韋亞鋒 周勇

摘 ?????要： 目前合成R-腎上腺素的方法主要是手性拆分的方法和以氨基酸為原料通過生物法制備R-腎上腺素。傳統(tǒng)的手性拆分工藝因工藝路線長(zhǎng)、拆分收率低導(dǎo)致R-腎上腺素生產(chǎn)成本高。氨基酸生物轉(zhuǎn)化法也因存在著雜質(zhì)多且生產(chǎn)成本高的問題而未被廣泛應(yīng)用。在此，建立了一種全新的生物不對(duì)稱合成方法直接制備手性藥物R-腎上腺素，以2-氯-3，4-二羥基苯乙酮為原料，經(jīng)甲胺化反應(yīng)、成鹽反應(yīng)合成得到鹽酸腎上腺酮，再經(jīng)酶不對(duì)稱催化反應(yīng)合成手性藥物R-腎上腺素。最優(yōu)工藝參數(shù)為：氮?dú)獗Ｗo(hù)下2-氯-3，4-二羥基苯乙酮和甲胺摩爾比為1∶8，生物酶的用量為鹽酸腎上腺酮重量3.3%、酶催化反應(yīng)溫度為（30±2）℃，酶催化反應(yīng)時(shí)間為24 h，制備得到的R-腎上腺素手性純度不低于99.0%。以生物不對(duì)稱法合成R-腎上腺素，避免了手性拆分步驟，縮短了工藝流程，收率顯著提高，產(chǎn)品雜質(zhì)少，方法可行，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān) ?鍵 ?詞：R-腎上腺素; 生物不對(duì)稱合成; 手性純度

中圖分類號(hào)：TQ 016???????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2020）03-0615-04

Study on Bioasymmetric Synthesis of R-Epinephrine

WEI Ya-feng¹， ZHOU?Yong²

（1.?Bengbu BBCA Medicine Science Development Co.，?Ltd.， Anhui Bengbu 233010， China;

2. COFCO Biochemistry （Anhui）?Co.，?Ltd.， Anhui Bengbu 233010， China）

Abstract： At present， the?main methods for preparing R-epinephrine are chiral separation and bioconversion with amino acid. The traditional chiral separation resolution process has high product cost due to long process route and low yield. Amino acid bioconversion method is not widely used because of the problems of high impurities and high production cost. In this paper， a new bioasymmetric synthesis method to prepare chiral drug of R-epinephrine was established. In the specific preparation process， using 3，4-dihydroxyphenacyl chloride?as raw material，adrenalone hydrochloride was synthesized by methamination reaction and salt formation reaction. And then R-epinephrine was synthesized by enzymatic asymmetric reaction. The optimal process parameters were determined as follows： the?molar ratio of 3，4-dihydroxyphenacyl chloride and methylamine 1：8，the amount of biological enzyme 3.3% of the weight of adrenalone hydrochloride， the?enzyme catalyzed reaction temperature （30±2）℃，the enzyme catalyzed reaction time 24 h. The chiral purity of R-epinephrine?prepared under above process parameters was not less than 99.0%. Using the?bioasymmetric synthesis method to prepare chiral drug of R-epinephrine?avoided?the chiral separation step?and?shorten the process flow， the yield was?obviously improved， and the impurity of the product was low. So the method is feasible， and?suitable for industrial production.

Key words： ?R-epinephrine; ?bioasymmetric synthesis; ?chiral purity

腎上腺素是人體分泌出的一種激素，它和去甲腎上腺素一樣是一種α-腎上腺素能受體激動(dòng)劑^[1]。它會(huì)使心臟收縮力上升，使心臟、肝和筋骨的血管擴(kuò)張和皮膚、黏膜的血管收縮。在腎上腺素中，存在二個(gè)對(duì)映體S-腎上腺素和R-腎上腺素，主要具有生理活性的為R-腎上腺素，其活性較S-腎上腺素強(qiáng)12倍^[2]。R-腎上腺素臨床上是用于抗休克的急救藥物，它能夠增強(qiáng)心肌收縮力，為我們?nèi)斫M織灌注源源不斷的血流。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。

合成R-腎上腺素原料藥的傳統(tǒng)工藝路線是以2-氯-3，4-二羥基苯乙酮（氯乙酰兒茶酚）為起始原料，制備出芐基腎上腺酮中間體，再經(jīng)加氫還原反應(yīng)制備R，S-腎上腺素消旋體，最后通過手性拆分得到R-腎上腺素^[3]。其合成工藝路線見圖2。

中國(guó)專利^[4]在傳統(tǒng)的工藝路線基礎(chǔ)上改進(jìn)了催化劑，通過不對(duì)稱金屬手性催化劑對(duì)芐基腎上腺酮進(jìn)行不對(duì)稱催化，然后通過加氫反應(yīng)制備了R-腎上腺素。此種金屬催化的方法也有文獻(xiàn)報(bào)道用于L-去氧腎上腺素的合成^[5]，但關(guān)鍵中間體仍然是芐基腎上腺酮。其合成工藝路線見圖3。

中國(guó)專利^[6]報(bào)道了以酪氨酸為原料，通過酪氨酸羥化酶生成3，4-二羥基苯丙氨酸，再通過L-脫羧酶作用脫去羧基形成多巴胺，進(jìn)一步通過多巴胺羥化酶得到去甲腎上腺素，最后通過苯乙醇胺-N-轉(zhuǎn)甲基酶甲基化合成腎上腺素。其合成工藝路線見圖4。

以芐基腎上腺酮為關(guān)鍵中間體經(jīng)催化加氫反應(yīng)制備消旋體腎上腺素，再經(jīng)手性拆分得到R-腎上腺素的傳統(tǒng)工藝路線，其明顯的缺點(diǎn)是工藝路線長(zhǎng)，手性拆分收率低，生產(chǎn)成本高。其改進(jìn)后的以手性金屬催化劑對(duì)芐基腎上腺酮進(jìn)行不對(duì)稱轉(zhuǎn)化的工藝，仍然存在著金屬催化劑昂貴的缺點(diǎn)。然以芐基腎上腺酮為關(guān)鍵中間體的合成工藝路線其另一個(gè)明顯的缺點(diǎn)是存在著芐基腎上腺酮和芐基腎上腺素雜質(zhì)的存在，因?yàn)榉肿咏Y(jié)構(gòu)中芐基的存在導(dǎo)致還原過程中存在難以對(duì)芐基徹底脫除的可能。而完全以酶法對(duì)酪氨酸采取生物轉(zhuǎn)化的方法制備R-腎上腺素在市場(chǎng)上并不是主流工藝。鑒于以上原因，目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上尚未有大量生產(chǎn)R-腎上腺素的生產(chǎn)企業(yè)。

針對(duì)以上合成R-腎上腺素的技術(shù)缺陷，本文創(chuàng)造性地建立一種全新的合成工藝，以腎上腺酮代替芐基腎上腺酮中間體，開展催化還原反應(yīng)，避免了芐基的引入導(dǎo)致腎上腺素產(chǎn)物中雜質(zhì)的增加。同時(shí)，以特定高選擇性的酶為催化劑，不對(duì)稱催化還原腎上腺酮，直接將其轉(zhuǎn)化為R-腎上腺素，避免傳統(tǒng)手性拆分的合成工藝路線，也克服了使用昂貴的不對(duì)稱金屬催化劑的缺點(diǎn)。

本文建立的合成工藝以2-氯-3，4-二羥基苯乙酮為起始原料，經(jīng)甲胺化反應(yīng)制備鹽酸腎上腺酮中間體，再經(jīng)酶法不對(duì)稱合成制備R-腎上腺素。其中甲胺化反應(yīng)采用在無氧環(huán)境下反應(yīng)，顯著提高了本步驟的收率，酶法不對(duì)稱合成所用的酶為具有對(duì)腎上腺酮高度選擇性的羰基還原脫氫酶，鹽酸腎上腺酮的不對(duì)稱轉(zhuǎn)化率幾乎達(dá)100%。本文所述合成R-腎上腺素的方法目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，具體工藝路線見圖5。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?主要儀器與試劑

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：型號(hào)DF-101S;

2-氯-3，4-二羥基苯乙酮：杭州康多醫(yī)藥化工有限公司，純度≥99.0%; 一甲胺乙醇溶液：衢州奧凱化工有限公司，濃度30%; EPI酶：自制;其余試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

1.2 ?合成方法

1.2.1 ?化合物1（腎上腺酮）和化合物2（鹽酸腎上腺酮）的合成

將2-氯-3，4-二羥基苯乙酮（氯乙酰兒茶酚）20.0?g（0.107?mol）、一甲胺乙醇溶液88.5?g（含一甲胺0.856?mol）一起加入到500?mL單口反應(yīng)瓶中，30～35℃攪拌使物料均勻。通入氮?dú)庵脫Q反應(yīng)瓶中的空氣4次后通氮?dú)獗Ｗo(hù)，保溫30～35?℃下反應(yīng)8?h，停止反應(yīng)，過濾，得到灰綠色固體（化合物1），無水乙醇洗滌后抽干。將灰綠色固體潮品加入到燒杯中，加入乙醇和濃鹽酸的混合溶液（乙醇30?mL，濃鹽酸18?mL）進(jìn)行成鹽反應(yīng)，攪拌，調(diào)反應(yīng)液的pH=2～3。攪拌0.5?h后，過濾，無水乙醇洗滌，得到化合物2（鹽酸腎上腺酮）白色晶體，無水乙醇洗滌，烘干后重量為19.0?g（0.0873?mol）。收率為81.6% ，HPLC歸一化含量為99.8%。

1.2.2 ?化合物3（R-腎上腺素）的合成

將鹽酸腎上腺酮15.0?g（0.069?mol）和30?mL水加入到250ml反應(yīng)瓶中，攪拌至全溶。加入異丙醇30?mL、NAD（輔酶I）0.1?g和EPI酶液50?mL（含固體酶0.5?g），用濃氨水調(diào)節(jié)pH = 6.0～6.5，保溫（30±2）℃，反應(yīng)24?h。反應(yīng)結(jié)束，抽真空去除反應(yīng)液中殘留的有機(jī)溶劑，得到澄清溶液。加入氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH = 8.0～9.0，析出大量固體，過濾，烘干，得化合物3（R-腎上腺素）白色粉末狀結(jié)晶12.1?g（0.066?mol），收率96%。含量99.5%。

2 ?結(jié)構(gòu)鑒定

產(chǎn)物R-腎上腺素結(jié)構(gòu)鑒定：m.p.=208.5?℃;比旋度-52.0°（2015版中國(guó)藥典為-50.0°～ -53.5°）;元素分析結(jié)果為C ： 58.33% （理論值59.00%），H： 7.07% （ 理論值7.15%），N： 8.01% （ 理論值7.65%）;MS-ESI+圖顯示分子離子峰m/z 166.09 [M-OH]+、m/z 184.11 [M+H]+、m/z367.20[2M+H]+，與化合物的分子量183.2相符。

¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6，DMSO-d6+D2O）譜中，核磁共振1H、COSY、HSQC譜數(shù)據(jù)見表1，各原子歸屬見圖6。

3 ?結(jié)果與討論

3.1 ?甲胺化反應(yīng)抗氧化措施的考察

由于甲胺化反應(yīng)過程中，產(chǎn)物易被空氣氧化導(dǎo)致反應(yīng)液顏色加深，收率較低，因此有必要采取考察抗氧化措施以確保反應(yīng)順利進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方案如下：

取反應(yīng)物料2-氯-3，4-二羥基苯乙酮10.0?g（0.053?6?mol）和30%甲胺乙醇溶液40.0?g（約含甲胺13.12?g，0.424?mol），溶劑乙醇100?mL，反應(yīng)溫度35?℃，HPLC法跟蹤反應(yīng)至化學(xué)平衡，分別采用抗氧化措施，考察甲胺化反應(yīng)的進(jìn)度。

抗氧化措施1：反應(yīng)液中加入亞硫酸氫鈉0.5?g;抗氧化措施2： 氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)。

按照上述實(shí)驗(yàn)方案，HPLC法跟蹤反應(yīng)進(jìn)度，考察結(jié)果見表2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，采取措施2對(duì)甲胺化反應(yīng)進(jìn)行抗氧化保護(hù)，可明顯減少雜質(zhì)的產(chǎn)生，提高腎上腺酮的含量（表2）。

3.2 ?物料比對(duì)甲胺化反應(yīng)的影響

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在改變反應(yīng)物料2-氯-3，4-二羥基苯乙酮（10.0?g，0.053?6?mol）和甲胺（30%甲胺乙醇）物料摩爾比的條件下，加入無水乙醇100?mL，反應(yīng)溫度（35±2）℃，以HPLC歸一化法跟蹤反應(yīng)，考察改變反應(yīng)物料摩爾比對(duì)甲胺化反應(yīng)的影響。考察結(jié)果見表3。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在2-氯-3，4-二羥基苯乙酮和甲胺物料比為1∶8 時(shí)，反應(yīng)較為完全，反應(yīng)液中產(chǎn)物腎上腺酮含量最高。

3.3 ?EPI酶用量的考察

以EPI酶為不對(duì)稱還原催化劑，對(duì)鹽酸腎上腺酮進(jìn)行不對(duì)稱催化反應(yīng)。反應(yīng)溫度（30±2）℃，以鹽酸腎上腺酮15?g為底物，加入水和異丙醇各30?mL、NAD 0.1?g，分別考察加入不對(duì)稱轉(zhuǎn)化酶EPI酶液25?mL（含固體酶0.25?g）、50?mL（含固體酶0.5?g）和75?mL（含固體酶0.75?g）時(shí)，對(duì)腎上腺酮還原反應(yīng)的影響。以HPLC歸一法跟蹤反應(yīng)液中R-腎上腺素的含量，確定反應(yīng)終點(diǎn)?？疾旖Y(jié)果見表4。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)固體酶用量0.5?g時(shí)，即用量鹽酸腎上腺酮重量的3.3%時(shí)，可以滿足酶催化還原反應(yīng)的要求，合成出高純的R-腎上腺素。

3.4 ?酶催化反應(yīng)溫度的考察

按照3.3的實(shí)驗(yàn)方案投料，固體酶用量為0.5?g，分別考察（20±2）℃、（30±2）℃、（40±2）℃的反應(yīng)溫度對(duì)不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響。HPLC歸一化法跟蹤反應(yīng)液中R-腎上腺素的含量，以確定反應(yīng)平衡時(shí)間。考察結(jié)果見圖7。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為（30±2）℃時(shí)，不對(duì)稱還原反應(yīng)的效果較好，反應(yīng)液中R-腎上腺素的含量達(dá)99.2%。

4 ?結(jié) 論

生物酶法不對(duì)稱合成R-腎上腺素的工藝步驟中，甲胺化反應(yīng)必須采取抗氧化保護(hù)措施以避免產(chǎn)生大量的氧化雜質(zhì)，其中氮?dú)獗Ｗo(hù)法優(yōu)于加入還原劑亞硫酸氫鈉的方法。氮?dú)獗Ｗo(hù)下2-氯-3，4-二羥基苯乙酮和甲胺物料比為優(yōu)選為1∶8。酶催化還原反應(yīng)中催化劑EPI酶的用量?jī)?yōu)選為鹽酸腎上腺素酮重量的3.3%，最佳反應(yīng)溫度為（30±2）℃。本文以生物不對(duì)稱法合成R-腎上腺素，方法可行，反應(yīng)條件溫和，收率高，與傳統(tǒng)手性拆分法相比，縮短了工藝路線，降低了成本，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]?楊淋森，喬海燕，曹祖斌，李霞，耿靜，郭興輝.B-Z化學(xué)震蕩法測(cè)定重酒石酸去甲腎上腺素[J].當(dāng)代化工，2018，47（4）：802-805.

[2] TAN Shijie.The Pharmacological Basis of ?Therapeutics （ Vol 1） （ 上冊(cè)）[M]. Beijing： Peoples Medical Publishing House，1987：126.

[3] Yadav Ramprasad， Shaikh， Zakir Gafoor， et al. Process for the preparation of Epinephrine：?WO，2009004593[P].?1-12.

[4] 貝林格爾英格海姆法瑪公司.腎上腺素的制備方法：CN，1368949[P].?1-7.

[5] 李國(guó)華，張文博，石兆瑞等.L-去氧腎上腺素合成研究進(jìn)展 [J].化工進(jìn)展，2015，34（11）： 4036.

[6] 徐小平，李忠琴等.一種生物不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備R-腎上腺素的方法 ：CN ，101906457[P].?1-9.