賈金滏，馬超，張明，范祺，王崇隊(duì)，張博華，孟曉峰，賈洪玉，楊立風(fēng)*

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南 250014；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271018；3.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250100）

多酚是含有苯環(huán)與酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物的總稱(chēng)。作為植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，植物多酚是果蔬營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的主要決定因素之一[1]。有研究表明，天然來(lái)源的植物多酚具有顯著的抗氧化活性[2]，能有效預(yù)防高血脂、高血糖以及心腦血管疾病等現(xiàn)代疾病的發(fā)生[3-4]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)需求更趨向于綠色、營(yíng)養(yǎng)和保健。植物多酚作為一種理想保健品原料，其衍生出的功能性食品越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。

仙人掌（Opuntia stricta）為仙人掌科、仙人掌屬植物，原產(chǎn)于南/北美洲，廣泛分布于亞、非、美洲的熱帶與亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要集中在西南及華南沿海地區(qū)[5]。仙人掌果為仙人掌植物的果實(shí)，果肉中含有豐富的多糖、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、膳食纖維、維生素、礦物元素、多酚類(lèi)等[6]。吉雪慧等[7]、馬丹雅等[8]分別從仙人掌果中提取了花色苷及黃酮類(lèi)物質(zhì)，并對(duì)這些物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。目前，仙人掌果實(shí)僅少量被采食，深加工利用較少，關(guān)于仙人掌果實(shí)總多酚的研究報(bào)道相對(duì)更少。鑒于此，本文對(duì)仙人掌果中多酚類(lèi)物質(zhì)的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，以期為仙人掌果實(shí)在食品、藥品以及化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：新鮮仙人掌果，采摘于2018 年10 月，購(gòu)于山東恒寶食品集團(tuán)有限公司。

試劑：沒(méi)食子酸（99%）、DPPH（96%），上海麥克林生化科技有限公司，均為分析純。福林酚（BR）、碳酸鈉、抗壞血酸、無(wú)水乙醇等，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：ME204E/02 型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-B 型恒溫水浴振蕩器，江蘇杰瑞爾電器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Vortex-3 型旋渦混合儀，上海嘉鵬科技有限公司；UV1000 型單光束紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SB-1100 型恒溫水浴鍋，上海愛(ài)朗儀器有限公司；FD-2型冷凍干燥機(jī)，上海比郎儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

采購(gòu)新鮮的仙人掌果實(shí)，經(jīng)真空冷凍干燥，粉碎過(guò)篩（250 μm），避光保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

采用Folin-Ciocalteus 法[9]，準(zhǔn)確稱(chēng)取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，去離子水超聲溶解，定容至100 mL，得到1 mg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用去離子水稀釋至40 μg/mL，冷藏備用；分別準(zhǔn)確移取0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750、0.875、1.000 mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（40 μg/mL）于試管中，去離子水補(bǔ)至1.0 mL，分別加入1 N 福林酚試劑1.0 mL，室溫反應(yīng)3 min；分別加入10%Na2CO3溶液1.0 mL，30 ℃條件下反應(yīng)30 min，于760 nm處測(cè)定吸光度，并進(jìn)行線(xiàn)性分析。

1.2.3 仙人掌果多酚提取含量測(cè)定

精確稱(chēng)取仙人掌果凍干粉0.5 g，以一定濃度乙醇溶液為提取溶劑進(jìn)行水浴振蕩提取，3 000 r/min 離心5 min，過(guò)濾，定容至50 mL，冷藏備用，參照1.2.2 進(jìn)行多酚含量測(cè)定。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

（1）提取溫度對(duì)仙人掌果多酚提取效果的影響

稱(chēng)取0.5 g 仙人掌果凍干粉，在乙醇濃度60%，料液比1:40（g/mL）的條件下，選擇提取溫度為30、40、50、60、70℃，水浴振蕩提取45 min，冷卻，3 000 r/min 離心5 min，過(guò)濾，定容至50 mL，參照1.2.2 測(cè)定多酚含量，平行3次，研究不同提取溫度對(duì)仙人掌果多酚提取效果的影響。

（2）提取時(shí)間對(duì)仙人掌果多酚提取效果的影響

稱(chēng)取0.5 g 仙人掌果凍干粉，在乙醇濃度60%、料液比1:40（g/mL）、提取溫度50 ℃的條件下，水浴振蕩提取15、30、45、60、75 min。其他步驟同（1），研究不同提取時(shí)間對(duì)仙人掌果多酚提取效果的影響。

（3）料液比對(duì)仙人掌果多酚提取效果的影響

稱(chēng)取0.5 g 仙人掌果凍干粉，在乙醇濃度60%、溫度50 ℃、提取45 min，的條件下，選取料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60（g/mL）。其他步驟同（1），研究不同料液比對(duì)仙人掌果多酚提取效果的影響。

（4）乙醇濃度對(duì)仙人掌果多酚提取效果的影響

稱(chēng)取0.5 g 仙人掌果凍干粉，分別選取乙醇濃度20%、40%、60%、80%、100%，在料液比1:40（g/mL）、提取溫度50 ℃條件下，水浴振蕩提取45 min。其他步驟同（1），研究不同乙醇濃度對(duì)仙人掌果多酚提取效果的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度為因素，以多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，確定仙人掌果多酚的最佳提取工藝，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 仙人掌果多酚提取工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test design of extraction process of polyphenols from cactus fruit

1.2.6 仙人掌果多酚提取物抗氧化活性評(píng)價(jià)

DPPH 自由基于醇溶液中呈現(xiàn)深紫色，在517 nm 處顯示特征吸收峰，抗氧化劑可結(jié)合其單電子，吸光度減弱，清除程度與抗氧化劑能力呈劑量依賴(lài)關(guān)系[10]。取適當(dāng)濃度的仙人掌果多酚溶液2 mL，與2 mL DPPH 溶液（400 μmol/L），30 ℃暗室條件下反應(yīng)30 min，以甲醇為空白，測(cè)定517 nm 處的吸光度，計(jì)算清除率（公式1）及IC50值（公式2）。

式中：A1為2 mL 樣品液+2 mL DPPH 溶液在517 nm 下的吸光度；A2為2 mL 去離子水+2 mL DPPH 溶液在517 nm 下的吸光度；A3為2 mL 去離子水+2 mL 樣品液在517 nm 下的吸光度；A4為2 mL 去離子水+2 mL 甲醇在517 nm 下的吸光度。

式中：S為半數(shù)清除率（50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

利用Folin-Ciocalteus 法，以吸光度A對(duì)濃度C（μg/mL）進(jìn)行線(xiàn)性分析，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（見(jiàn)圖1），回歸方程為A=0.044c+0.027 6（R2=0.999 1）。

2.2 仙人掌果多酚提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)仙人掌果多酚得率的影響

圖2 顯示了提取溫度對(duì)多酚得率的影響。由圖可知，提取溫度低于40 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，多酚得率不斷提高；超過(guò)40 ℃后，多酚得率逐漸下降，70 ℃時(shí)略有回升；在40 ℃時(shí)，多酚得率最高，為0.40%±0.02%。這可能是由于隨著體系溫度的升高，植物多酚在溶劑體系中的溶解度以及擴(kuò)散系數(shù)均會(huì)隨之增大，這有利于溶質(zhì)的浸提溶出。然而當(dāng)體系溫度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致部分多酚氧化修飾或分解，另外高溫溶劑易揮發(fā)，這影響了溶質(zhì)在體系中的分散度[11]，從而降低了多酚的提取得率。故選擇40 ℃為最適提取溫度。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)仙人掌果多酚得率的影響

圖3 顯示了提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響。由圖3 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，仙人掌果多酚得率先升后降之后又上升，提取時(shí)間為30 min 時(shí)，多酚得率最高，為0.34%±0.02%。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚提取得率隨之提高，可能由于與溶劑體系充分接觸，利于內(nèi)容物由細(xì)胞內(nèi)溶出釋放，時(shí)間延長(zhǎng)，溶出達(dá)到飽和；另外提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，其他雜質(zhì)與目標(biāo)內(nèi)容物構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)，可能影響目標(biāo)內(nèi)容物的選擇性溶出[12]。故選擇30 min 為最佳提取時(shí)間。

2.2.3 料液比對(duì)仙人掌果多酚得率的影響

圖4 顯示了料液比對(duì)多酚得率的影響。由圖可知，隨著溶劑量的增加，多酚得率呈現(xiàn)先上升后略下降的趨勢(shì)；在料液比1:40 時(shí)，多酚得率最高，為0.36%，可能由于水醇體系可促使多酚類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等大分子化合物之間氫鍵的斷裂[13]，在一定范圍內(nèi)增加溶劑用量，利于多酚類(lèi)物質(zhì)溶出，繼續(xù)降低料液比，溶出達(dá)到飽和，得率增加不明顯或有所下降。故選擇1:40 為最適料液比。

2.2.4 乙醇濃度對(duì)仙人掌果多酚得率的影響

圖5 顯示了乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響。由圖5 可知，多酚得率隨著乙醇濃度的提高總體呈現(xiàn)先降后升再下降的趨勢(shì)。在乙醇濃度為60%時(shí)，多酚得率最高，為0.31%±0.02%。可能由于極性相似相溶，一定乙醇濃度范圍，醇水體系利于多酚成分溶出，乙醇濃度過(guò)高，醇解反應(yīng)產(chǎn)生的醇溶性雜質(zhì)的溶出量增加[14]，并與多酚類(lèi)化合物形成競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致多酚得率下降。故選擇60%為最適乙醇提取濃度。

2.3 仙人掌果多酚提取的正交試驗(yàn)

由表2 極差分析可知，各因素對(duì)多酚得率影響依次為D>A>B>C，乙醇濃度為最主要的影響因素；理論最佳工藝為A3B3C3D2。對(duì)比驗(yàn)證理論最佳組合（A3B3C3D2）與表觀最優(yōu)組合（A3B1C3D2）如表3 所示，由表3 可知，多酚得率分別為0.37%±0.01%與0.40%±0.02%，A3B3C3D2高于A3B1C3D2。綜上考察，最佳提取工藝條件為提取溫度50 ℃，提取時(shí)間45 min，料液比1:50（g/mL），乙醇濃度60%。

表2 仙人掌果多酚提取最佳工藝正交試驗(yàn)Table 2 Orthogonal test of best extraction process of polyphenols from cactus fruit

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of verification experiment

2.4 仙人掌果多酚提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)

目前關(guān)于天然產(chǎn)物抗氧化活性評(píng)價(jià)有自由基清除、脂質(zhì)過(guò)氧化、抗氧化酶活性、DNA氧化損傷等方法[15]。DPPH作為以氮為中心的穩(wěn)定自由基，由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、反應(yīng)過(guò)程易控制，已被廣泛應(yīng)用于單一化合物及提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)與篩選[16]。在乙醇濃度60%，料液比1:50（g/mL），提取溫度50 ℃，提取時(shí)間45 min 的工藝條件下，提取制備仙人掌果總多酚，并進(jìn)行DPPH 自由基清除率測(cè)定，結(jié)果如圖6 所示。

由圖6 可知，仙人掌果多酚提取物對(duì)DPPH 自由基有較強(qiáng)的清除效果，且隨著濃度的增加而增大，清除率（%）與質(zhì)量濃度（mg/mL）呈線(xiàn)性關(guān)系（y=27.587x+0.191 2，R2=0.998 9），IC50為1.81 mg/mL。

3 結(jié)論

本研究以乙醇為提取溶劑，采用單因素及正交試驗(yàn)對(duì)仙人掌果多酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)仙人掌果多酚類(lèi)物質(zhì)提取得率影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?提取溫度>提取時(shí)間>料液比；最佳提取條件為乙醇濃度60%，料液比1:50（g/mL），提取溫度50 ℃，提取時(shí)間45 min，在此條件下仙人掌果多酚得率為0.40%±0.02%，仙人掌果多酚提取物顯示出了較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，IC50值為1.81 mg/mL。