黃文茂，易 倫，彭思云，黃承森，程代松，韓麗珍*

（1．貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；2．貴州遵義市播州區(qū)蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，貴州 遵義 563100；3．貴州遵義山那邊生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，貴州 遵義 563112）

辣椒（Chilli）是一種喜中偏酸性砂壤植物［1］，是世界上最重要的蔬菜作物之一，因其富含維生素C和辛辣調(diào)味功能，所以在食材來(lái)源上備受關(guān)注［2-3］。近年來(lái)市場(chǎng)對(duì)辣椒需求量的激增，大量施用化學(xué)肥料成為了最直接的增產(chǎn)措施，但這也導(dǎo)致了種植成本投入增加、環(huán)境污染、土壤板結(jié)等一系列問(wèn)題，同時(shí)還降低了果實(shí)的品質(zhì)［4］。隨著農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的社會(huì)意識(shí)不斷增強(qiáng)，傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)栽培措施（如化肥、化學(xué)殺蟲(chóng)劑等）惡化生態(tài)環(huán)境所帶來(lái)的負(fù)面影響開(kāi)始引起人們的重視［5］。因此，尋求一種能夠有效減少化肥用量、環(huán)境友好且符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展要求的新型肥料已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR）是指可直接或間接地促進(jìn)植株生長(zhǎng)的微生物類群，廣泛分布于植物根圍土壤中［6］。PGPR的促生機(jī)制有多種，如改變土壤中礦物元素形態(tài)、分泌植物生長(zhǎng)激素、修復(fù)污染土壤、生防效應(yīng)等，近年來(lái)已被開(kāi)發(fā)成不同制劑施加到各類作物上，并取得了預(yù)期的效果。PGPR制成的各種菌肥在替代化肥、農(nóng)藥及其他補(bǔ)充劑等化學(xué)制劑上所表現(xiàn)出來(lái)的可行性，表明其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力［7］。

目前國(guó)內(nèi)外較多地報(bào)道了PGPR菌肥在實(shí)驗(yàn)室或溫室條件下對(duì)辣椒的促生效果［8-9］。但在田間復(fù)雜環(huán)境下，鮮有關(guān)于PGPR菌肥對(duì)辣椒的促生作用及其對(duì)植株根際土壤微生物結(jié)構(gòu)、數(shù)量變化影響的研究。因此，本文以實(shí)驗(yàn)室前期從茶樹(shù)根際分離篩選到、且具有優(yōu)良促生能力的4株P(guān)GPR菌株制成液體復(fù)合菌劑，在田間條件下對(duì)辣椒進(jìn)行促生研究，探究PGPR復(fù)合菌劑對(duì)辣椒的促生效果，并對(duì)根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)與數(shù)量進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，旨在為辣椒PGPR復(fù)合菌劑的進(jìn)一步研發(fā)和推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試驗(yàn)材料

供試PGPR菌株是由貴州大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離篩選得到的4株茶樹(shù)根際促生菌菌株：HGD3（Pseudomonas putida）、HGD12（Bacillus flexus）、HP9（Bacillus velezensis）、HP10（Bacillus firmus）。試驗(yàn)所用辣椒品種為艷椒425。

1.2 試驗(yàn)大田概況

試驗(yàn)地點(diǎn)位于貴州省遵義市播州區(qū)楓香鎮(zhèn)楓元村堰塘組（E106°34′23″，N27°35′29″），所處緯度較低，常年氣候溫涼濕潤(rùn)，雨量充沛且光照充足。試驗(yàn)大田土壤類型為水稻土，土壤理化指標(biāo)如下：有機(jī)質(zhì)含量36.57 g/kg，全氮2.16 g/kg，全磷1.28 g/kg，全鉀13.53 g/kg，堿解氮164 mg/kg，有效磷74 mg/kg，速效鉀150 mg/kg。前茬作物為豇豆和蠶豆。

1.3 PGPR復(fù)合菌劑的制備

將甘油保存的PGPR菌種HGD3、HGD12、HP9、HP10按1%比例分別接種于LB（Luria-bertani）液體培養(yǎng)基中，180 r/min、30℃搖床培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化，活化菌液分別按5%比例轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培24 h，培養(yǎng)液于7 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用適量新鮮培養(yǎng)基將菌體重懸至細(xì)胞濃度為1010cfu/mL，等量混合4株P(guān)GPR菌液備用。使用時(shí)進(jìn)行25倍稀釋。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

共設(shè)計(jì)了3個(gè)試驗(yàn)處理：100%化肥組為對(duì)照（CK）、100%化肥+PGPR復(fù)合菌劑（CF1-PGPR）、80%化肥+PGPR復(fù)合菌肥（CF2-PGPR）。其中，100%化肥施用標(biāo)準(zhǔn)為：化肥（總養(yǎng)分≥45.0%，N-P2O5-K2O：15-15-15）750 kg/hm2， 磷酸二銨（總養(yǎng)分≥64.0%，N-P2O5-K2O比例為18-46-0）300 kg/hm2。PGPR復(fù)合菌劑的處理分為3次，分別于移栽后7、30及60 d進(jìn)行灌根，每株100 mL自來(lái)水稀釋的菌液（實(shí)際含PGPR菌液4 mL）。

3個(gè)試驗(yàn)處理中，每處理為一個(gè)試驗(yàn)大區(qū)，大區(qū)長(zhǎng)24 m，寬2.8 m，面積為67.2 m2；每個(gè)大區(qū)等分為3個(gè)重復(fù)小區(qū)，小區(qū)長(zhǎng)8 m，寬2.8 m，面積為22.4 m2，相鄰大區(qū)間隔70 cm，每大區(qū)分為兩壟，壟間距60 cm，壟寬50 cm，每壟種植兩行，采用錯(cuò)位種植法進(jìn)行種植，株間距50 cm。起壟時(shí)進(jìn)行化肥施加，在起壟工作結(jié)束后用隔離帶分別將各大區(qū)、各重復(fù)小區(qū)進(jìn)行隔離標(biāo)識(shí)。育苗、移栽、種植均按常規(guī)措施進(jìn)行。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 辣椒農(nóng)藝性狀及生育指標(biāo)的測(cè)定

在始花期（移栽后30 d）、坐果期（移栽后60 d）、盛果期（移栽后90 d）分別從各重復(fù)小區(qū)里隨機(jī)選取10株辣椒測(cè)定株高和莖粗；測(cè)定了單株辣椒的掛果數(shù)、產(chǎn)量，并對(duì)總產(chǎn)量進(jìn)行了最終統(tǒng)計(jì)。

1.5.2 根際土壤采集及土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測(cè)定

辣椒根際土壤的采集參照Courchesne等方法［10］，前兩次土樣的采集時(shí)間為菌劑第一次灌根20 d后，第二次灌根30 d后進(jìn)行，分別對(duì)應(yīng)于始花期（移栽后30 d）和坐果期（移栽后60 d）；第三次土樣的采集時(shí)間為移栽后90 d，對(duì)應(yīng)于盛果期。以稀釋平板計(jì)數(shù)法對(duì)根際土壤微生物數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定采用LB固體培養(yǎng)基［11］、放線菌為改良高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基［12］、真菌為氯霉素-孟加拉紅固體培養(yǎng)基［13］；溶磷菌數(shù)量測(cè)定采用NBRIP固體培養(yǎng)基［14］、固氮菌為阿須貝氏固體培養(yǎng)基［15］、解鉀菌為解鉀硅酸鹽細(xì)菌固體培養(yǎng)基［16］。

1.6 數(shù)據(jù)分析及作圖

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0進(jìn)行one way-ANOVA統(tǒng)計(jì)處理，用Office 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，輸出結(jié)果為各大區(qū)重復(fù)小區(qū)中所測(cè)得平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGPR復(fù)合菌劑對(duì)辣椒生長(zhǎng)的影響

測(cè)定了辣椒始花期、坐果期和盛果期的株高（表1），結(jié)果表明，在始花期，100%化肥+PGPR菌劑和80%化肥+PGPR菌劑的兩個(gè)處理均顯著促進(jìn)了辣椒植株的增高，與100%化肥組（CK）相比，分別增加了11.19%和7.34%；在坐果期，處理組的株高分別增加了7.06%、11.08%；在盛果期，處理組的株高分別增加了8.51%和12.63%，且80%化肥+PGPR菌劑處理較CK呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

對(duì)辣椒的莖粗測(cè)定結(jié)果顯示，100%和80%化肥配施PGPR復(fù)合菌劑處理的辣椒莖粗均明顯增加（表1），且達(dá)到顯著性差異水平（P＜0.05）。相對(duì)于CK，經(jīng)100%化肥+PGPR菌劑和80%化肥+PGPR菌劑處理后，辣椒莖粗在始花期分別增加了11.19%和11.13%，坐果期和盛果期莖粗增長(zhǎng)明顯，分別較對(duì)照（CK）增加了20.7%、22.01%和21.14%、22.14%。但從坐果期到盛果期的測(cè)定結(jié)果表明，這個(gè)時(shí)期主要是辣椒的生殖生長(zhǎng)階段，株高和莖粗基本未發(fā)生變化。

表1 PGPR復(fù)合菌劑對(duì)辣椒植株生長(zhǎng)的影響 （cm）

2.2 PGPR菌劑對(duì)辣椒果實(shí)質(zhì)量、坐果及產(chǎn)量的影響

比較了不同處理組的單株掛果數(shù)（表2），結(jié)果顯示添加復(fù)合菌劑的兩種處理均可以顯著促進(jìn)辣椒掛果（P＜0.05）。相比于100%化肥組（CK），添加了PGPR菌劑處理的辣椒掛果數(shù)增長(zhǎng)了32.17%，而80%化肥+PGPR菌劑處理對(duì)辣椒掛果具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用，較CK增加了52.55%。果實(shí)指數(shù)分析結(jié)果表明，各處理間的辣椒果實(shí)果長(zhǎng)、果徑及果形指數(shù)沒(méi)有顯著性差異（P＜0.05），表明PGPR在促進(jìn)辣椒掛果的同時(shí)，并不會(huì)對(duì)果實(shí)的品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。

單株產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果顯示，PGPR復(fù)合菌劑的灌根處理有顯著的促生效果（P＜0.05）。與對(duì)照CK相比，經(jīng)100%化肥+PGPR菌劑及80%化肥+PGPR菌劑處理后，辣椒的單株產(chǎn)量分別增加了34.14%和38.76%。施加100%化肥組（CK）收獲的鮮椒為26 804.26 kg/hm2，而添加PGPR菌劑的100%化肥組的鮮椒產(chǎn)量為35 956.16 kg/hm2，添加復(fù)合菌劑的80%化肥組的鮮椒產(chǎn)量達(dá)37 193.28 kg/hm2，分別較CK增產(chǎn)約9 150和10 390 kg/hm2。

表2 PGPR復(fù)合菌劑對(duì)辣椒果實(shí)質(zhì)量、坐果及產(chǎn)量的影響

2.3 PGPR復(fù)合菌劑對(duì)根際土壤微生物的影響

2.3.1 根際土壤中微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化

對(duì)辣椒3個(gè)時(shí)期根際土壤中微生物數(shù)量變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)（圖1），結(jié)果表明PGPR復(fù)合菌劑對(duì)辣椒根際微生物總量（細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量之和）影響顯著（P＜0.05）。在始花期，CF1-PGPR和CF2-PGPR兩種處理根際土壤中的微生物總量比CK分別增加了71.48%和47.03%，坐果期總量分別增長(zhǎng)了4倍和1倍，在盛果期微生物總量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但復(fù)合菌劑處理組仍與CK呈顯著差異。

圖1 不同處理組辣椒根際土壤微生物總量的動(dòng)態(tài)變化

2.3.2 根際土壤三大菌群數(shù)量變化

不同施肥處理對(duì)土壤中微生物的結(jié)構(gòu)和數(shù)量影響顯著。經(jīng)100%化肥+PGPR、80%化肥+PGPR的處理組中，無(wú)論是始花期、坐果期和盛果期，細(xì)菌數(shù)量均顯著增加（P＜0.05），其中后兩個(gè)處理生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)菌總數(shù)較對(duì)照增加了1倍以上，尤以100%化肥+PGPR處理更為顯著；而根際土壤中的真菌數(shù)量均低于100%化肥（CK）處理組，坐果期和盛果期的根際土壤真菌數(shù)比CK分別降低了12.14%、37.28%和83.90%、82.02%；復(fù)合菌劑對(duì)前兩個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的放線菌數(shù)量并沒(méi)有顯著影響，但導(dǎo)致了盛果期的放線菌數(shù)量顯著提高，尤以100%化肥+PGPR復(fù)合菌劑的處理更為顯著。

2.3.3 根際土壤功能微生物的變化

表3顯示了始花期、坐果期和盛果期各處理間辣椒根際土壤中溶磷菌、解鉀菌和固氮菌功能菌群的數(shù)量，不同施肥處理對(duì)根際土壤中功能微生物結(jié)構(gòu)組成影響顯著（P＜0.05）。在始花期，復(fù)合菌劑處理的辣椒根際土壤溶磷菌、解鉀菌和固氮菌數(shù)量較對(duì)照分別提高了7、18和5倍以上，其中CF2-PGPR的解鉀菌數(shù)比CF1-PGPR高出約1倍（P＜0.05），而溶磷菌和固氮菌在兩個(gè)處理組間沒(méi)有顯著性差異。在坐果期，處理組的3大類功能微生物數(shù)量顯著增加，解鉀菌和固氮菌數(shù)較同期對(duì)照分別提高了近3和22倍以上，且解鉀菌數(shù)在配施100%化肥組表現(xiàn)更為顯著，達(dá)到8倍以上。在盛果期，功能微生物數(shù)仍與對(duì)照差異顯著，100%化肥配施組的解鉀菌數(shù)較對(duì)照提高近5倍，溶磷菌、解鉀菌和固氮菌數(shù)均在PGPR復(fù)合菌劑配施100%化肥組中更高（P＜0.05）。

表3 PGPR復(fù)合菌劑處理對(duì)辣椒根際土壤功能微生物的影響 （cfu/g土壤）

3 討論

辣椒是一年生茄科辣椒屬植物，是全球廣泛種植的蔬菜經(jīng)濟(jì)作物之一，2017年我國(guó)辣椒種植面積已超過(guò)133.3萬(wàn)hm2［17］。辣椒產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展使很多學(xué)者主要致力于高產(chǎn)品種選育和肥料控釋技術(shù)的優(yōu)化，忽視了從根本上通過(guò)改善土壤條件及質(zhì)量達(dá)到提高土壤生產(chǎn)力的目的。隨著社會(huì)對(duì)發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)的重視及可持續(xù)發(fā)展意識(shí)的增強(qiáng)，使得以PGPR制成的新型生物肥料部分或逐步取代化肥成為一種可能性。例如，李娟等［18］用解磷微生物菌劑進(jìn)行油菜盆栽試驗(yàn)，氮肥和氮磷復(fù)合肥配施菌劑后油菜生物產(chǎn)量相比未施菌肥分別增加了17.91%，12.0%。Menaviolante等［19］在溫室條件對(duì)分別以粗砂土和砂壤土為基質(zhì)種植的番茄接種Bacillus subtilis BEB-13bs，番茄產(chǎn)量提高了21%和25%。本研究中，利用前期分離篩選到的PGPR菌株制備的復(fù)合菌劑對(duì)辣椒進(jìn)行灌根，促進(jìn)了辣椒株高和莖粗的增長(zhǎng)，單株掛果數(shù)、單株產(chǎn)量及總產(chǎn)量相較于單施化肥均顯著增加，其中化肥減量20%后配施PGPR復(fù)合菌劑的處理促生效果最為顯著。也有相關(guān)研究報(bào)道適當(dāng)減少化肥用量可以有效提高作物的產(chǎn)量［20］，這是因?yàn)榛柿窟m當(dāng)減少，提高了土壤中有效養(yǎng)分含量。

植物的苗期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)力的強(qiáng)弱決定了生殖生長(zhǎng)的強(qiáng)弱［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PGPR菌劑第一次灌根處理后20 d進(jìn)行辣椒生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定時(shí)，辣椒的株高和莖粗均較對(duì)照明顯增加，這為辣椒掛果數(shù)的增加和產(chǎn)量的提升奠定了基礎(chǔ)。而在辣椒的坐果期和盛果期，PGPR菌劑處理后的株高與對(duì)照并無(wú)顯著差異，莖粗則顯著高于對(duì)照，表明株高并不是辣椒產(chǎn)量提高的主要影響因素，這與劉學(xué)靜［23］研究酵素有機(jī)肥對(duì)田間辣椒產(chǎn)量的結(jié)果一致，類似的研究在番茄［24］和豇豆［25］上均得到了相同結(jié)論。因此研究以果實(shí)為最終收獲物的類似問(wèn)題時(shí)，提示株高并非評(píng)價(jià)PGPR促生效果的一個(gè)必要指標(biāo)。本研究對(duì)辣椒的果長(zhǎng)、果徑和果形指數(shù)等果實(shí)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3個(gè)指標(biāo)在處理組和對(duì)照組之間均無(wú)顯著性差異，表明PGPR促進(jìn)辣椒掛果及產(chǎn)量提高的同時(shí)，并不會(huì)造成果實(shí)品質(zhì)的下降。

根際是土壤中一個(gè)特別的區(qū)域，根際土壤微生物與植物之間的相互作用，使其與主體土壤在理化性質(zhì)和生物學(xué)特性方面有所不同［26］。研究PGPR對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征的影響具有重要意義。本研究在辣椒始花期、坐果期和盛果期對(duì)辣椒根際土壤微生物進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，PGPR復(fù)合菌劑處理后，不同時(shí)期辣椒根際土壤細(xì)菌總量和微生物總量顯著提高，真菌數(shù)量明顯降低，而放線菌數(shù)量在盛果期也顯著增加；溶磷菌、固氮菌、解鉀菌等功能微生物數(shù)量在辣椒各生育期也顯著提高。從細(xì)菌數(shù)量上來(lái)看，100%化肥配施PGPR復(fù)合菌劑相對(duì)優(yōu)于80%化肥配施PGPR復(fù)合菌劑，這可能是100%化肥添加量所引起的土壤化學(xué)成分變化不同，刺激了土壤微生物活性提高，從而引起微生物數(shù)量增加［27-28］。本研究中PGPR復(fù)合菌劑的添加顯著減少了真菌數(shù)量，這與劉方春等［29］、王其傳等［30］的研究結(jié)果一致，真菌數(shù)量雖然相對(duì)于細(xì)菌占比較少，但由于其生物量大，易引發(fā)植物病變，因此對(duì)真菌在土壤中的作用不可忽視［31-32］。放線菌作為一類重要的微生物資源，在控制植物病原菌傳播上起著重要的作用［33］。辣椒的盛果期是降雨量增多的7～9月，相關(guān)研究表明，許多植物病原菌數(shù)量（如炭疽?。┡c降雨量呈正相關(guān)性［34-35］，本研究中坐果期和盛果期根際土壤放線菌數(shù)量較對(duì)照有不同程度的增高，真菌數(shù)量明顯降低，表明PGPR復(fù)合菌劑的處理對(duì)辣椒病害防治可能具有積極作用，這與本研究發(fā)現(xiàn)整個(gè)種植期間施加復(fù)合菌劑的試驗(yàn)田病害更少的結(jié)果相符。

近年來(lái)已有大量研究報(bào)道了PGPR在田間條件下對(duì)作物的促生效果，其中許多報(bào)道指出外源PGPR可以改變根際土壤中微生物結(jié)構(gòu)和種群數(shù)量［29-30，32，36］，且總體變化表現(xiàn)為細(xì)菌數(shù)量增加，真菌數(shù)量減少，放線菌數(shù)量變化不一致，與本研究結(jié)論相同。但PGPR在田間復(fù)雜環(huán)境下的促生機(jī)制至今仍是個(gè)謎，Probanza等［37］曾提出“PGPR改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是其另一種促生機(jī)制”的假說(shuō)。劉方春等［29］研究發(fā)現(xiàn)，施加PGPR生物肥使冬棗根際土壤的微生物總量和細(xì)菌數(shù)量得到顯著提高。邱勤等［38］在研究PGPR對(duì)苜蓿生長(zhǎng)度土壤微生物的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種PGPR顯著促進(jìn)了土壤微生物生物量碳、氮含量的提高。由此可以推斷，本研究采用的PGPR復(fù)合菌劑對(duì)辣椒根際微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響，可能是促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)和產(chǎn)量提升的重要原因。

4 結(jié)論

通過(guò)辣椒田間促生試驗(yàn)，表明PGPR復(fù)合菌劑在田間條件下能夠顯著促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)，且增產(chǎn)效果明顯。

對(duì)辣椒根際土壤微生物的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明：PGPR復(fù)合菌劑的灌根可以顯著提高根際土壤細(xì)菌及放線菌數(shù)量，降低真菌數(shù)量，活化土壤功能菌群，對(duì)辣椒根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有較大的影響。更深入的作用機(jī)制還可通過(guò)宏基因組測(cè)序分析微生物多樣性進(jìn)行進(jìn)一步解析。

致謝：感謝遵義山那邊生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供試驗(yàn)用地，感謝貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2016級(jí)微生物學(xué)專業(yè)研究生王歡，生物技術(shù)專業(yè)2015級(jí)本科生楊志芬、吳榮菊、林佳靜及石煙祝參與研究工作。