高晨昕，朱艷，郭夢煒，陶婧，艾敏，殷鴻洋，趙遠(yuǎn)，肖嫻,*

1. 常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，常州 213000 2. 無錫職業(yè)技術(shù)學(xué)院，無錫 214000 3. 江蘇龍衡環(huán)境科技有限公司，常州 213000

在實際環(huán)境中，污染物通常不以單一形式存在，而是以混合作用模式存在。由于污染物的種類或者來源不同，在共存時受環(huán)境因素影響容易產(chǎn)生聯(lián)合毒性效應(yīng)，嚴(yán)重危害環(huán)境[1]。當(dāng)多種污染物共存時，不同污染物之間會對生物體吸收、代謝及其他生化反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)雜的影響。殺螟丹(cartap)是我國經(jīng)常使用的一種中低毒農(nóng)藥[2-3]。它是一種沙蠶毒素類農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于水稻、蔬菜、茶樹和早糧作物害蟲的防治。鉛(Pb)是對環(huán)境和人體傷害較大的重金屬“五毒”之一，在土壤中具有難分解、易積累和傷害不可逆等特點，是生態(tài)環(huán)境和人體健康的潛在殺手[4-5]。然而，目前對殺螟丹和Pb復(fù)合污染毒性效應(yīng)的相關(guān)研究還很缺乏。

針對復(fù)合污染常用的指示性生物主要有鹵蟲、發(fā)光細(xì)菌、大型蚤、藻類、斑馬魚和蚯蚓等[6-7]。相關(guān)研究證明，斑馬魚胚胎透明，活體狀態(tài)下可進(jìn)行病變觀察，且大部分基因?qū)?yīng)人類同源基因，是目前毒理和病理學(xué)領(lǐng)域理想的生物標(biāo)志物[8]。丁克強等[9]的研究結(jié)果表明，發(fā)光細(xì)菌毒性測定方法可用于評價和測定污染土壤的毒性，是理想的生物標(biāo)志物。目前，相關(guān)研究顯示，重金屬與農(nóng)藥的復(fù)合污染對生物體的生理生化指標(biāo)有明顯影響，指標(biāo)變化可反映污染物對生物的毒性機制，指示土壤污染程度。劉文麗等[10]發(fā)現(xiàn)異丙甲草胺作用下，蚯蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)響應(yīng)不同，CAT所受影響更大。蘇連水[11]在研究多菌靈等農(nóng)藥和鎳復(fù)合污染對蚯蚓的毒性影響時發(fā)現(xiàn)，蚯蚓繁殖和生長能力均受不同程度損傷，CAT和SOD響應(yīng)也不同。閻曉靜[12]研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉和鎘復(fù)合污染對蚯蚓體內(nèi)丙二醛(MDA)含量有影響，對SOD和CAT活性有抑制作用。重金屬與農(nóng)藥聯(lián)合作用于生物體時產(chǎn)生的毒性作用與單一作用完全不同，并且多數(shù)表現(xiàn)為協(xié)同作用[13]。孟順龍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，滅多威和辛硫磷對羅非魚分別屬于極高毒和高毒，二元聯(lián)合在96 h內(nèi)為協(xié)同作用。吳淑杭等[15]的研究表明，甲氨基阿維菌素與阿維菌素聯(lián)合作用毒性為兩者單一作用毒性之和，二氯喹啉酸與莎稗磷的毒性互相促進(jìn)。目前，復(fù)合污染尤其是同源污染，即同一環(huán)境介質(zhì)中不同污染物構(gòu)成的污染類型(例如重金屬和農(nóng)藥)，造成的嚴(yán)峻的環(huán)境問題已逐步引起各國關(guān)注[16-17]。目前，關(guān)于復(fù)合污染的聯(lián)合毒性研究主要集中在急性致死方面，而在亞致死劑量下對生物體機體的損傷方面的研究還甚少。

土壤中生物量最大的寡毛綱陸棲動物代表是蚯蚓。由于蚯蚓對污染物敏感度高，極易受到污染物的影響導(dǎo)致生存和遺傳等多方面的變化，所以常被用作鑒別和診斷土壤污染，作為模式生物應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)[18]。為了探究重金屬和農(nóng)藥對土壤生態(tài)的聯(lián)合毒性，筆者選取赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)作為研究對象，研究殺螟丹和Pb單一及二元復(fù)合脅迫下蚯蚓的死亡率和生理生化指標(biāo)的變化，為深入研究重金屬與農(nóng)藥復(fù)合污染的作用機理提供研究方法和數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試生物

赤子愛勝蚓購置于江蘇某蚯蚓養(yǎng)殖場。試驗前經(jīng)實驗室預(yù)培養(yǎng)一段時間，試驗過程中選擇體型相似、體重約0.3 g的性成熟的成年蚯蚓。

1.2 蚯蚓急性毒性實驗

1.2.1 單一毒性實驗

蚯蚓清腸：在預(yù)先培養(yǎng)的蚯蚓中挑取性成熟的成年蚯蚓，洗凈后吸干體表水分后放入燒杯中，燒杯底部鋪有濾紙并加適量水潤濕，用解剖針扎好孔的保鮮膜封口。將燒杯置于的恒溫培養(yǎng)箱中，溫度為(20±1) ℃，濕度約80%，于暗處清腸24 h。

暴露實驗：依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，對濃度區(qū)間進(jìn)行等對數(shù)間距稀釋形成5個濃度梯度進(jìn)行正式實驗。將雙圈定性濾紙墊入玻璃培養(yǎng)皿中，準(zhǔn)確吸取4 mL試驗濃度的試劑均勻淋灑于濾紙上，已清腸的蚯蚓沖洗干凈并吸干體表多余水分后在每個濃度處理中放入一條，每個試驗處理組設(shè)10個重復(fù)，同時設(shè)置空白對照組。用保鮮膜封口扎緊，再將玻璃培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)溫度為(20±1) ℃，濕度為80%左右，于暗處培養(yǎng)72 h，并于24、48和72 h分別記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數(shù)。

1.2.2 聯(lián)合毒性實驗

根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則 第15部分：蚯蚓急性毒性實驗》(GB/T 31270.15—2014)[19]中濾紙法的規(guī)定，以殺螟丹和Pb對蚯蚓的48 h的半致死濃度(LC50)值為一個毒性單位，按照等毒性比1∶1的混合比例以等對數(shù)間距設(shè)置試驗濃度進(jìn)行聯(lián)合毒性實驗，具體程序參照單一毒性實驗的方法。

1.2.3 聯(lián)合毒性效應(yīng)評價

當(dāng)前，在國際上并未確定統(tǒng)一的關(guān)于污染物對土壤動物的聯(lián)合作用評價方法，本研究采用Marking相加指數(shù)法[20]評價重金屬與農(nóng)藥復(fù)合污染對蚯蚓的聯(lián)合毒性作用，計算方式如下：

(1)

(2)

S>1時，AI=1.0-S

(3)

式(1)中：An、Bn和Cn值分別代表混合物中不同毒物的LC50值，Aj、Bj和Cj分別代表A、B和C毒物單獨作用時的LC50值。

依照相加指數(shù)(AI)值判斷聯(lián)合毒性的類型[21]，當(dāng)-0.2

1.3 蚯蚓生理生化指標(biāo)實驗

分別采集不同時間各處理的蚯蚓樣本，按照稱取的蚯蚓質(zhì)量的9倍加入0.86%的生理鹽水，用勻漿器在冰浴條件下勻漿，用冷凍離心機將勻漿好的蚯蚓組織液在2 500 r·min-1條件下離心10 min。取上清液用生理鹽水稀釋成所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組織勻漿，待測。

蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測試盒(南京建成生物科技研究所)，試驗設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管，其中，空白管中加入雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.563 g·L-1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，測定管中加入各處理的蚯蚓組織勻漿。試驗時先加入樣品，再加入考馬斯亮藍(lán)顯色液，混勻靜置10 min，用酶標(biāo)儀(E7031，美國普洛麥格公司)在波長595 nm處測定各管的吸光度值(OD)。根據(jù)測得的OD計算蚯蚓樣本2%濃度的組織勻漿液的蛋白含量[22]，計算方法如下：

SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，試劑盒購于南京建成生物科技研究所，試管設(shè)置測定管和對照管，測定管加樣品，對照管加同樣體積的雙蒸水，室溫靜置10 min后，用酶標(biāo)儀(E7031，美國普洛麥格公司)在波長550 nm處[23]，測定各管的吸光度值，SOD活性計算方法如下：

CAT活性采用可見光法測定，試劑盒購于南京建成生物科技研究所，試驗設(shè)置對照管和測定管，按照試劑盒的說明進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀(E7031，美國普洛麥格公司)在波長405 nm處，測定各管的吸光度值[24]。計算方法如下：

(6)

MDA含量采用TBA法測定，試驗設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管和對照管，按照試劑盒(南京建成生物科技研究所)說明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀(E7031，美國普洛麥格公司)在波長405 nm處測定各管的吸光度值[25]。計算方法如下：

(7)

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin8.5軟件對混合體系中各物質(zhì)濃度與蚯蚓死亡率進(jìn)行非線性擬合，并采用非線性回歸方程計算得出蚯蚓的24、48和72 h的LC50值。

2 結(jié)果(Results)

2.1 殺螟丹和Pb對蚯蚓的急性毒性效應(yīng)

2.1.1 殺螟丹和Pb對蚯蚓的單一毒性

蚯蚓經(jīng)殺螟丹暴露后，出現(xiàn)一些中毒癥狀：軀體顏色加深且軀體極度延展、失去彈性，部分蚯蚓爬行緩慢，反應(yīng)遲緩，對刺激不敏感。蚯蚓經(jīng)Pb染毒后主要表現(xiàn)為：軀體變軟、有小泡，出現(xiàn)“抱團(tuán)”現(xiàn)象，染毒時間延長后，一些蚯蚓表皮滲出血液，有些個體出現(xiàn)軀體腐爛、變黑和斷節(jié)現(xiàn)象。

殺螟丹和Pb對蚯蚓的單一毒性試驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，2種藥物對蚯蚓毒性有差異，并且毒性都隨著暴露時間的延長而增強。染毒24 h時，殺螟丹對蚯蚓的單一毒性大于Pb，其24 h-LC50值為14.3 mg·L-1。蚯蚓對Pb的耐受能力更強，為殺螟丹的67.9倍。染毒48 h時，殺螟丹和Pb的48 h-LC50分別為12.4 mg·L-1和911.6 mg·L-1，毒性分別增強1.2倍和1.0倍，殺螟丹毒性更強，是Pb的73.8倍。染毒72 h時，殺螟丹和Pb單一毒性繼續(xù)增強，較48 h增強1.2倍和1.1倍，殺螟丹72 h-LC50值為10.4 mg·L-1，毒性更強。

表1 殺螟丹和Pb對赤子愛勝蚓的單一毒性Table 1 The individual toxicity of cartap and Pb on Eisenia foetida

2.1.2 殺螟丹和Pb對蚯蚓的二元聯(lián)合毒性

殺螟丹-Pb對蚯蚓的聯(lián)合毒性作用類型結(jié)果如表2所示，殺螟丹與Pb等毒性1∶1配比、暴露24、48和72 h時，AI分別為-0.17、-0.19和-0.25，聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加作用、相加作用和拮抗作用，二者隨著暴露時間的延長，相互作用逐漸減弱。二元混合體系下，殺螟丹和Pb的LC50幾乎是各自單一作用時的1/2，且隨著暴露時間延長，LC50值逐漸降低。在混合體系中，二者毒害性大于各自單一作用時產(chǎn)生的毒害，但隨暴露時間的延長，聯(lián)合作用逐漸減弱。

表2 殺螟丹-Pb二元混合體系對赤子愛勝蚓聯(lián)合毒性評價結(jié)果Table 2 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cartap and Pb to Eisenia foetida

2.2 殺螟丹單一作用對蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響

設(shè)置殺螟丹染毒濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1，以不加殺螟丹為空白對照(CK)，分別在24、48和72 h采集蚯蚓樣本進(jìn)行前處理，測定其蛋白含量、體內(nèi)SOD活性、CAT活性以及MDA含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 殺螟丹單一染毒24、48和72 h對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 1 Effect of cartap on protein content, superoxide dismutase (SOD) activity, catalase (CAT) activity and malondialdehyde (MDA) content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

蚯蚓經(jīng)不同濃度殺螟丹染毒后，蛋白含量在染毒時間內(nèi)先升高后降低并趨于穩(wěn)定(圖1(a))。染毒24 h時，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1濃度組蛋白含量分別較CK增加12.9%、9.5%、43.6%、29.6%和23.8%，在濃度為1.5 mg·L-1時出現(xiàn)峰值。染毒48 h時，在濃度為1.0 mg·L-1時達(dá)到峰值。染毒72 h時，在濃度為1.5 mg·L-1時達(dá)到峰值。不同染毒時間內(nèi)，峰值濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。暴露時間內(nèi)，24、48和72 h內(nèi)SOD活性分別呈現(xiàn)先降低后升高、先升高后降低和持續(xù)降低的趨勢(圖1(b))。暴露24 h時，各處理SOD活性分別高于CK 10.93%、3.02%、-2.06%、5.51%和19.04%。染毒48 h的SOD活性呈現(xiàn)與24 h相反趨勢，在濃度為2.0 mg·L-1時達(dá)到峰值，隨后降低。暴露72 h時SOD活性持續(xù)降低并遠(yuǎn)低于CK。24 h和48 h時各濃度組間SOD活性差異不顯著，72 h時各濃度組之間以及與CK均存在顯著性差異(P<0.05)。CAT活性在暴露時間內(nèi)，整體呈現(xiàn)先上升后降低趨勢(圖1(c))。CK體內(nèi)CAT活性無明顯波動。染毒24 h時CAT活性被誘導(dǎo)迅速上升，并在0.5 mg·L-1時達(dá)到峰值。48 h時CAT活性在2.0 mg·L-1時達(dá)到峰值后大幅降低，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1濃度組與24 h相比分別降低52.18%、46.51%、41.24%、32.58%和40.37%。72 h時CAT活性相對48 h整體略升高，在1 mg·L-1時達(dá)到峰值。除72 h時各濃度組之間差異不顯著，其余暴露時間不同濃度組之間均有顯著性差異(P<0.05)。72 h內(nèi)隨著染毒時間的增加，蚯蚓體內(nèi)MDA含量整體降低(圖1(d))。CK中蚯蚓體內(nèi)MDA含量較穩(wěn)定，基本不變。染毒24 h時，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1濃度組的MDA含量分別高于CK 29.37%、66.87%、34.70%、14.77%和2.2%，并呈現(xiàn)先升高后降低趨勢且在1.0 mg·L-1時達(dá)到峰值。染毒48 h時，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1濃度組中MDA含量分別高于CK 1.79%、15.83%、38.13%、5.45%和2.49%，整體含量較染毒初期降低。染毒72 h時，MDA含量基本與CK相當(dāng)。除24 h和48 h內(nèi)峰值濃度組與CK存在顯著性差異(P<0.05)外，其他濃度組之間、與CK之間均無明顯差異。

2.3 Pb單一作用對蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響

經(jīng)50、100、150、200和250 mg·L-1Pb處理后，分別于24、48和72 h采集蚯蚓樣本，進(jìn)行蛋白含量、體內(nèi)SOD活性、CAT活性和MDA含量的測定，結(jié)果如圖2所示。

24、48和72 h暴露時間內(nèi)，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量變化趨勢相似(圖2(a))。暴露24 h時，蛋白含量呈現(xiàn)升高、降低、升高趨勢，50、100、150、200和250 mg·L-1濃度組相對CK分別增加11.25%、33.91%、22.82%、13.42%和21.55%，在濃度為100 mg·L-1時達(dá)到峰值，隨后降低。染毒48 h的變化趨勢與24 h相同。染毒72 h時，濃度≥100 mg·L-1時蛋白含量逐漸降低，在250 mg·L-1時降至與CK相當(dāng)。不同時間段內(nèi)，峰值濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。隨著暴露時間延長，CK中蚯蚓體內(nèi)SOD活性幾乎穩(wěn)定不變(圖2(b))。染毒24 h時，各濃度組SOD活性均大于CK并呈現(xiàn)逐步升高趨勢，50、100、150、200和250 mg·L-1濃度組分別較CK增加了5.06%、11.18%、21.48%、33.03%和40.37%，在250 mg·L-1時達(dá)到峰值。暴露48 h時SOD活性先升高后降低，在Pb濃度為100 mg·L-1時達(dá)到峰值，與CK相比升高50.90%。暴露72 h時SOD活性逐步降低并趨于平穩(wěn)。除72 h內(nèi)各濃度組間無顯著性差異，其余暴露時間各濃度組間、與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。CK中蚯蚓體內(nèi)CAT活性隨暴露時間延長無明顯變化(圖2(c))。染毒24 h時，CAT活性呈現(xiàn)降低、升高、降低趨勢，在Pb濃度為200 mg·L-1時達(dá)到峰值，50、100、150、200和250 mg·L-1濃度組分別高于CK 48.75%、33.95%、46.99%、61.89%和44.82%。染毒48 h時，CAT活性整體大幅下降，甚至低于CK，各濃度組與CK均存在顯著性差異(P<0.05)。染毒72 h時，CAT活性恢復(fù)至與CK相當(dāng)并保持平穩(wěn)。各濃度組之間均無顯著性差異。隨著暴露時間延長，CK中蚯蚓體內(nèi)MDA含量變化幅度很小(圖2(d))。染毒24 h和48 h時，MDA含量均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。24 h的最小值出現(xiàn)在濃度150 mg·L-1時，低于CK 11.83%，然后在200 mg·L-1和250 mg·L-1時分別高出CK 24.09%和37.44%。48 h時基本回落至CK水平。染毒72 h時，MDA含量逐步上升，整體較48 h略升高。3個不同時間段內(nèi)，峰值濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。

圖2 Pb單一染毒24、48和72 h對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的影響Fig. 2 Effect of Pb on protein content, SOD activity, CAT activity and MDA content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

2.4 殺螟丹和Pb二元聯(lián)合對蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響

經(jīng)過0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的殺螟丹與50 mg·L-1Pb梯度處理24、48和72 h后采集蚯蚓樣本，測定其體內(nèi)蛋白含量、體內(nèi)SOD活性、CAT活性以及MDA含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 殺螟丹與50 mg·L-1 Pb聯(lián)合染毒24、48和72 h對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的影響Fig. 3 Effect of cartap and Pb (50 mg·L-1) on protein content, SOD activity, CAT activity and MDA content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

24、48和72 h的暴露時間內(nèi)，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量整體呈現(xiàn)升高、降低、升高、降低趨勢(圖3(a))。染毒24 h時，蛋白含量在1.0 mg·L-1殺螟丹與50 mg·L-1Pb聯(lián)合染毒時達(dá)到峰值，與CK存在顯著性差異(P<0.05)。染毒48 h時，蛋白含量呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，各濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。72 h時，蛋白含量呈現(xiàn)與48 h相反趨勢，即隨著暴露濃度的增加蛋白含量降低，與CK差異性也越顯著。不同處理組蚯蚓體內(nèi)SOD活性幾乎均高于CK(圖3(b))。CK的SOD活性在48 h時達(dá)到峰值。染毒24 h時，SOD活性呈現(xiàn)上升趨勢，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的殺螟丹+50 mg·L-1Pb組較CK升高10.70%、22.40%、32.53%、45.89%和54.54%，在殺螟丹(2.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組達(dá)到峰值。各濃度組之間、與CK均存在顯著性差異(P<0.05)。染毒48 h時，SOD活性變化趨勢同24 h，各濃度組之間差異不顯著。染毒72 h時，SOD活性先升高后降低，峰值出現(xiàn)在殺螟丹(1.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組，各濃度組均與CK存在顯著性差異(P<0.05)。CK中蚯蚓體內(nèi)CAT活性隨暴露時間增加無明顯變化(圖3(c))。染毒24 h時，CAT活性較CK大幅升高，并呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在殺螟丹(2.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組達(dá)到峰值。染毒48 h時，CAT活性較24 h時大幅降低，殺螟丹(0.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組CAT活性低于CK，峰值出現(xiàn)在殺螟丹(1.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組，較24 h峰值降低24.97%。染毒72 h時，CAT活性較48 h升高，但不同濃度組CAT活性變化不大。除24 h各濃度組間存在顯著性差異，其余染毒時間內(nèi)差異均不顯著。CK中蚯蚓體內(nèi)MDA含量較穩(wěn)定，隨暴露時間增加無明顯變化(圖3(d))。染毒24 h時，低濃度組中MDA基本未受到誘導(dǎo)作用，在殺螟丹(1.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組中受到抑制。高濃度殺螟丹(2.0、50和2.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)處理組MDA受到的誘導(dǎo)作用較強，分別高于CK 31.91%和58.75%。染毒48 h時，MDA含量變化幅度較24 h更小，并呈先降低后升高趨勢，其中，在殺螟丹(1.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)濃度組中與CK相當(dāng)。各濃度組之間無顯著性差異。染毒72 h時，MDA含量整體升高，各濃度組之間以及與CK間均存在顯著性差異(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

筆者研究了農(nóng)藥殺螟丹與重金屬Pb對蚯蚓單一和聯(lián)合毒性效應(yīng)，考察了亞致死劑量下蚯蚓體內(nèi)蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的變化趨勢，找出反映蚯蚓受污染物脅迫程度的生物學(xué)指標(biāo)。

殺螟丹和Pb對蚯蚓的單一毒性研究結(jié)果表明，殺螟丹毒性大于Pb。這可能由于殺螟丹具有神經(jīng)性殺蟲活性，尤其對土壤生物具有較大殺傷力，毒害作用高于土壤中富集的重金屬[26]。而蚯蚓對不同重金屬的耐受性和富集能力均不同。相關(guān)研究證明，蚯蚓對Pb的富集能力隨著土壤中Pb濃度的增加而增強[27]。宋玉芳等[28]發(fā)現(xiàn)蚯蚓對Pb的耐受度較強。在殺螟丹與Pb等毒性比1∶1二元混合體系中，聯(lián)合毒性以相加為主，在暴露72 h時減弱為拮抗作用。可能原因為，隨著暴露時間的增加，殺螟丹逐漸損傷蚯蚓細(xì)胞膜[29]，抑制了蚯蚓機體對毒性物質(zhì)的吸收，從而表現(xiàn)出聯(lián)合毒性減弱的結(jié)果。

急性毒性實驗只能通過研究蚯蚓存活率和死亡率等指標(biāo)觀察毒性效應(yīng)，而不能進(jìn)一步表征機體內(nèi)各項生理生化指標(biāo)的變化，有局限性。因此，研究蚯蚓經(jīng)亞致死劑量殺螟丹和Pb單一和復(fù)合染毒后，其體內(nèi)蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的變化趨勢。綜合分析生理生化指標(biāo)變化發(fā)現(xiàn)，蚯蚓在機體遭受污染物脅迫時，首先蛋白含量會發(fā)生變化以警示受到污染損害，與此同時第一道抗氧化防御啟動，機體內(nèi)SOD活性等迅速被誘導(dǎo)，用于清除體內(nèi)過多的氧自由基并產(chǎn)生H2O2，隨后CAT活性增強并將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2。SOD活性隨染毒時間延長而降低，此時，MDA含量增強，表明機體受氧化損傷程度加重。因此，SOD活性和MDA含量均可作為蚯蚓應(yīng)對氧化脅迫和機體受氧化損傷程度的判斷指標(biāo)。

蚯蚓主要通過腸道與土壤中的污染物接觸，其表皮和中腸受到損傷進(jìn)而危害其生長，蛋白含量在這種情況下極易發(fā)生變性[30]。殺螟丹、Pb單一作用以及二者聯(lián)合作用下，隨著暴露時間增加，不同濃度下蚯蚓體內(nèi)蛋白含量變化在初期均表現(xiàn)為不穩(wěn)定。這是由于污染物的刺激導(dǎo)致蚯蚓機體產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，如C-反應(yīng)蛋白(CRF)、纖維連接蛋白(Fn)等，這引起蚯蚓體內(nèi)蛋白總量的升高[31]。也有可能由于蚯蚓機體受到損傷，內(nèi)環(huán)境紊亂造成體內(nèi)蛋白含量的急劇增加。3種染毒模式均在中后期出現(xiàn)蛋白含量峰值，后又逐步降低，這與邰托婭等[32]的研究結(jié)果相似。可能因為后期染毒濃度較高且染毒時間較長時，經(jīng)表皮的毒性和胃毒破壞了蛋白產(chǎn)生源，而機體代謝也需要蛋白提供能量，致使蛋白合成量減少。

染毒初期，殺螟丹單一作用主要脅迫蚯蚓胃部，經(jīng)表皮細(xì)胞吸收后，蚯蚓機體作出抗氧化防御反應(yīng)，SOD活性逐漸被誘導(dǎo)，因此，呈現(xiàn)先降低后升高趨勢。后期由于時間增長導(dǎo)致機體脅迫程度加重，代謝受到影響而抑制SOD活性，當(dāng)SOD被消耗后，機體不足以抵抗氧化反應(yīng)，酶活性也隨之降低，導(dǎo)致SOD下降甚至低于CK。Pb單一作用時，短時間內(nèi)能夠明顯誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)SOD活性，染毒后期也呈現(xiàn)SOD受到抑制的現(xiàn)象，這與Shao等[33]的研究結(jié)論相似。殺螟丹與Pb二元聯(lián)合作用時，初期聯(lián)合毒性的相加作用促使SOD含量升高以抵抗氧自由基對機體的損害，后期聯(lián)合毒性降低但對SOD活性抑制作用依舊增強，蚯蚓機體修復(fù)能力已無法承受傷害，氧化損傷嚴(yán)重，趙逸昳[34]在研究農(nóng)藥與重金屬復(fù)合污染對蚯蚓SOD活性的影響時，得出了相似結(jié)果。值得注意的是，殺螟丹與Pb混合體系在后期對蚯蚓體內(nèi)SOD活性脅迫作用均大于單一脅迫，說明復(fù)合污染對蚯蚓機體抗氧化性毒害大于單一污染。

CAT與SOD一起構(gòu)成生物體防御體系，用于清除蚯蚓體內(nèi)H2O2以免除機體氧化損傷。3種染毒模式下CAT活性整體變化均呈現(xiàn)先上升后下降并趨于穩(wěn)定的趨勢。殺螟丹單一作用時，染毒初期蚯蚓體內(nèi)吸收殺螟丹較少，代償性地誘導(dǎo)CAT活性升高，隨時間延長CAT活性恢復(fù)至正常水平。后期蚯蚓機體對殺螟丹產(chǎn)生適應(yīng)，CAT活性上升同時趨于穩(wěn)定，這與已有研究結(jié)論相似[35]。Pb單一作用時，初期CAT活性變化同殺螟丹作用時相似，中后期CAT活性下降可能是由于SOD活性增強，產(chǎn)生的H2O2超過CAT轉(zhuǎn)化能力，或蚯蚓機體受損嚴(yán)重，需要啟動第二道抗氧化防御機制CAT酶來維持機體代謝平衡，這與Vitória等[36]觀察到的生物體遭受脅迫時CAT活性變化的情況相同。殺螟丹與Pb二元聯(lián)合染毒時，前中期變化均與殺螟丹和Pb單一染毒時相似，后期CAT活性有大幅回升甚至與初期活性相同，推測是因為后期聯(lián)合毒性減弱，蚯蚓機體已啟動CAT酶用于維持機體平衡，這與丁詩華等[37]提出的機理相似。

MDA含量可反映蚯蚓在受毒害時脂質(zhì)過氧化水平，以評價蚯蚓細(xì)胞受損程度。殺螟丹和Pb分別單一作用時，MDA含量變化趨勢相反。殺螟丹作用時，暴露時間內(nèi)，MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，推測可能由于染毒初期蚯蚓受殺螟丹脅迫，抗氧化防御系統(tǒng)還未完全恢復(fù)功能，機體受氧化損傷導(dǎo)致脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量迅速升高。隨著抗氧化防御系統(tǒng)的開啟，各種抗氧化酶活性增強，消除了過多的氧自由基，機體逐漸適應(yīng)脅迫環(huán)境，機體受氧化脂質(zhì)損傷程度減輕，MDA含量降低。Pb作用時，MDA含量變化出現(xiàn)相反趨勢，考慮是由于染毒初期蚯蚓受低濃度Pb脅迫，抗氧化防御系統(tǒng)中的SOD等足以清除氧自由基，機體氧化損傷較輕，隨著Pb濃度的升高，SOD活性降低，機體氧化損傷嚴(yán)重。中期機體逐步適應(yīng)Pb脅迫后，MDA含量達(dá)到平衡。后期染毒時間延長致使機體脂質(zhì)氧化加重，導(dǎo)致MDA含量增加。Jager等[38]研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)MDA含量越高，則機體受到氧化損傷程度越大。這說明，長時間Pb脅迫對蚯蚓機體氧化損傷大于殺螟丹。殺螟丹與Pb二元聯(lián)合作用下，MDA含量變化趨勢與Pb脅迫時相似，但整體含量上升，考慮是由于聯(lián)合毒性相比單一脅迫導(dǎo)致蚯蚓機體產(chǎn)生更多的自由基以致無法清除，自由基不斷累積導(dǎo)致氧化應(yīng)激而使MDA含量過高，該結(jié)果與段曉塵[39]和Narbonne等[40]的研究結(jié)果相似。與單一毒性不同，復(fù)合染毒中殺螟丹與Pb同時作用，殺螟丹破壞了細(xì)胞膜，影響了蚯蚓對體內(nèi)Pb的降解代謝能力，Pb會逐漸積累至機體無法消除，MDA含量的升高也反映了這點。值得注意的是，與CK相比，二元混合體系下高濃度脅迫對蚯蚓體內(nèi)MDA含量具有較強誘導(dǎo)作用，低濃度脅迫幾乎無誘導(dǎo)作用，說明高濃度復(fù)合污染對蚯蚓機體氧化損傷較大。