冷海楠 張玉 徐明儀 王麗媛 付曉玲 崔福星 楊立賓 朱道光

摘要：? 采用L16（45）正交試驗設(shè)計，對影響興安落葉松SSR-PCR 反應(yīng)體系的主要因素（模板DNA、dNTPs、Mg2+、Taq聚合酶濃度及引物濃度）進行了試驗分析，其結(jié)果表明：興安落葉松SSR-PCR體積為20 μL的最佳反應(yīng)體系是模板DNA用量50 ng、正反向引物濃度均為5μmol·L-1、dNTPs濃度為2.5 mmol·L-1、Mg2+的濃度為2.5 mmol·L-1、Taq聚合酶用量為1.0 U、最佳退火溫度為60 ℃。試驗所建立的反應(yīng)體系可進一步用于興安落葉松SSR遺傳圖譜構(gòu)建、多樣性分析、良種選育等方面的研究中。

關(guān)鍵詞：? 興安落葉松;? SSR-PCR;? 正交優(yōu)化試驗

中圖分類號：? ?S 791. 222? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001 - 9499（2020）01 - 0012 - 03

興安落葉松（Larix gmelinii）是松科落葉松屬植物，主要分布在我國的大、小興安嶺地區(qū)，是大興安嶺地區(qū)寒溫帶針葉林的主要建群種[ 1 ]。興安落葉松具有成材快、適應(yīng)能力強、耐寒耐濕等特點，因此對興安落葉松開展研究具有很強的經(jīng)濟及生態(tài)意義。

SSR（Simple sequence repeats）分子標記是一種高效的分子生物學研究手段，憑借其共顯性、多態(tài)性高、檢測方法簡單、準確率高等特點廣泛應(yīng)用于林木遺傳育種、植物遺傳圖譜建立等研究中[ 2 - 6 ]。本研究利用正交設(shè)計試驗對興安落葉松SSR-PCR反應(yīng)體系的各個參數(shù)進行優(yōu)化，得出一套高效、可靠、穩(wěn)定的反應(yīng)體系，為興安落葉松遺傳多樣性、良種選育等相關(guān)應(yīng)用性研究奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料

試驗材料選用大興安嶺地區(qū)呼中國家級自然保護區(qū)（122°42'14″? ?～? 123°18'05″E，51°17'42″? ?～

51°56'31″N）內(nèi)的興安落葉松。將采集的興安落葉松鮮嫩針葉迅速保存于液氮罐中，實驗室保存于-20 ℃冰箱中。

2 試驗方法

2. 1 DNA的提取和檢測

使用天根（TIANGEN）公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒（DP350）進行DNA提取，提取10組DNA作為樣本;提取完成后，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測、核酸蛋白檢測儀進行含量測定。

2. 2 SSR-PCR反應(yīng)體系及程序

以提取得到的興安落葉松DNA為模板，對模板DNA用量、正反向引物濃度、dNTPs濃度、Mg2+的濃度、Taq聚合酶用量5個因素進行正交設(shè)計試驗，每個因素4個水平（表1），2個重復，共32個處理。反應(yīng)程序設(shè)置為：94 ℃預變性，5 min;94 ℃變性，35 s;60 ℃退火35 s;72 ℃延伸 1 min;35個循環(huán);72 ℃再延伸7 min;瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2. 3 反應(yīng)體系驗證

以不同樣本提取的DNA為模板DNA進行PCR試驗，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，以檢驗反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

表1 興安落葉松反應(yīng)體系的正交設(shè)計試驗L16（45）

3 結(jié)果與分析

3. 1 核酸檢測

由總DNA提取電泳（圖1）可知：電泳條帶清晰明亮，無異物滯留在點樣孔。核酸蛋白檢測儀測定DNA的OD260/OD280值為2.0～2.5，濃度為150～? 240 ng/μL。由此可見，獲得的DNA樣本純度高，幾乎不含雜質(zhì)，適合試驗使用。

圖1 總DNA提取電泳

3. 2 正交設(shè)計試驗結(jié)果

從SSR-PCR正交試驗結(jié)果（圖2）可以看出：不同因素、不同濃度組合所產(chǎn)生的擴增結(jié)果有明顯差異。試驗1、5、6、15的擴增條帶顯示不明顯，其余12組都能擴增出清晰的條帶，其中第14組在兩次重復試驗中都表現(xiàn)出主帶明顯、條帶清晰的特征，可以確定為最優(yōu)體系。

興安落葉松SSR-PCR體積為20 μL的最佳反應(yīng)體系是：模板DNA用量50 ng、正反向引物濃度均為5μmol·L-1、dNTPs濃度為2.5 mmol·L-1、Mg2+的濃度為2.5 mmol·L-1、Taq聚合酶用量為1.0 U。

3. 3 反應(yīng)體系驗證結(jié)果

以提取10組興安落葉松樣本DNA作為模板，利用優(yōu)化獲得的反應(yīng)體系進行SSR-PCR擴增（圖3）得到了清晰的擴增條帶。說明獲得的反應(yīng)體系穩(wěn)定性高，可以用于日后的遺傳多樣性及分子育種研究。

圖3 10個興安落葉松樣本的SSR-PCR擴增結(jié)果

4 結(jié)論與討論

4. 1 在植物遺傳多樣性及林木遺傳育種研究中，建立和優(yōu)化出一套高效、穩(wěn)定、可靠的SSR-PCR反應(yīng)體系是SSR分子標記應(yīng)用的基礎(chǔ)[ 8 - 9 ]。近年來，分子生物學手段被廣泛用于生態(tài)學的研究中，因此興安落葉松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立不僅是研究興安落葉松遺傳多樣性的研究基礎(chǔ)，也將為分子生態(tài)學的研究奠定基礎(chǔ)。

4. 2 本研究獲得的最佳反應(yīng)體系與其余松科植物相比，在DNA模板用量、dNTPs、Mg2+的濃度上雖然有差異，但差異并不大，而在引物濃度、Taq酶用量上卻有比較大的差異[ 10 - 15 ]。這說明在整個SSR-PCR反應(yīng)體系中，影響最終擴增結(jié)果的是多因素共同作用的結(jié)果。同科屬樹種由于是多個因子影響最佳反應(yīng)體系，因此同科屬樹種的最佳反應(yīng)體系多是不同的。

4. 3 本研究利用正交試驗獲得了興安落葉松的最佳反應(yīng)體系，為興安落葉松遺傳結(jié)構(gòu)的分析、林木遺傳育種研究以及分子生態(tài)學研究奠定了基礎(chǔ)。

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第1作者簡介：? 冷海楠（1983-），? 男，? 助理研究員，? 在讀博士，? 從事分子生態(tài)學研究。

收稿日期： 2019 - 11 - 01

（責任編輯：? ?李 丹）

Optimization of SSR-PCR Reaction System for Larix gmelinii

LENG Hainan

（ Institute of Natural Resources and Ecology， HAS. National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation，? Heilongjiang Harbin 150040）

Abstract The important basis of the researches on SSR marker assisting selective breeding of Larix gmelinii is to establish an SSR-PCR reaction system and get some polymorphism primers. In order to lay a foundation for the researches on applying SSR marker technology to establishment of genetic diversity and molecular breeding， some main impact factors in the Larix gmelinii SSR-PCR reaction system were analyzed by using combination method of L16（45） orthogonal test and single factor tests， including DNA templates，primer， dNTPs， Mg2+， Taq polymerase， and annealing temperature. The results showed that the optimized PCR reaction mixture was 20 μL total volume including 50ng template DNA， 5 μmol/L forward and reverse primers， 2.5 mmol/L dNTPs， 2.5 mmol/L Mg2+ and 1.0 U Taq DNA polymerase， and the optimum annealing temperature was 60℃. This result indicated that the optimized SSR-PCR reaction system could provide a vital theoretic and technical support for genetic maps establishment and molecular marker assisted breeding in Larix gmelinii.

Key words Larix gmelinii;? SSR-PCR;? Orthogonal optimization test