回歸方程為y=1 403 945.87x+2 329.92，r=1，表明細(xì)辛脂素在0.070 4～0.704 0 μg之間具有良好的線性關(guān)系。

2.5.2精密度考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL/次，連續(xù)進(jìn)樣6次，次野鳶尾黃素峰面積的RSD值為0.09%，五味子醇甲峰面積的RSD值為0.11%，細(xì)辛脂素峰面積的RSD值為0.11%。說(shuō)明儀器精密度良好。

2.5.3重現(xiàn)性考察 取同一批號(hào)樣品6份，按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液。分別精密吸取10μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定次野鳶尾黃素、五味子醇甲、細(xì)辛脂素的含量。次野鳶尾黃素的平均含量為0.022 7%，RSD值為2.62%；五味子醇甲的平均含量為0.071 6%，RSD值為2.21%；細(xì)辛脂素的平均含量為0.018 2%，RSD為0.41%。對(duì)照品、供試品、空白對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖1-圖3。

注：1.次野鳶尾黃素；2.五味子醇甲；3.細(xì)辛脂素

圖1 射干麻黃湯供試品色譜

注：1.次野鳶尾黃素；2.五味子醇甲；3.細(xì)辛脂素

圖2 射干麻黃湯對(duì)照品色譜

圖3 空白對(duì)照溶液色譜

2.5.4加樣回收率考察 取同一批供試品6份，取樣量約1.25 g，精密加入3種對(duì)照品，按照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液。分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，結(jié)果見(jiàn)表1-表3。

表1 次野鳶尾黃素加樣回收率試驗(yàn)

表2 五味子醇甲加樣回收率試驗(yàn)

表3 細(xì)辛脂素加樣回收率試驗(yàn)

根據(jù)加樣試驗(yàn)結(jié)果，次野鳶尾黃素的平均加樣回收率為97.02%，RSD為0.29%，五味子醇甲的平均加樣回收率為96.33%，RSD為0.26%，細(xì)辛脂素的平均加樣回收率為98.43%，RSD為0.31%，說(shuō)明本方法可行。

2.5.5穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h末注入高效液相色譜儀，測(cè)得次野鳶尾黃素的峰面積RSD為2.06%，五味子醇甲峰面積的RSD為1.87%，細(xì)辛脂素峰面積的RSD為0.43%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6樣品測(cè)定

取3批樣品按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，外標(biāo)法計(jì)算含量。見(jiàn)表4。

表4 不同批次射干麻黃湯中次野鳶尾黃素、五味子醇甲、細(xì)辛脂素的含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

3討論

3.1提取條件的考察

3.1.1提取方式的考察 考察了超聲處理(220 V，50 Hz)和加熱回流提取兩種提取方式，在相同的提取時(shí)間內(nèi)，超聲法對(duì)樣品中3種成分的提取效率優(yōu)于回流提取法。

3.1.2提取溶劑的考察 分別使用甲醇、甲醇∶水(8∶2)、乙醇三種溶劑對(duì)等量樣品進(jìn)行超聲處理，在相同的提取時(shí)間內(nèi)，甲醇對(duì)供試品中3種成分的提取效率最優(yōu)。

3.2色譜條件的考察

3.2.1柱溫的考察 分別考察了溫度在30 ℃、35 ℃、40 ℃的指紋圖譜。結(jié)果顯示，當(dāng)柱溫在40 ℃時(shí)樣品中3種成分的峰面積大于其余兩種溫度。

3.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的考察 本次試驗(yàn)對(duì)供試品做了全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)次野鳶尾黃素在204 nm處有最大的紫外吸收，其次是266 nm；五味子醇甲在216 nm處有紫外吸收，其次是252 nm；細(xì)辛脂素在202 nm處有最大的紫外吸收，其次是286 nm和236 nm納米，見(jiàn)圖4-圖6。參照2015年版《中國(guó)藥典》3種成分的最佳波長(zhǎng)在266 nm，250 nm，287 nm，因此，將3個(gè)波長(zhǎng)分別作為測(cè)試波長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)辛脂素在287 nm處峰面積遠(yuǎn)大于其余2個(gè)波長(zhǎng)，而其余2個(gè)成分在3個(gè)波長(zhǎng)峰面積下相差不多，后又發(fā)現(xiàn)細(xì)辛脂素在287 nm處峰形較其余兩個(gè)波長(zhǎng)處尖銳，這表明細(xì)辛脂素在266 nm和250 nm處可能有干擾，因此，最后選擇287 nm作為最佳波長(zhǎng)。

圖4 次野鳶尾黃素的吸收光譜

圖5 五味子醇甲的吸收光譜

圖6 細(xì)辛脂素的吸收光譜

3.2.3 色譜柱考察 筆者考察了3種色譜柱：SHIMADZU-GL WondaCract ODS-2、Agilent Zorbax SB C18、SHIMADZU VP-ODS色譜柱，規(guī)格均為(250 mm×4.6 mm×5 μm)。結(jié)果顯示SHIMADZU VP-ODS色譜柱所顯示的圖譜基線最平穩(wěn)，細(xì)辛脂素峰與其后邊的雜峰分離效果較好，更能穩(wěn)定表達(dá)射干麻黃湯三種成分的含量測(cè)定。

3.3系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn)

將流動(dòng)相系統(tǒng)的初始梯度進(jìn)行微調(diào)，方法1將0～20 min的流動(dòng)相比例變?yōu)?0%～45%，其余條件不變，方法2將0～20 min的流動(dòng)相比例變?yōu)?0%～45%，其余條件不變。結(jié)果顯示，初始梯度微調(diào)后各指標(biāo)均有良好的分離度，且峰面積無(wú)較大差別，表明該方法系統(tǒng)耐用性良好。

3.4陰性樣品實(shí)驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下的3個(gè)供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品1樣品無(wú)次野鳶尾黃素峰顯示，樣品2無(wú)五味子醇甲峰顯示，樣品3無(wú)細(xì)辛脂素峰顯示。由此可見(jiàn)，3種成分可以作為射干麻黃湯的質(zhì)量控制指標(biāo)。

4結(jié)論

本次研究建立了對(duì)射干麻黃湯中的3種成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定的方法，其中，次野鳶尾黃素為黃酮類化合物，五味子醇甲和細(xì)辛脂素為木脂素類化合物[8-10]。3種成分同時(shí)測(cè)定，方法簡(jiǎn)便易行，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、線性、加樣回收率均符合規(guī)定，可以將次野鳶尾黃素、五味子醇甲、細(xì)心脂素作為射干麻黃湯中射干、五味子、細(xì)辛三味藥材質(zhì)量控制的方法。