趙 霞，張子強，夏振遠，Kyu Kyu Thin，郭鶴寶，何山文，高菊生，4*，張曉霞*

（1．中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2．北京城市學院生物醫(yī)藥學部，北京 100083；3．云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，云南 昆明 650021；4．中國農(nóng)業(yè)科學院衡陽紅壤實驗站，湖南 祁陽 426182）

種子的生理生態(tài)學和病理學相關研究表明，植物種子內(nèi)富含微生物種群［1-2］。利用可培養(yǎng)方法，在水稻、玉米、大麥、苜蓿等25種植物中，發(fā)現(xiàn)有4個門131個屬的種子內(nèi)生細菌，其中Proteobacteria為最主要的類群，其它依次為Actinobacteria，Bacteroidetes和 Firmicutes［3］。在屬水平，Bacillu，Pseudomonas，Paenibacillus，Micrococcus，Staphylococcus，Pantoea等類群最為常見。近年來高通量測序技術應用到種子微生物的研究中，使得種子中微生物多樣性得到進一步的認識。16S rRNA高通量測序發(fā)現(xiàn)種子中的主要類群與可培養(yǎng)法一致，為Proteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes和Firmicutes，同時還有一些新類群如Acidobacteria，F(xiàn)usobacteria，Chlamydiae和 Gemmatimonadetes［4-7］。種子內(nèi)生菌也顯示出生物防治和植物促生的功能，如固氮、溶磷、分泌生長素（IAA）和嗜鐵素以及ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）脫氨酶活性等［8-10］。此外，種子內(nèi)生菌對其宿主植物具有抗致病菌、抗動物攝食等作用［11］，可有效提高種子萌發(fā)率、幼苗存活率、幼苗根長和苗高、生物量積累等［12］。當植物種子落入土壤后，在萌發(fā)過程中，還會通過特定機制招募特定微生物在其表面聚集，以幫助種子萌發(fā)，防止退化或被捕食［13］。種子微生境目前研究較少，近年來因其作為有益微生物的儲庫和載體的潛力而備受關注［14］。

綠肥作為一種傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)技術，應用歷史悠久。在化肥大規(guī)模應用之前，是增加土壤養(yǎng)分供應的主要來源之一。我國是世界上種植綠肥面積最廣的國家。據(jù)不完全統(tǒng)計，19世紀中期，全國綠肥種植面積有173萬hm2，隨后逐步增加。到20世紀80年代初期，種植面積穩(wěn)定在1 000萬hm2左右，但到80年代中后期，由于化肥的推廣和使用，綠肥生產(chǎn)開始出現(xiàn)滑坡，到90年代初期種植面積劇減［15-16］。雖然化肥在一定程度上提高了作物的產(chǎn)量，但由于化學合成物質(zhì)在農(nóng)田的大量使用嚴重改變了土壤原有的微生物組成和生物地球化學循環(huán)［17-18］。給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境帶來了一系列的負面作用［19-21］，成為進一步提高作物產(chǎn)量及質(zhì)量的重要障礙。而種植綠肥不僅能為土壤提供豐富的養(yǎng)分，控制植物病蟲害的發(fā)生［22-23］，還可以促進土壤微生物的活動［24-26］，具有顯著的土壤增肥功能［27］。實驗室前期工作已證實長期水稻-稻-綠肥輪作可以顯著改變水稻根際和根內(nèi)生微生物群落的組成結構［28-29］。本研究進一步探討了綠肥（紫云英）輪作對水稻種子內(nèi)生細菌微生物群的影響與功能。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

長期綠肥與水稻輪作試驗田位于湖南省祁陽縣農(nóng)業(yè)部紅壤生態(tài)環(huán)境重點田間監(jiān)測試驗站（26°45′42″N，111°52′32″E）。1982～ 2012年，進行稻-稻-冬閑（RR-WF）和稻-稻-紫云英（RR-MV）輪作。每個處理重復3次，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積37.5 m2（2.5 m×15.0 m），各小區(qū)之間由60 cm水泥埂隔開。每季早稻和晚稻的使用總肥料（基肥+追肥）包括N（153.0 kg/hm2），P2O5（84.0 kg/hm2）和K2O（129.0 kg/hm2）。復合肥［N（84.0 kg/hm2），P2O5（84.0 kg/hm2） 和K2O（84.0 kg/hm2）］用作基肥，N（69.0 kg/hm2）和K2O（45.0 kg/hm2）用作追肥。移栽水稻前施用基肥，水稻移栽6～10 d后追肥。在晚稻收獲前10～15 d，播種綠肥紫云英種子（播種量為7.5 kg/hm2）。種植綠肥的小區(qū)在次年早稻移栽前15 d將鮮草全部翻入各自小區(qū)內(nèi)。每季除稻茬外，其他秸稈全部移走。冬種綠肥不再施肥。2013年10月，每塊地隨機選取3個點采集水稻種子樣品，風干后，4℃冷藏保存。

1.2 水稻種子表面殺菌和細菌分離培養(yǎng)

根據(jù)Sun等［30］的方法對水稻種子進行表面殺菌：兩個處理各選取1 g種子，先用無菌水沖洗一次，然后分別浸入70%酒精和新鮮NaClO溶液（2.5%可用Cl-）中各3和5 min，再浸入70%酒精30 s，最后用無菌水清洗5次。將種子輕輕在TSA平板上按壓翻滾以檢查表面殺菌效果。將表面殺菌后的樣品在裝有少量無菌石英砂的研缽中研磨至粉末，然后用無菌水稀釋成10-1、10-2和10-3的懸浮液。3個梯度各吸取100 μL分別在TSA［31］（Difico），1/4 R2A［32］（Difico） 和 Ashby［33］無 氮培養(yǎng)基（蔗糖20 g，K2HPO40.1 g，KH2PO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.01 g，F(xiàn)eCl30.01 g，Na2MoO4·2H2O 0.002 g，1 L水）上進行涂布，每種平板3個重復。所有平板28℃下培養(yǎng)3 d。挑取每個處理的1/4 R2A平板上的所有菌落，并從其他平板上挑取大小和顏色不同的菌落進行劃線純化。所有純化后的菌株通過冷凍干燥法在4℃儲存。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用DNA提取試劑盒（Transgen，China）提取細菌DNA（具體步驟參照試劑盒說明）。根據(jù)Lane［34］， 使 用 通 用 引 物 27F 和 1492R 進 行 16S rRNA基因的擴增，PCR產(chǎn)物送生物公司測序。測序結果使用EzTaxon進行序列比對［35］；系統(tǒng)發(fā)育樹由 MEGA 6.0 軟件構建［36］。

1.4 檢測分離菌株的植物促生功能

在Pikovskaya培養(yǎng)基上進行菌株溶磷活性的檢測［37］；在含有100 μg/mL L-色氨酸的TSB培養(yǎng)基接種細菌并培養(yǎng)48 h，參照Glickmann等［38］的方法檢測懸浮液中IAA含量；參照Machuca等［39］的方法檢測菌株是否產(chǎn)鐵載體。

2 結果與分析

2.1 可培養(yǎng)種子內(nèi)生菌的數(shù)量

本研究使用3種不同的培養(yǎng)基估測水稻種子內(nèi)生細菌的數(shù)量。平板計數(shù)結果如圖1所示：3種不同培養(yǎng)基的計數(shù)結果均表明長期綠肥輪作顯著增加水稻種子內(nèi)生細菌的數(shù)量；同時綠肥輪作系統(tǒng)收獲的水稻種子內(nèi)生菌對培養(yǎng)基有不同的偏好：長期綠肥輪作R-R-MV在TSA上觀察到的內(nèi)生細菌數(shù)量最高，達2.87×106CFU/g，而冬閑R-R-WF在1/4 R2A上檢測的細菌數(shù)量最高，為2.33×106CFU/g，說明R-R-MV和R-R-WF的種子內(nèi)生細菌間存在不同的代謝類型。

圖1 梯度稀釋涂布并計數(shù)的方法檢測水稻種子內(nèi)生細菌的數(shù)量

2.2 可培養(yǎng)內(nèi)生細菌系統(tǒng)發(fā)育分析

據(jù)梯度稀釋平板細菌生長情況，選擇1/4 R2A平板上所有菌落，和其他兩種培養(yǎng)基上不同菌落形態(tài)不同顏色的細菌進行分離培養(yǎng)。結果R-R-WF種子分離到42株內(nèi)生細菌，R-R-MV種子分離到66株內(nèi)生細菌，通過16S rRNA基因序列擴增并測序，約700 bp序列上傳至Eztaxon（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）比對分析；序列提交GenBank并獲得登錄號，圖2、3括號中的數(shù)字即為相應菌株的GenBank登錄號；使用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2、3）。結果表明，42株R-R-WF內(nèi)生菌分別屬于9屬12種，66株R-R-MV內(nèi)生菌屬于15屬21種。

R-R-WF和R-R-MV內(nèi)生菌的優(yōu)勢門均為γ-Proteobacteria，分別占60%和50%。α-Proteobacteria（24%）是R-R-WF的次要優(yōu)勢群，其次是Actinobacteria和Firmicutes。而Firmicutes（22%）是R-R-MV的次要優(yōu)勢門，其次是Actinobacteria（15%）和α-Proteobacteria（9%）。而β- Proteobacteria（5%）僅在R-R-MV中檢測到。

圖2 R-R-WF水稻種子分離到的內(nèi)生細菌16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

在屬水平上，Pseudomonas（28.57%）和Xanthomonas（26.19%）是R-R-WF中的優(yōu)勢屬，其次是Sphingomonas（16.67%）。 此外，在R-R-WF中還發(fā)現(xiàn)Bacillus，Rhizobium，Micrococcus，Methylobacterium，Pantoea和 Microbacterium。與R-R-WF相比，Pantoea（27.94%）是R-R-MV中的優(yōu)勢屬，其次是Pseudomonas（14.71%），Paenibacillus（13.24%）。Paenibacillus，Curtobacterium，Acidovorax，Rothia，Acidovorax，Kocuria 和 Staphylococcus是R-R-MV中的特有類群（表1）。

圖3 R-R-MV水稻種子分離到的內(nèi)生細菌16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 水稻種子內(nèi)生細菌在屬水平的相對豐度（R-R-WF：稻-稻-冬閑，R-R-MV：稻-稻-紫云英）（%）

2.3 種子內(nèi)生菌植物促生特性檢測

基于內(nèi)生細菌的來源與分類地位，本研究選擇31株菌檢測植物促生特性（表2）。其中，14株（ 屬 于Bacillus，Curtobacterium，Kocuria，Microbacterium，Paenibacillus，Pantoea，Pseudomonas，Rhizobium，Rothia和Sphingomonas）可以分泌生長素IAA；10株（屬于Bacillus，Curtobacterium，Microbacterium，Pseudomonas，Sphingomonas和 Xanthomonas）在CAS平板上的菌落周圍產(chǎn)生橙色暈圈，表明這些菌株具有產(chǎn)鐵載體的活性；9株可以溶解有機和無機磷酸鹽（菌落周圍可以觀察到透明圈），測量菌落直徑（n）和暈圈直徑（z），計算z/n值，發(fā)現(xiàn)在無機磷酸鹽培養(yǎng)基上，菌株 RZ27、TZ26和RZ4的z/n大于2.0，表明這些菌株具有強溶解無機磷的能力［40］。此外，8株菌可溶解有機磷酸鹽，但不能溶解無機磷酸鹽。TZ22、TD10和AD1具有本研究中所檢測的植物促生的所有特征，但也有9株沒有檢測到任何促生作用。

表2 水稻種子細菌的溶磷酸鹽、IAA和產(chǎn)鐵載體促生能力的檢測

3 討論

3.1 長期綠肥輪作下，水稻種子內(nèi)生細菌變化情況及其與根內(nèi)生細菌的關系

本試驗前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長期紫云英綠肥輪作（R-R-MV）會顯著改變水稻根內(nèi)細菌的多樣性和組成［28］。本研究通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法證明長期紫云英綠肥輪作對水稻種子內(nèi)生細菌的影響。結果表明內(nèi)生細菌數(shù)量顯著增加，多樣性也明顯增加，主要類群發(fā)生變化?？梢婇L期的稻-稻-綠肥輪作不僅會改變水稻根內(nèi)生細菌［28］，也改變了種子內(nèi)生菌的數(shù)量與多樣性。與Zhang等［28］描述的根內(nèi)生細菌相比，Pantoea，Pseudomonas，Xanthomonas和Sphingomonas是種子內(nèi)生菌的主要類群，但在水稻根內(nèi)豐度較低。Herbaspirillum和Cedecea是根內(nèi)生細菌的優(yōu)勢屬，但種子中并沒有分離到。一些豐度較低的屬（Methylobacterium，Curtobacterium，Rothia和Kocuria）僅在種子中分離到。Mano 等［41］根據(jù)大量關于水稻根和種子內(nèi)生細菌的報道也得出類似的結論，水稻種子內(nèi)的固有細菌較少，不同植物組織其菌群結構也不同。因此，本研究推測種子內(nèi)生細菌受根內(nèi)生菌和其他環(huán)境因素的影響。

3.2 水稻種子內(nèi)生細菌的組成及其功能

Pseudomonas，Xanthomonas，Sphingomonas和Pantoea是本研究檢測到的種子內(nèi)生細菌優(yōu)勢屬。此外，水稻種子中也存在非優(yōu)勢屬，例如Paenibacillus，Curtobacterium，Acidovorax，Kocuria，Staphylococcus和 Rothi。Mano等［41］報道了水稻種子內(nèi)生細菌主要包含Pantoea，Herbaspirillum，Metylobacterium，Klebsiella，Acidovorax，Bacillus，Curtobacterium，Micrococcus，Paenibacillus，Sphingomonas，Xanthomonas，Ochorbacterium，Pseudomonas等。過去基于16S rRNA Illumina測序發(fā)現(xiàn)Pantoea，Acinetobacter，Xanthomonas，Bacillus，F(xiàn)lavobacterium，Stenotrophomonas，Neorhizobium和 Pseudomonas是水稻種子中的共有優(yōu)勢屬［7］。因此，本研究分離的細菌大多數(shù)是典型的種子內(nèi)生細菌。

Pantoea是水稻種子內(nèi)生細菌的主要種類之一，表明Pantoea和水稻之間有很強的親和力。研究報道玉米種子內(nèi)生細菌最豐富的也是Pantoea［42］，Pantoea具有固氮、分泌植物激素的功能［43］，本研究發(fā)現(xiàn)Pantoea具有產(chǎn)IAA、溶解無機和有機磷酸鹽的能力。

Pseudomonas也是種子內(nèi)生細菌的主要組成之一。本研究選擇兩株Pseudomonas來檢測植物促生功能，發(fā)現(xiàn)AD1能夠產(chǎn)IAA、鐵載體，并可以溶解無機和有機磷酸鹽（表2）。此外，Pseudomonas也是研究細菌與植物互作的模式菌［44］，如Pseudomonas fluorescens可以通過分泌抗生素和競爭營養(yǎng)，使植物免受致病菌的侵害［45］，并增加作物產(chǎn)量［46］。

本研究發(fā)現(xiàn)一些低豐度細菌對植物具有潛在的有益功能，如表2所示的Bacillus，Paenibacillus，Methylobacterium和Sphingomonas。這些菌株在不同的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)與植物有密切的關系。Methylobacterium具有很強的抗逆性，能夠合成植物激素并刺激種子萌發(fā)［47］。Curtobacterium是一類典型的種子共生細菌，能夠保護植物免受Erwinia的攻擊［48-49］。Bacillus可溶解無機或有機磷酸鹽，分泌IAA并產(chǎn)生抗真菌代謝物以抑制致病菌［50-51］。

4 結論

本研究的主要結論如下：（1）長期綠肥輪作改變了水稻種子內(nèi)生細菌的群落結構和數(shù)量；（2）種子選擇并積累了一些特定的細菌，如Pseudomonas，Xanthomonas，Sphingomonas和 Pantoea；（3） 大 多數(shù)分離菌株具有植物促生功能，表明它們與植物有密切關系。