馬志強(qiáng)，王 霖，羅 煜，瞿春燕，李保萍，馬云珊，董 睿，吳艷蓉，趙金花，許婭琳

（1）昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；2）關(guān)懷科，云南昆明 650301）

2019 年12 月，湖北省武漢市部分醫(yī)院及醫(yī)療機(jī)構(gòu)陸續(xù)報道新型冠狀病毒感染的肺炎病例[1-2]，隨著新增病例的大量增加，疫情迅速在中國各地蔓延開來并波及全球20 多個國家和地區(qū)[3-5]。經(jīng)研究，其基因特征與SARSr-CoV 和MERSr-CoV 有明顯區(qū)別，但與蝙蝠 SARS 樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性達(dá)85%以上[6-7]。新型冠狀病毒由單一的核糖核酸（RNA）構(gòu)成，屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形。新冠肺炎的傳播途徑以經(jīng)呼吸道飛沫和接觸傳播為主，同時有證據(jù)顯示COVID-19 亦可通過氣溶膠和消化道傳播，且有人群普遍易感的特點(diǎn)。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳等，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、腹瀉等癥狀，但也可隱匿發(fā)病[8]。新冠肺炎確診主要通過實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（revers etranscriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒基因測序。RT-PCR 特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速經(jīng)濟(jì)以及應(yīng)用簡便，在COVID-19患者的診治評估中具有重要意義?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝自\療方案（試行第五版）》將COVID-19 感染核酸確診檢測的生物標(biāo)本定為呼吸道標(biāo)本[9]。因此核酸檢測標(biāo)本主要集中在咽拭子和痰等標(biāo)本上，但是對COVID-19 患者其他類型標(biāo)本如糞便的核酸檢測結(jié)果缺少相關(guān)的報道，據(jù)此本研究旨在利用RT-PCR 的方法檢測新冠肺炎患者糞便標(biāo)本的帶毒情況，初步闡明COVID-19 感染后在患者體內(nèi)的分布特點(diǎn)及其臨床意義，為新冠肺炎的診斷和分析傳播途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究收集昆明市第三人民醫(yī)院自2020 年1月30 日至2020 年3 月10 日收治的COVID-19 確診病例的糞便標(biāo)本用于核酸檢測，昆明市第三人民醫(yī)院為云南省COVID-19 定點(diǎn)收治醫(yī)院，也是云南省衛(wèi)健委第一批確認(rèn)開展COVID-19 核酸檢測的實(shí)驗(yàn)室，在此期間共收治了39 例確診病例，所有生物標(biāo)本均嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)流程密封轉(zhuǎn)運(yùn)至本院檢驗(yàn)科核酸檢測實(shí)驗(yàn)室。COVID-19 診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》[10]，符合相關(guān)臨床表現(xiàn)，及糞便COVID-19 核酸檢測陽性[7-9]。本研究所有病例的個人信息均保密，所有生物標(biāo)本僅用于科學(xué)研究和疫情防控。

本研究共納入COVID-19 確診病例糞便標(biāo)本25 例用于核酸檢測，其中男12 例，女13 例，平均年齡（49.5±17.3）歲。

1.2 儀器和試劑

主要儀器：NP968-C 全自動核酸提取儀（西安天隆科技有限公司），TL988-IV 實(shí)時熒光定量PCR 儀（西安天隆科技有限公司），CFX 96 實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國伯樂科技公司）。相關(guān)試劑：COVID-19 病毒核酸提取試劑盒（EX-DNA/RNA病毒），新冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N 基因核酸檢測試劑盒（天?。?019 新型冠狀病毒（ORF1ab/N 基因）核酸檢測試劑盒（上海伯杰）。

1.3 引物和熒光探針

引物與熒光探針有2 個靶序列，F(xiàn)AM 區(qū)域靶標(biāo)（ORF1ab 基因）。

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA；熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。HEX 區(qū)域靶標(biāo)（N 基因）；正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。

1.4 標(biāo)本處理與檢測

標(biāo)本處理 所有糞便標(biāo)本先經(jīng)過56℃30 min 滅活后，取黃豆大小的大便（1g 左右）于1.5 mL EP管中，加入1 mL 生理鹽水振蕩混勻10 s，3 000 r/min 離心30 s；取200 μL 上清液置于新的EP 管中，12 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入1 mL 生理鹽水混勻，12 000 r/min 離心10 min，取下層沉淀50 μL 加入核酸提取試劑盒提取病毒核酸。

標(biāo)本檢測 依次加入30 μL 預(yù)先配制好的PCR混合液和20 μL 上述處理后的標(biāo)本至PCR 反應(yīng)管，在實(shí)時熒光PCR 儀上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增檢測，結(jié)束后判讀結(jié)果。

1.5 結(jié)果判讀

先觀察內(nèi)標(biāo)在對應(yīng)的通道是否有擴(kuò)增曲線，且擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號需達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所對應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）≤40。以天隆檢測試劑為例，陽性：ORF1ab 和N 基因檢測呈典型的S 型擴(kuò)增曲線，且Ct 值≤37；陰性：無Ct值，內(nèi)標(biāo)通道檢測結(jié)果為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料用率（%）表示；計量資料滿足正態(tài)分布時，采用配對t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同治療階段糞便ORF1ab/N 基因檢測

對COVID-19 確診病例的糞便標(biāo)本分別進(jìn)行病毒ORF1ab/N 基因核酸檢測。結(jié)果顯示，治療中期患者ORF1ab/N基因核酸檢測擴(kuò)增曲線呈S型，治療后期患者ORF1ab/N基因檢測未得到擴(kuò)增曲線，見圖1。

2.2 不同治療階段患者糞便核酸檢測結(jié)果

不同治療階段的確診病例陽性數(shù)為：治療中期12 例，治療后期3 例，陽性率分別為48%、12%，見表1。

圖1 不同治療階段糞便ORF1ab/N 基因擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curve of ORF1ab/N gene in stool at different treatment stages

表1 不同治療階段糞便核酸檢測結(jié)果［n（%）］Tab.1 The stool nucleic acid test results at different treatment stages［n（%）］

2.3 不同治療階段患者糞便核酸檢測CT 值結(jié)果變化

根據(jù)1.4 結(jié)果判讀作依據(jù)分析CT 值，隨著病程和治療時間的推進(jìn)，患者糞便核酸陽性檢出例數(shù)有明顯的減少，同時CT 值總體有升高的趨勢。結(jié)果表明，經(jīng)過抗病毒治療后，患者病毒載量有所降低，抗病毒治療效果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2 不同治療階段糞便核酸檢測CT 值結(jié)果比較（±s）Tab.2 Comparison of CT results of stool nucleic acid tests in different treatment stages（±s）

與治療中期比較，△P＜0.05。

圖2 不同治療階段糞便核酸檢測CT 值的變化Fig.2 The Changes of CT values in stool RT-PCR at different treatment stages

3 討論

新冠肺炎疫情在中國已進(jìn)入最關(guān)鍵的時期，最初有關(guān)COVID-19 的報道認(rèn)為其與早年發(fā)生的SARS 冠狀病毒存在許多相似之處，多數(shù)感染者表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、呼吸困難等，少數(shù)患者以呼吸道癥狀發(fā)病如：流涕、打噴嚏、咽部腫痛等[1，11-13]。在臨床診療中，僅依靠臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室常規(guī)檢查均不能作為新冠肺炎的準(zhǔn)確依據(jù)，確診的金標(biāo)準(zhǔn)是檢出COVID-19 病毒核酸。因此，及時準(zhǔn)確的病毒核酸檢測不僅在早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而且可以為與密切接觸、大量觀察者的篩查節(jié)省寶貴的醫(yī)療資源[13]。

對于COVID-19 的實(shí)驗(yàn)室檢測，筆者依據(jù)新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南發(fā)布的COVID-19 熒光PCR 檢測引物和探針對25 例COVID-19 確診病例的糞便標(biāo)本進(jìn)行病毒ORF1ab 基因及N 基因核酸檢測。結(jié)果表明，在確診的25 例糞便標(biāo)本中，根據(jù)發(fā)熱入院時間和治療時間來劃分，治療中期糞便標(biāo)本的病毒核酸檢測有12 例為陽性，確診病例中糞便標(biāo)本COVID-19 核酸陽性檢出率高達(dá)48%。其中男女比例為1:1.08，性別比例在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異，因此沒有證據(jù)證明性別易感性。經(jīng)過治療后，患者糞便病毒核酸檢測僅有3 例為陽性，同時相應(yīng)的檢測CT 值總體上升，間接反映出病毒載量呈降低的趨勢，這說明常規(guī)抗病毒治療效果值得肯定。本研究顯示糞便標(biāo)本COVID-19 核酸檢測呈陽性，但是有些呼吸道標(biāo)本核酸檢測卻為陰性，這提示筆者在呼吸道標(biāo)本的采集方法和類型的問題上應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。糞便標(biāo)本取材方便，不像呼吸道標(biāo)本對取樣要求較高，并且糞便標(biāo)本的質(zhì)和量更容易得到控制。同時在疾病的早期或癥狀較輕者，呼吸道標(biāo)本可能病毒載量較低，這可造成核酸檢測假陰性結(jié)果，而研究表明多數(shù)經(jīng)呼吸道感染的病毒后期有糞便排毒的特點(diǎn)[14]，因此選擇糞便標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測可防止漏檢，對COVID-19 核酸檢測具有重要的意義。

綜上所述，研究新型冠狀病毒糞便標(biāo)本中的病毒含量及持續(xù)時間，是實(shí)驗(yàn)室診斷COVID-19 感染及評價治療效果的重要方法之一。本研究結(jié)果對COVID-19 實(shí)驗(yàn)室檢測標(biāo)本的選擇具有一定的參考價值，在后續(xù)的研究中可結(jié)合其他類型的標(biāo)本做出系統(tǒng)的檢測和治療方案。