牛繼敏 牛金中 黃瑜 劉鑫潮 簡紀常 魯義善

摘 要：Galectin-8屬于S型凝集素，是一種內(nèi)源性凝集素，具有高親力，含β-半乳糖苷，可識別重要的病原分子[1]。該蛋白質有2個功能結構域，均提供該家族中其他蛋白質類似的保守序列[2]。該研究基于尼羅羅非魚Galectin-8 NCBI上發(fā)表的基因序列，利用primer5.0設計1對引物，構建尼羅羅非魚Galectin-8基因的原核表達載體，將重組后的質粒pGEX-4T-1-Galectin-8導入大腸桿菌中，通過PCR、連接、轉化等，進行原核表達。對影響因素進行條件優(yōu)化，使用優(yōu)化后的濃度、時間、溫度條件表達Galectin-8重組蛋白能得到最優(yōu)表達量。Western blot檢測純化后的重組蛋白，結果顯示，重組蛋白可以很好地結合GST-Tag標簽的單克隆抗體，實驗進一步證明羅非魚Galectin-8的重組蛋白被成功表達，為羅非魚Galectin-8后續(xù)相關功能的研究奠定了基礎。

關鍵詞：尼羅羅非魚;Galectin-8;原核表達;Western blotting;條件優(yōu)化

中圖分類號 S917.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2020）05-0006-04

Prokaryotic Expression and Condition Optimization of Galectin-8 Gene in Nile Tilapia

Niu Jimin1 et al.

（Fisheries College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China）

Abstract： Galectin-8 belongs to S-type lectin， an endogenous lectin with high affinity and β-galactoside， which are important in the recognition of pathogenic molecules[1]. The protein has two functional domains that provide similar conserved sequences to other proteins in the family[2]. Primer5.0 software was used to design a pair of primers based on the Nile tilapia Galectin-8 gene sequence published on NCBI to construct the prokaryotic expression vector of the tilapia Galectin-8 gene. The recombinant plasmid ie pGEX-4T-1 -Galectin-8 was constructed and introduced into E. coli for prokaryotic expression by PCR， ligation， and transformation. Optimal conditions of factors affecting the expression of Galectin-8 recombinant protein in terms of concentration， time， and temperature were provided. The purified recombinant protein was able to specifically bind to the GST-Tag monoclonal antibody detected by Western blot which proved the successful expression of Galectin-8 recombinant protein of tilapia. This result provides the fundamentals to the study of subsequent related functions of tilapia Galectin-8.

Key words： Oreochromis niloticus; Galectin-8; Prokaryotic expression; Western blotting; Condition optimization

凝集素（lectins）是脂質復合物上的一種非共價結合蛋白或糖蛋白，可選擇識別糖結構[3-4]。半乳糖凝集素（galectin）是凝集素中的1個家族，參與免疫應答過程，在其他方面也發(fā)揮著重要作用，可以分為3個亞型：原型[5-6]、嵌合體型和串聯(lián)重復型[7-11]。

Galectin-8是1個891bp的開放閱讀框（ORF），編碼296個氨基酸的蛋白質（33kD）。系統(tǒng)進化樹分析表明該蛋白質與來自其他動物物種的半乳糖凝集素8類似，并與鮭魚半乳糖凝集素8具有至少56.8%的同源性。在結構上，氨基酸序列包括分別為135和133個氨基酸的不同的2個N-和C-末端碳水化合物識別結構域（CRD），通過39個氨基酸的多肽接頭連接[7，8，12]，N-和C-CRD含有2個保守的WG-EI和WG-ET基序，表明它們在介導Galectin-8和糖部分如β-半乳糖苷之間的特異性相互作用中具有重要作用[13-15]。

尼羅羅非魚屬熱帶性魚類，生長快、繁殖力強、病害少、抗病性強等特點，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推廣養(yǎng)殖的魚類物種之一[16]。廣東沿海一帶羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量居全國首位。隨著養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖環(huán)境變得惡化，一些疾病相應增多[17]，細菌性疾病，無乳鏈球菌就是其中之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[18-21]。目前羅非魚免疫系統(tǒng)的研究處于初級階段，本研究基于Galectin-8基因在NCBI上的全長序列設計引物，克隆Galectin-8的ORF區(qū)，構建原核表達載體并優(yōu)化表達條件，為羅非魚Galectins的后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗用羅非魚由湛江附近漁場購買，克隆的載體pMD18-T、T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶 BamHI和 XHOI、ExTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，原核表達的載體pGEX-4T（+）Vector和大腸桿菌的表達菌株由本實驗室保存。

總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;引物合成、氨芐西林（Amp+）、IPTG購自上海生工公司;考馬斯亮藍染液、一抗、二抗購自碧云天生物有限公司;提取質粒和凝膠回收試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅非魚Galectin-8基因的擴增 羅非魚頭腎組織中的總RNA提取按試劑盒說明書進行操作，成功提取RNA后用瓊脂糖凝膠檢測其質量，按說明書逆轉錄合成第1條鏈，根據(jù)NCBI上公布的尼羅羅非魚Galectin-8的基因序列（LOC100696357），以cDNA為模板，設計1對引物的在其5′端加上BamHI和XhoI位點，PF：5-CGCGGATCC ATGTCCGTGGCTAAC-3（BamHI）PR：5-GGCGAGCTCTCACCACAGCTTGATGTC-3（XhoI），以羅非魚頭腎組織cDNA單鏈為PCR擴增模板，反應體系參照牛金中等[23]，進行PCR擴增。目的條帶用瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照觀察條帶大小。目的條帶正確后進行純化回收，將其產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉化至感受態(tài)細胞DH5α中，涂板挑單克隆菌落篩選，結合PCR鑒定是否正確。選擇pMD18-T上的通用引物M13/RV鑒定。將陽性克隆送至上海生工測序。序列測序正確的pMD-18-Galectin-8重組質粒和原核表達載體pGEX-4T，提取其質粒，用之前設計的BamHI和XhoI2種快切酶進行酶切，產(chǎn)物切膠回收，16℃、T4 DNA連接酶過夜連接，次日轉化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中。轉化后，用LB平板（含氨芐（Amp+）抗性）挑選單菌落結合菌落PCR鑒定，陽性克隆送生物公司測序。

命名測序正確的重組質粒為pGEX-4T-1-Galectin-8。在新鮮的含Amp+LB培養(yǎng)基中接種陽性菌株以及空載質粒pGEX-4T的菌株其比例為1∶100左右，37℃振搖培養(yǎng)，至對數(shù)生長期，OD600達到0.4～0.6，IPTG濃度加0.2mmol/L的，誘導2h，對菌液收集，對目的蛋白使用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.2 重組蛋白Galectin-8條件優(yōu)化 （1）在不同濃度的IPTG誘導條件下，將濃度梯度設為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和2.0mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng)3h后，目的蛋白的表達量用聚丙烯酰胺凝膠檢測。（2）不同時間的IPTG誘導條件，IPTG濃度為0.6mmol/L，分別誘導1、2、3、4、5、6、7和8h之后收集樣品，SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達量;（3）利用上述優(yōu)化的表達時間，誘導溫度，IPTG誘導濃度，對目的蛋白進行誘導表達，然后對表達菌株收集離心，用PBS洗滌重懸超聲破碎。使用超聲波細胞粉碎儀對目的蛋白破碎：功率160w，破碎6s，間隔8s，破碎時間為8min，菌液變清撤后4℃離心。成功得到全菌蛋白后，按GST的說明書純化GST標簽的目的蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.3 Western-blot鑒定分析 在最佳誘導條件下，收集純化重組蛋白。SDS-PAGE電泳后轉到PVDF膜上Western blot分析。具體步驟：室溫封閉液封閉PVDF膜1h;加入鼠抗GST-Tag單克隆抗體（1∶2500稀釋）的一抗，孵育2h;用TBST洗脫膜，在搖床洗脫3次，每次15min;加入HRP山羊抗鼠IgG（1∶4000稀釋）的二抗，室溫震蕩1h;用TBST洗脫膜，在搖床洗脫3次，每次15min;充分清洗后，滴加配制新鮮的DAB顯色溶液，待有清晰的條帶出現(xiàn)后，用蒸餾水立即終止反應，觀察目的蛋白條帶的大小，結果拍照保存。

2 結果與分析

2.1 Galectin-8基因的擴增及鑒定 顯示PCR擴增后在891bp處有明顯的條帶。pMD-18T載體與目的片段相連，PCR擴增用載體上的引物M13和RV，其產(chǎn)物片段約為1046bp，與預期一致。因此，所選菌落為陽性克隆，說明獲得的目的條帶為Galectin-8基因。

2.2 構建Galectin-8原核表達載體 重組Galectin-8的質粒BamHI和XhoI酶切，在891bp處有1條大小接近的條帶，與pGEX-4T載體在4969bp處有1條大小一致的條帶，且插入的片段測序比對后同樣顯示是Galectin-8，表明pGEX-4T-Galectin-8被成功構建成原核表達載體。

2.3 大腸桿菌的誘導表達 只有誘導的菌株在59kD的位置有條帶，未誘導的對照組則無此條帶。GST標簽的PGEX-4T-1空載體大小是26kD，而Galectin-8預測的蛋白分子量為33kD，重組后的蛋白大小為59kD，該分子量與實驗結果一致，從而證明重組Galectin-8蛋白表達成功。

2.4 大腸桿菌誘導表達條件優(yōu)化

2.4.1 IPTG最佳誘導濃度和時間 結果顯示，在IPTG濃度為0.2mmol/L時，目的蛋白表達量最有效，因此，得出最佳IPTG誘導濃度為0.2mmol/L。當溫度和濃度條件一致時，蛋白表達量在1～2h時目的在明顯增加，2h后并無明顯變化，說明2h是最佳誘導時間。

2.4.2 最佳誘導溫度 在其他條件不變的情況下，25℃和37℃誘導，收集菌液對蛋白破碎，用SDS-PAGE凝膠電泳檢測。結果證明，在37℃和25℃條件下，目的蛋白都存在。

2.4.3 目的蛋白的純化和鑒定 在IPTG濃度為0.2mmol/L，4h，37℃條件下，收集菌液純化目的蛋白，SDS-PAGE檢測分析。結果顯示：純化后的目的蛋白條帶單一。Western blot顯示，重組蛋白純化后能特異性結合GST-Tag單克隆抗體，說明羅非魚Galectin-8帶重組蛋白表達成功。

3 討論

本研究以大腸桿菌為表達系統(tǒng)對羅非魚Galectin-8進行原核表達，這是蛋白表達最常使用的表達系統(tǒng)。大腸桿菌在實驗過程中也會影響到蛋白的表達量，所以在優(yōu)化培養(yǎng)中PH可以適當提高避免抑制蛋白表達。氧氣要充足，搖菌時注意容器中菌液量不能太多，對數(shù)生長期時能提高重組蛋白的表達量，IPTG的濃度、時間、溫度對其表達量影響也很大。本試驗主要對IPTG的濃度、時間、溫度進行條件優(yōu)化[23-24]。在37℃，2h且IPTG濃度為0.2mmol/時目的蛋白表達量處于最佳，濃度過高有時會抑制目的蛋白的表達[25]。當溫度在25℃時，目的蛋白比37℃時的表達量明顯減少，因此本研究得出溫度對蛋白表達及其重要。用優(yōu)化后的條件表達Galectin-8重組蛋白，純化目的蛋白使用GST鎳柱，Western blot檢測其分子量，證明無論是重組蛋白的全菌蛋白還是純化后的重組蛋白，均與GST標簽的單克隆抗體有效結合，且目的條帶單一，進一步說明表達的重組蛋白是Galectin-8。

本試驗在最佳誘導條件下成功構建尼羅羅非魚Galectin-8的原核表達，且Galectin-8重組蛋白的表達量最大。純化后的Galectin-8重組蛋白，為后續(xù)制備羅非魚Galectin-8的抗體及其它方面的功能研究奠定最重要的一步。

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（責編：張 麗）