許有燊 陳釗 李霞 李健

摘 要：為了篩選可高效降解養(yǎng)殖廢物的菌株，分析其生長特性，從對蝦工廠化養(yǎng)殖水體中分離出1株芽孢桿菌（Bacillus sp. Strain YS-1），研究了環(huán)境因子對其生長的影響。結(jié)果表明，芽孢桿菌適宜生長條件為：pH6.5?8.5，溫度25?37℃，鹽度5～15‰，轉(zhuǎn)速240r/min，葡萄糖濃度0～0.2mg/L，[NH+4]濃度0～2mg/L。最佳培養(yǎng)參數(shù)為：溫度32.9℃，鹽度14‰，pH6.9。擬合多元二次回歸模型具有顯著性（P<0.05），失擬檢測結(jié)果不顯著（P>0.05），決定系數(shù)R2=0.9492，校正系數(shù)Adj R2=0.8838，方程擬合效果良好。

關(guān)鍵詞：對蝦工廠化養(yǎng)殖;芽孢桿菌;生長;理化因子;響應(yīng)面模型

中圖分類號 S917.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）05-0041-07

Screening and Optimization of Culture Conditions of Bacillus sp. Strains

Xu Youshen1，2 et al.

（1Dalian Ocean University， Dalian? 116023， China; 2Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China）

Abstract： In order to screen strains that can efficiently degrade aquaculture wastes and analyze their growth characteristics， a strain of Bacillus sp. Strain was isolated from shrimp farmed water， and the effects of environmental factors on its growth were studied. Through single-factor physical and chemical factor experiments， it was found that the optimal growth condition of Bacillus sp. Strain YS-1 is： pH 6.5?8.5， temperature 25?37℃， salinity 5?15‰， speed 240r/min， glucose concentration0～0.2mg/L， NH4+0～2mg/L. The optimal culture parameters of the bacteria were： the temperature 32.9℃， the salinity 14‰，and the pH 6.9.The fitted multivariate quadratic regression model was significant（P<0.05）， and the results of misfit detection were not significant（P>0.05）. The determination coefficient R2 = 0.9492 and the correction coefficient Adj R2=0.8838. The equation fitting effect was better.

Key words： Factory shrimp farming; Bacillus sp.; Growth; Physicochemical factor; Response surface model

水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化的快速發(fā)展，提升了養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，但養(yǎng)殖系統(tǒng)中過高的污染物負(fù)荷使得養(yǎng)殖水環(huán)境管控面臨巨大挑戰(zhàn)，特別是殘餌糞便、可溶性有機(jī)物、氨氮和亞硝酸鹽超標(biāo)等污染問題。養(yǎng)殖水體污染不僅會影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的健康與生長，同時養(yǎng)殖廢水直接排放將導(dǎo)致近岸水域的富營養(yǎng)化，破壞周邊的生態(tài)環(huán)境，這嚴(yán)重阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。據(jù)報道，在高密度養(yǎng)殖水體中化學(xué)需氧量（Chemical oxygen demand，COD）可達(dá)40mg/L以上，氨氮與亞硝酸鹽含量可達(dá)10mg/L以上[2-4]。

根據(jù)我國《海水養(yǎng)殖排放水要求》規(guī)定養(yǎng)殖廢水排放至少需要達(dá)到二級排放水要求，即COD不得超過20mg/L，無機(jī)氮含量不得超過1mg/L[5]。為了達(dá)到養(yǎng)殖廢水排放標(biāo)準(zhǔn)，養(yǎng)殖水體在排放前必須經(jīng)過一定凈化處理，微生物處理是其中高效且經(jīng)濟(jì)的一種方法。

關(guān)于益生菌對養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物、氨氮和亞硝酸鹽降解的研究此前多有報道，芽孢桿菌是其中常用的細(xì)菌。李永芹等[6]將刺參底泥中分離出來的枯草芽孢桿菌，再應(yīng)用于養(yǎng)殖水體，其氨氮降解率達(dá)到81.9%。孟睿等[7]用芽孢桿菌處理羅非魚養(yǎng)殖廢水，6d后COD和亞硝酸鹽降解率分別為50.32%和99.15%;祁自忠等[8]利用枯草芽孢桿菌處理模擬養(yǎng)殖廢水，48h內(nèi)COD濃度降解率為55.73%。在養(yǎng)殖系統(tǒng)中加入芽孢桿菌可以有效去除廢水中的有機(jī)物、無機(jī)氮等污染物，維持養(yǎng)殖水體微生態(tài)的平衡。所以篩選出適應(yīng)對蝦工廠化養(yǎng)殖環(huán)境的芽孢桿菌菌株具有重要意義。

微生物生長有其最適條件，而微生物生長最適條件往往與養(yǎng)殖環(huán)境存在一定沖突。為了縮小養(yǎng)殖環(huán)境與益生菌適宜生長條件間的差距，更好的發(fā)揮益生菌在水環(huán)境調(diào)控中的作用，本實(shí)驗(yàn)開展了菌株適宜生長條件的研究，為菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1 菌株的分離與篩選 芽孢桿菌分離樣品來自海陽市黃海水產(chǎn)有限公司對蝦工廠化養(yǎng)殖水體，將對蝦工廠化養(yǎng)殖水樣以1∶5的比例接種到富集培養(yǎng)基內(nèi)，30℃培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)好的菌懸液置于80℃水浴鍋中加熱20min，篩選芽孢桿菌。將處理過的菌懸液10倍梯度稀釋，吸取不同濃度的稀釋液，涂布于LB營養(yǎng)瓊脂的平板上，30℃培養(yǎng)36～48h。菌落長出后，根據(jù)其培養(yǎng)基上外觀形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，分離純化3代后獲得單一菌株，命名為YS-1菌株。將處于對數(shù)生長期的菌懸液與50%甘油1∶1混合，放入-80℃冰箱保存。

1.1.2 菌株鑒定 將純化后的菌懸液置于90℃水浴鍋中加熱10min，再冰浴10min，以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放其DNA模板。利用16S rRNA基因通用引物，正向引物為27F，反向引物為1492R建立如下反應(yīng)體系（20μl）：MIX（10μl）、無菌水（6μl）、上下游引物（各1μl）、模板（1μl）、酶（0.1μl）。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃10min，（95℃變性30s，55℃40s，72℃1min）×35循環(huán)，72℃延伸7min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序，將所獲序列在NCBI中進(jìn)行Blastn同源序列比較，鑒定菌株。

1.1.3 單因素實(shí)驗(yàn) 從-80℃冰箱中取出保藏的菌種，以1%接種量接種到100mL TSB液體培養(yǎng)基中，30℃、120r/min培養(yǎng)12h以活化菌種。將活化好的菌懸液，用無菌水10倍梯度稀釋，涂布于LB營養(yǎng)瓊脂的平板上，同時做3組重復(fù)，置于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)菌落個數(shù)。細(xì)菌培養(yǎng)液光密度值（OD600nm）采用IMARK型酶標(biāo)儀（日本伯樂）測定，溶液酸堿度采用意大利哈納HANNA HI98103型筆式酸度計(jì)完成，接種實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺內(nèi)完成。

選取溫度、鹽度、pH、轉(zhuǎn)速、碳源和氮源6個環(huán)境因子做單因素實(shí)驗(yàn)，每個因子設(shè)計(jì)5個梯度，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)。將活化后菌懸液，以1%接種量接種到100mL培養(yǎng)基中。單因素實(shí)驗(yàn)中，控制其余條件與菌種活化條件相同。其中溫度、鹽度、轉(zhuǎn)速、pH單因素實(shí)驗(yàn)使用TSB培養(yǎng)基，碳源和氮源單因素實(shí)驗(yàn)使用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、pH7.0～7.5。葡萄糖、蛋白胨、NH4CL、NaCl、MgSO4·7H2O和其他化學(xué)試劑皆為分析純，其中蛋白胨為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，余者皆購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。富集培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），由北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。LB營養(yǎng)瓊脂由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

pH：采用1mol/L的NaOH和HCL調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)液的酸堿度，設(shè)置5.5、6.5、7.5、8.5、9.5共5個梯度，接種后，30℃、120r/min下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;溫度：設(shè)置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃共5個梯度，接種后，120r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;鹽度：向TSB培養(yǎng)基中添加NaCl調(diào)整鹽度為5、15、25、35、45共5個梯度，接種后，30℃、120r/min下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;轉(zhuǎn)速：設(shè)置80r/min、120r/min、160r/min、200r/min、240r/min共5個梯度，接種后，30℃下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;碳源：采用10mg/L的葡萄糖溶液配制基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置葡萄糖梯度0、0.01、0.1、0.2、0.5mg/L，接種后，37℃、160r/min下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度;氮源：以氨氮替換培養(yǎng)基中蛋白胨，采用10mg/L的NH4Cl溶液配制基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置氨氮梯度0、0.5、1、2、5mg/L接種后，37℃、160r/min下培養(yǎng)，每隔1h取樣，600nm下測定吸光度。

1.1.4 響應(yīng)面分析 選擇在實(shí)際生產(chǎn)中影響較大的溫度、鹽度、pH 3個因素，依據(jù)RSM中Box Behnken中心組合原則，采用Design Expert10.0軟件進(jìn)行分析。然后選用分析所得的最佳生長復(fù)合參數(shù)培養(yǎng)，并測定培養(yǎng)12h后培養(yǎng)液的OD600值（n=3）以證實(shí)該方法的可靠性。

1.2 數(shù)據(jù)處理 采用單因素方差分析（One-way ANOVA）法判斷單因素不同濃度處理組之間的差異，統(tǒng)計(jì)分析通過Excel 2016和SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件實(shí)現(xiàn)，差異顯著水平為P<0.05。實(shí)驗(yàn)采用Design Expert 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對溫度、鹽度和pH與芽孢桿菌生長響應(yīng)值進(jìn)行二次方程回歸擬合，建立數(shù)學(xué)模型，用決定系數(shù)和回歸方程的校正系數(shù)來判斷數(shù)學(xué)模型的擬合程度，多變量方差分析決定方程的意義[9]。優(yōu)化得到的實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3次，以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離與篩選 樣品接種于芽孢桿菌富集培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，加熱處理后經(jīng)分離、純化得到菌株。將菌株擴(kuò)增培養(yǎng)后，涂在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。該菌株單菌落呈灰白色、外形不規(guī)則、菌落邊緣不整齊、表面皺褶較粗糙。

以該菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得大小約1500bp的16S rRNA基因。經(jīng)Blastn同源序列比較，表明YS-1菌株（MN841924）與Bacillus sp.相似度較高，且與登陸號為MH518191的Bacillus sp.菌株親緣關(guān)系最近。MH518191，MK578252，KY621529與該菌株的16S rRNA基因的序列同源性超過99%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，在細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上，可初步將該菌株歸屬芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 pH對芽孢桿菌生長的影響 由圖2可知，YS-1菌株在pH為6.5～8.5范圍內(nèi)生長良好，4h后開始顯著生長，進(jìn)入對數(shù)生長期，7h后菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期，其中pH為7.5的實(shí)驗(yàn)組菌株生長最佳，5h后OD600值顯著高于其它組（P<0.05），8h后OD600值穩(wěn)定在0.8～0.85范圍內(nèi)。pH為6.5和8.5的實(shí)驗(yàn)組菌株也可生長，8h后OD600值穩(wěn)定在0.69～0.73范圍內(nèi)。pH為5.5和9.5的實(shí)驗(yàn)組OD600值實(shí)驗(yàn)過程中無顯著變化，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下菌株無法生長。

2.1.2 溫度（T）對芽孢桿菌生長的影響 由圖3可知，YS-1菌株在溫度為30℃～37℃范圍內(nèi)生長良好，2h后開始顯著生長，進(jìn)入對數(shù)生長期，7h后菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期，其中溫度為37℃的實(shí)驗(yàn)組菌株生長最佳，2h后OD600值顯著高于其它組（P<0.05），8h OD600值達(dá)到峰值0.89，8～12h內(nèi)37℃組菌體的OD600值逐漸下降，到12h降至0.82。溫度為30℃的實(shí)驗(yàn)組菌株，2h后開始顯著生長，進(jìn)入對數(shù)生長期，8h后OD600值穩(wěn)定在0.84～0.86范圍內(nèi)。溫度為25℃的實(shí)驗(yàn)組菌株，4h后開始顯著生長，進(jìn)入對數(shù)生長期，11h后OD600值穩(wěn)定在0.91～0.93范圍內(nèi)。溫度為15℃和20℃的實(shí)驗(yàn)組OD600值實(shí)驗(yàn)過程中無顯著變化，低溫條件下菌株無法生長。

2.1.3 鹽度（S）對芽孢桿菌生長的影響 由圖4可知，芽孢桿菌對鹽度的適應(yīng)范圍很廣，在0～45‰的鹽度范圍內(nèi)均可生長，各組從3h開始逐步進(jìn)入對數(shù)增長期。且鹽度越低菌體的生長速度越快，5h各組之間出現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），鹽度較高時，芽孢桿菌的生長速度受到抑制;8h時5‰組生長速度最快且達(dá)到最大值，菌體的OD600值約為0.84;12h時5‰和15‰組菌體的OD600值均可達(dá)到0.85，與其余各組之間存在顯著性差異（P<0.05）。

2.1.4 轉(zhuǎn)速對芽孢桿菌生長的影響 由圖5可知，芽孢桿菌的生長速度與轉(zhuǎn)速成正相關(guān)，即轉(zhuǎn)速越快芽孢桿菌的生長速度越快。各實(shí)驗(yàn)組從5h開始，逐步進(jìn)入對數(shù)增長期;7h后各實(shí)驗(yàn)組之間產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05），且轉(zhuǎn)速越快菌體生長速度越快，240r/min下生長速度最快菌體的7h OD600值達(dá)到0.9;至12h各組之間差異極顯著（P<0.01），轉(zhuǎn)速為240r/min時菌株生長速度最快，12h菌株的OD600約為1.30。

2.1.5 碳源對芽孢桿菌生長的影響 由圖6可知，YS-1菌株在葡萄糖濃度為0～0.2mg/L范圍內(nèi)生長良好，12h持續(xù)增長，12h后OD600值穩(wěn)定在0.65～0.68范圍內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組之間不存在顯著差異（P>0.05）。葡萄糖濃度為0.5mg/L的實(shí)驗(yàn)組菌株前期生長迅速，2h菌體的OD600值顯著高于其它各組（P<0.05），但之后生長速度逐漸減慢，3～7h與其余各組之間差異不顯著（P>0.05），8h后菌體的OD600值顯著低于其它各組（P<0.05），OD600值穩(wěn)定在0.40～0.43范圍內(nèi)。當(dāng)葡萄糖濃度過高時，會對芽孢桿菌的生長起到抑制作用。

2.1.6 氨氮對芽孢桿菌生長的影響 由圖7可知，YS-1菌株在NH4+濃度為0～2mg/L范圍內(nèi)可以生長，12h持續(xù)增長，12h后OD600值穩(wěn)定在0.12～0.13范圍內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組之間不存在顯著差異（P>0.05）。NH4+濃度為5mg/L的實(shí)驗(yàn)組OD600值實(shí)驗(yàn)過程中無顯著變化，與其余各組存在顯著性差異（P<0.05），高濃度NH4+條件下菌株無法生長。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇合適的參數(shù)范圍進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)，其與結(jié)果見表1。利用Design expert 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到芽孢桿菌培養(yǎng)8h后的OD600值與x（溫度）、x1（鹽度）、x2（pH）之間的二元回歸方程為：

OD600=1.08-4.900E-003x+0.0496x1-0.064x2+5.550E-003xx1+0.0735xx2-0.0411x1x2-0.13x2-0.046x12-0.089x22

對該模型進(jìn)行方差分析見表2，結(jié)果表明，基于OD600值所建立的回歸模型是顯著的（P<0.05），失擬檢測結(jié)果不顯著（P>0.05），通過失擬檢測，擬合方程有效。決定系數(shù)R2=0.9492，校正系數(shù)Adj R2=0.8838，擬合方程滿足有效要求。

表3為回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果。由表3可以看出，鹽度和pH的一次效應(yīng)對芽孢桿菌的生長影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01），但溫度的一次效應(yīng)對其生長影響不顯著（P>0.05）;溫度、鹽度和pH的二次效應(yīng)對芽孢桿菌的生長影響都達(dá)到顯著水平（P<0.05）;溫度和pH之間的交互作用對特定生長率的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

2.2.2 菌體生長條件的優(yōu)化 利用Design-Expert軟件對表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖8。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示2個因素交互作用不顯著，橢圓形表示2個因素交互作用顯著[12]。從圖8可以直觀看出，溫度和鹽度、溫度和pH以及鹽度和pH對芽孢桿菌生長的交互作用顯著。且x、x1、x2都存在極值點(diǎn)，利用Design-Expert軟件對代表菌體濃度的OD600值的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型解逆矩陣得知，3個因素的最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)（x、x1、x2）代碼值（6.88、14.06、32.87），此時Y取最大值1.12。以響應(yīng)面分析得到的芽孢桿菌最佳生長條件，做3次平行試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果為1.18與預(yù)測相符，響應(yīng)面分析方法可靠。

3 討論與結(jié)論

對蝦工廠化養(yǎng)殖具有更高的養(yǎng)殖密度，與傳統(tǒng)粗放養(yǎng)殖相比可以提高養(yǎng)殖效率、獲取更多的經(jīng)濟(jì)利益，但這必然伴隨著高餌料投喂和嚴(yán)重的水體污染[10-12]。養(yǎng)殖水環(huán)境迅速惡化，產(chǎn)生的有機(jī)污染物和無機(jī)氮，對養(yǎng)殖生物有毒害作用。目前，使用微生態(tài)制劑已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水環(huán)境的重要手段，不但可以控制病害發(fā)生，還可以減少污染物的排放[13]。但隨著微生態(tài)制劑使用規(guī)模不斷擴(kuò)大，微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖環(huán)境缺少針對性的問題也逐步暴露出來，所以本研究以對蝦工廠化養(yǎng)殖水體為樣品來源，篩選出1株可適用于對蝦工廠化養(yǎng)殖的芽孢桿菌YS-1，并根據(jù)16sRNA基因測序，將該菌鑒定為芽孢桿菌。

生物學(xué)特性研究表明，源自對蝦工廠化養(yǎng)殖池的芽孢桿菌 YS-1同時對多種理化因子具有廣泛的適應(yīng)性，可見該菌株具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，可用于擴(kuò)大培養(yǎng)與廣泛應(yīng)用。由于菌株YS-1是工廠化對蝦養(yǎng)殖的原生細(xì)菌，當(dāng)作為微生態(tài)制劑應(yīng)用于工廠化環(huán)境時，較其它來源的益生菌具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力、可以更有效改善水質(zhì)。因此，芽孢桿菌YS-1的分離、篩選為對蝦工廠化養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境提供了優(yōu)質(zhì)的原生菌種，對維持養(yǎng)殖水體微生態(tài)平衡具有重大意義。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，芽孢桿菌生長適應(yīng)性較強(qiáng)。YS-1菌株在pH為6.5～8.5均可生長，但綜合多因素條件時，在弱堿條件下生長受抑制，更適宜在弱酸條件下生長。這與之前的研究結(jié)果相吻合，已有研究報告表明[14-16]枯草芽孢桿菌在pH 7～9范圍內(nèi)生長較好，但也有學(xué)者表示[17]枯草芽孢桿菌更適宜在弱酸性條件下培養(yǎng)。YS-1菌株在溫度25?37℃間的范圍條件下都能生長，且溫度越高生長速度越快，但溫度達(dá)到37℃時，OD600呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明菌株在這種溫度下會迅速進(jìn)入衰亡期。這與之前的研究結(jié)果相似，趙達(dá)[18]等研究表明35℃為枯草芽孢桿菌的最適生長溫度。YS-1菌株在5～45‰的鹽度范圍內(nèi)均可生長，在5～15‰的低鹽度條件下生長較快。YS-1菌株在轉(zhuǎn)速為120～240r/min均可生長，且轉(zhuǎn)速越快生長速度越快，芽孢桿菌作為好氧微生物，高轉(zhuǎn)速提供的高溶氧有利于其生長。這與之前的研究結(jié)果不同，趙達(dá)等[18]研究表明搖床轉(zhuǎn)速為180r/min時最適宜芽孢桿菌的生長，隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增加芽孢桿菌的生長受到抑制。

YS-1菌株在葡萄糖濃度0～0.2mg/L范圍內(nèi)可以生長，12h菌體的OD600約為0.65，當(dāng)濃度達(dá)到0.5mg/L時芽孢桿菌生長受到抑制，12h菌體的OD600約為0.40。這與之前的研究結(jié)果不同，高磊等[19]研究表明表明高C/N更有助于異養(yǎng)微生物的生長，所以在養(yǎng)殖過程中加入蔗糖，提高碳氮比。本實(shí)驗(yàn)與其結(jié)果不同原因可能是培養(yǎng)基條件簡單，葡萄糖濃度影響溶液滲透壓抑制了芽孢桿菌的生長。YS-1菌株在NH4+濃度0～2mg/L范圍內(nèi)時，芽孢桿菌可以生長，當(dāng)NH4+濃度達(dá)到5mg/L時，芽孢桿菌無法生長，說明當(dāng)氨氮作為唯一氮源時，高濃度氨氮對芽孢桿菌有抑制作用。具有脂溶性的分子氨易透過膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞死亡[20-21]，所以高濃度的NH4+濃度對芽孢桿菌有抑制作用。

溫度、鹽度、pH、轉(zhuǎn)速及營養(yǎng)物質(zhì)等多種理化因子對芽孢桿菌的生長都具有不同程度的影響，對其進(jìn)行系統(tǒng)研究有助于深入了解芽孢桿菌在對蝦工廠化養(yǎng)殖微生態(tài)系統(tǒng)中的生存生長條件。自20世紀(jì)70年代，科學(xué)界逐漸重視溫度、鹽度和pH這3種因子的作用[22-23]。郝林華等[24]采用單因素分析法研究了溫度、pH和多種營養(yǎng)物質(zhì)對芽孢桿菌生長的影響。而本研究不但分析了這6種因子的單因素作用效果，還選擇3種在實(shí)際養(yǎng)殖中起決定性作用的因素，采用響應(yīng)面分析法建立了多因素復(fù)合作用下芽孢桿菌的生長模型，獲得了該菌的最佳培養(yǎng)參數(shù)。已有研究表明，使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微生物培養(yǎng)條件，可以有效提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。李志華[25]使用響應(yīng)面分析法對谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，有效提高了谷氨酸產(chǎn)量;黃麗金等[26]采用響應(yīng)面分析法對德氏乳桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，產(chǎn)出菌液濃度提高了5倍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芽孢桿菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH 6.88、溫度32.87℃和鹽度14.06‰;此外，二次回歸模型具有顯著性（P<0.05），失擬檢測結(jié)果不顯著（P>0.05），方程通過失擬檢測，表明擬合方程有效。決定系數(shù)R2=0.9492，校正系數(shù)Adj R2=0.8838，說明本實(shí)驗(yàn)所建響應(yīng)面分析是可靠的。響應(yīng)面分析法可以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，同時考慮多因素之間的交互作用，擬合多元二次函數(shù)，直接反映因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系[27]。因此，新方法更直觀的預(yù)測對蝦工廠化養(yǎng)殖中環(huán)境因子的改變對芽孢桿菌生長動力學(xué)的影響。

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（責(zé)編：張 麗）