鄭子龍，陳雨珊，楊旭,2，曾燕，李金泉,*

1. 武漢科技大學醫(yī)學院，腦科學先進技術研究院，武漢 430081 2. 華中師范大學生命科學學院，武漢 430079

在工業(yè)化、城市化和全球變暖三重壓力下，我國城市臭氧(ozone, O3)的污染風險不斷提高。城市臭氧污染主要是指城市近地面臭氧，是由氮氧化物和揮發(fā)性有機物等臭氧前體物質(zhì)，在強烈的陽光紫外線照射下，發(fā)生光化學反應，生成主要成分為臭氧的光化學煙霧。近年來，隨著我國“大氣十條”方案的逐步落實，空氣質(zhì)量改善顯著，PM2.5濃度下降明顯，但是臭氧污染的勢頭卻持續(xù)上升，導致在我國許多地區(qū)臭氧已超越PM2.5成為夏秋季各地空氣首要污染物[1-4]。我國生態(tài)環(huán)境部2019年空氣質(zhì)量數(shù)據(jù)顯示，全國337個地級及以上城市臭氧平均濃度同比上升6.5%，高達148 μg·m-3，接近我國空氣質(zhì)量臭氧污染紅線160 μg·m-3。作為一種強氧化劑，臭氧幾乎可與任何生物組織反應并引起不利健康的影響。臭氧暴露會引起氣道炎癥、導致氣道狹窄、支氣管反應性增加和肺功能下降[5]。此外，暴露于臭氧與患有阻塞性肺疾病(例如哮喘和慢性阻塞性肺疾病)的患者癥狀惡化、呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率增加緊密相關[6-7]。Francis等[8]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于臭氧后，趨化因子受體2(CCR2)在肺中的促炎和抗炎巨噬細胞積累中均起作用。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體活性氧(mtROS)和NLRP3炎性體均在臭氧誘導的肺部炎癥中起作用。然而，雖然臭氧污染帶來的健康風險已受到普遍關注，但相關防治策略及其生物學機制仍不清楚，亟待深入研究。

核因子E2相關因子2 (Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，在編碼抗氧化劑和/或排毒酶和相關壓力響應蛋白的基因的啟動子區(qū)域中起重要作用[10-11]。Nrf2可調(diào)節(jié)血紅素加氧酶1(HO-1)、NADPH:醌氧化還原酶1(NQO-1)和γ-谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)等抗氧化酶，以減輕炎癥損害并中和炎性損傷引起的細胞/組織的活性氧(ROS)[12]。氧化/抗氧化失衡被認為在肺部炎癥損傷中起到重要作用。激活以Nrf2為代表的抗氧化酶系統(tǒng)能夠減輕氧化應激引起的肺損傷，但其在抑制臭氧吸入毒性從而減輕肺部炎癥中的作用仍有待研究。褪黑素(melatonin, MT)是一種松果體激素，有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等多種生理功能[13]，可抑制體內(nèi)氧化應激[14-15]，保護細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA免受氧化損傷[16]。因此，本研究通過構建小鼠臭氧急性暴露模型，觀察臭氧暴露對肺組織氧化應激和炎癥損傷的相關指標，通過抗氧化劑MT的處理，探究MT是否通過激活Nrf2及其下游抗氧化酶拮抗臭氧誘發(fā)小鼠急性肺部損傷，以期驗證臭氧暴露誘導的肺部損傷機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

SPF級雄性Balb/c小鼠，購買于湖北省疾病預防控制中心(國家級實驗動物中心)，6～8周齡，體重(22±2) g，飼養(yǎng)于華中師范大學實驗動物中心，12 h晝夜循環(huán)光照，溫度保持在22～24 ℃，濕度為40%～60%，小鼠飲食飲水充足供應。臭氧暴露前，小鼠適應性飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要儀器

KTB便攜式臭氧發(fā)生器(廣州創(chuàng)環(huán)臭氧電器設備有限公司)，KP836便攜式臭氧檢測儀(江蘇羽翼科技有限公司)、DW-HL100型-80 ℃超低溫冰箱(中科美菱有限公司，中國)、5415R低溫冷凍離心機(艾本德有限公司，德國)、DNM-9602全長酶標儀(北京普朗新技術有限公司，中國)、Dancer/MS3渦旋儀(艾卡儀器設備有限公司，德國)、移液器(艾本德有限公司，德國)、CFX96 Real-time PCR儀(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司，美國)。

1.3 主要試劑和檢測試劑盒

褪黑素(Sigma公司，美國)、小鼠IL-1β(貨號：88-7013-22，靈敏度：8 pg·mL-1)、IL-33(貨號：88-7333-22，靈敏度：25 pg·mL-1)、IL-4(貨號：88-7044-22，靈敏度：4 pg·mL-1)、IL-17A(貨號：88-7371-22，靈敏度：4 pg·mL-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(eBioscience公司，美國)，小鼠微量GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)，BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(生工生物工程股份有限公司，中國)，戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國)，硫代巴比妥酸(國藥集團化學有限公司，中國)，蘇木精和伊紅(國藥集團化學有限公司，中國)，多聚甲醛(國藥集團化學有限公司，中國)，熒光實時定量PCR試劑盒(新英格蘭生物實驗室，美國)，Nrf2、HO-1和NQO-1引物(生工生物工程股份有限公司，中國)。

1.4 實驗分組和染毒方案

將24只Balb/c小鼠隨機分為4組，每組6只，分別為：(1)生理鹽水對照組(Control)；(2)褪黑素對照組(MT)；(3)臭氧暴露組(2.14 mg·m-3O3)；(4)臭氧暴露+褪黑素保護組(2.14 mg·m-3O3+MT)。連續(xù)進行7 d，每天上午8:00到11:00對臭氧暴露組與臭氧暴露+褪黑素保護組小鼠進行2.14 mg·m-3的臭氧暴露，臭氧由便攜式臭氧發(fā)生器產(chǎn)生，根據(jù)便攜式臭氧檢測儀調(diào)節(jié)進氣流量；對照組小鼠暴露于潔凈空氣。臭氧暴露后對MT組和2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠按5 mg·kg-1濃度口服MT保護劑，連續(xù)進行7 d。臭氧暴露濃度2.14 mg·m-3是參考已發(fā)表以及本課題組前期實驗結(jié)果制定的[17-19]。

1.5 小鼠肺泡灌洗液的提取

滅菌手術剪剝離小鼠頸部氣管至清晰暴露，氣管上段橫切剪一個0.1 cm左右小口，將氣管插管插入到小鼠氣管中固定，按壓小鼠肺部以排除其肺部空氣。分別注入1、0.8和0.8 mL生理鹽水至氣管插管中，輕輕揉壓小鼠肺部，使生理鹽水充分接觸肺部后緩慢回收3次肺泡灌洗液(BALF)保存。

1.6 肺組織勻漿制備

用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗取出的小鼠肺組織，用吸水紙吸干后稱重，放入滅菌的2 mL玻璃勻漿器(上海信裕生物科技有限公司，中國)中，加入預冷的PBS制備成10%的肺組織勻漿液，8 000 ×g、4 ℃離心10 min，取上清分裝后置于低溫環(huán)境保存。

1.7 小鼠肺組織病理切片

取部分肺組織，用4%多聚甲醛固定48 h，脫水后進行石蠟切片(5 μm)與蘇木精-伊紅染色(H&E stain)，于DM4000B光學顯微鏡(徠卡微系統(tǒng)有限公司，德國)下觀察肺組織切片染色結(jié)果，并拍照分析。

1.8 各項生物學指標的測定

小鼠肺泡灌洗液細胞因子包括IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的測定，均采用商用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒進行測定，按照ELISA試劑盒的說明書進行操作。

還原型谷胱甘肽(GSH)含量測定：2-硝基苯甲酸(DTNB)可以在黑暗的條件下與GSH反應形成黃色化合物1,3,5-三硝基苯(TNB)，在412 nm波長處測定吸光值，同時采用GSH標準品制作標準曲線，使用標準曲線計算GSH的含量。使用改良的BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定樣品蛋白質(zhì)濃度。

硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛(MDA)含量：MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。取200 μL肺組織勻漿液，加入800 μL質(zhì)量分數(shù)為0.6%的TBA溶液，沸水浴15 min后，8 000 ×g、4 ℃下離心10 min，取上清液200 μL于酶標板，分別在450、532和600 nm波長下測定吸光度，按照公式CMDA=(6.45(OD532 nm-OD600 nm)-0.56OD450 nm)/Cprotein，計算出MDA含量(μmol·g-1protein)。樣品蛋白質(zhì)濃度使用改良的BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定。

目的基因mRNA表達測定：Trizol法提取總mRNA，對mRNA含量及純度進行測定。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明建立反應體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)目的基因引物進行RT-qPCR測定，最后采用2-△△CT法分析目的基因表達情況。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR測試的引物序列Table 1 Primer sequence for RT-qPCR

1.9 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標準偏差表示，利用Graph Pad8.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖，組間各指標比較均采用單因素方差分析，隨后進行Holm-Sidak多重比較檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠肺組織病理學改變

如圖1所示，與對照組相比，2.14 mg·m-3O3組小鼠氣道發(fā)生了明顯的重塑現(xiàn)象，包括氣道壁增厚，氣道腔變得狹窄，并且炎細胞浸潤顯著性增加；與2.14 mg·m-3O3組相比，2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠炎細胞浸潤和氣道重塑現(xiàn)象均顯著減輕。

圖1 不同處理組小鼠肺組織蘇木精-伊紅染色圖注：MT表示褪黑素；(a)對照組(生理鹽水組)，(b) MT(5 mg·kg-1)處理組，(c) 2.14 mg·m-3 O3處理組，(d) 2.14 mg·m-3 O3+MT(5 mg·kg-1)處理組。Fig. 1 H&E stain of lung section of mice in different treatment groupsNote: MT stands for melatonin; (a) control group (saline group), (b) MT (5 mg·kg-1) treatment group, (c) 2.14 mg·m-3 O3 treatment group, (d) 2.14 mg·m-3 O3+MT (5 mg·kg-1) treatment group.

2.2 小鼠肺組織細胞因子含量的變化

如圖2所示，與對照組相比，MT處理組并沒有引起小鼠肺組織中IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的含量發(fā)生顯著性改變；2.14 mg·m-3O3組的IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的含量增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與2.14 mg·m-3O3組相比，2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠肺組織IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 小鼠肺泡灌洗液細胞因子含量注：**表示P<0.01，與生理鹽水組相比；##表示P<0.01，與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 2 Cytokine concentration in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of miceNote: **represents P<0.01, compared with the control group; ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

2.3 小鼠肺組織GSH和MDA含量的變化

如圖3所示，與對照組相比，2.14 mg·m-3O3組的GSH含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；MDA含量顯著性升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MT組GSH和MDA含量無明顯改變。與2.14 mg·m-3O3組相比，2.14 mg·m-3O3+MT組肺組織GSH含量上升，MDA含量下降，且均具有顯著性差異(P<0.01)。

圖3 小鼠肺組織谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對照組相比；##表示P<0.01，與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 3 The content of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in mice lungNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01, compared with the control group; ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

2.4 Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA相對表達量的變化

如圖4所示，與對照組相比，2.14 mg·m-3O3組小鼠肺部Nrf2、HO-1和NQO-1的mRNA相對表達量降低，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。MT單獨作用并不會造成肺組織中Nrf2、HO-1和NQO-1表達量發(fā)生改變；與2.14 mg·m-3O3組相比，2.14 mg·m-3O3+MT組的小鼠肺組織Nrf2、NQO-1和HO-1的表達量都發(fā)生上調(diào)，且均具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。

圖4 Nrf2與抗氧化基因NQO-1和HO-1的表達注：Nrf2代表核因子-E2相關因子2基因，HO-1代表血紅素加氧酶1基因，NQO-1代表NADPH:醌氧化還原酶1基因；**表示P<0.01，與生理鹽水組相比，#表示P<0.05、##表示P<0.01，與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 4 Expression of Nrf2 and antioxidant genes NQO-1 and HO-1Note: Nrf2 stands for nuclear factor E2-related factor 2; HO-1 stands for heme oxygenase 1 gene; NQO-1 stands for NADPH:quinone redox enzyme 1 gene; **represents P<0.01, compared with the control group; # represents P<0.05, ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

3 討論(Discussion)

本研究使用Balb/c小鼠，通過構建臭氧急性暴露小鼠模型，探究抗氧化劑對臭氧誘發(fā)肺組織損傷的拮抗作用。研究結(jié)果表明，臭氧暴露后模型小鼠肺組織炎癥細胞浸潤加劇，氣道重塑，IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A等多種細胞因子的表達升高，同時，抗氧化元件Nrf2及其下游抗氧化酶mRNA表達下調(diào)，出現(xiàn)更為嚴重的肺組織氧化損傷。更為重要的是，通過抗氧化劑MT的使用，模型小鼠肺組織氧化應激水平顯著降低。同時，拮抗了臭氧暴露對小鼠肺組織造成的炎癥損傷以及病理學改變。

氧化損傷是機體氧化還原平衡被打破向氧化水平升高方向轉(zhuǎn)化后造成的細胞和組織的損傷，在各類過敏性疾病的發(fā)病過程中都起著重要作用[20]。氧化應激是多種病理損傷的關鍵因素，高水平的氧化應激與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)和細胞膜的損傷有關。臭氧作為具有高度活性的氧化劑，可通過產(chǎn)生ROS導致細胞毒性[21]，造成組織出現(xiàn)不同程度的損傷[20,22]。體內(nèi)具有可以清除ROS的還原性多肽如GSH，它的消耗可以反映機體氧化還原平衡被打破的程度[23]。ROS過量后會造成對細胞和組織中脂質(zhì)物質(zhì)的氧化，而MDA則是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。本研究表明，臭氧暴露后肺組織勻漿中MDA含量的上升、GSH含量的下降，表明小鼠肺部氧化還原平衡被打破，造成了明顯的氧化損傷。此外，小鼠肺組織中的細胞因子IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量顯著上升表明了臭氧暴露在小鼠模型中引發(fā)了明顯的炎癥反應。H&E染色也發(fā)現(xiàn)臭氧暴露后小鼠氣道出現(xiàn)重塑和明顯的炎細胞浸潤。

褪黑素是松果體的一種激素，也存在于許多的植物中，該化合物具有多種有利的生物學和治療活性，例如用于抗氧化劑、抗炎劑、抗腫瘤劑、抗糖尿病藥和心臟保護劑的生產(chǎn)[24-25]。Ding等[26]的研究表明，在實驗性腦外傷中，褪黑素可刺激抗氧化酶活性并降低氧化應激效應。本研究擬通過口服暴露褪黑素減輕臭氧暴露對小鼠肺部造成的損傷。研究結(jié)果表明，褪黑素處理后，臭氧暴露組小鼠肺組織MDA含量顯著性下降，GSH含量顯著性上升；且肺泡灌洗液中細胞因子IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量也顯著性下降。這表明，褪黑素的使用不僅可以降低肺組織中的氧化損傷，還可以抑制炎癥反應，減輕肺組織病理學的改變。Nrf2是氧化應激調(diào)節(jié)中的一種強大的氧化還原傳感器，也是啟動許多抗氧化基因的基本要素[27]。在本實驗中，沒有經(jīng)過臭氧暴露的小鼠由于體內(nèi)的氧化還原處于平衡狀態(tài)，所以MT的單獨作用并不會引起Nrf2的活化及其相關抗氧化基因HO-1和NQO-1的表達。但是，當臭氧暴露后，肺組織中的氧化還原平衡被打破，此時MT可以通過激活Nrf2通路實現(xiàn)其抗氧化功能。

綜上所述，臭氧急性暴露能顯著增加小鼠肺組織中的氧化應激和炎癥水平，造成肺組織病理學改變和損傷；而抗氧化劑的使用可增加Nrf2及其下游抗氧化酶的表達，有效降低臭氧暴露后小鼠肺組織氧化應激水平，拮抗臭氧對小鼠肺組織的炎癥損傷，進一步驗證了臭氧暴露引起的肺部損傷是通過氧化性損傷機制介導的。