徐偉林 孫成

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

熊蜂是重要的傳粉昆蟲，在促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)平衡等發(fā)面發(fā)揮重要作用[1，2]。熊蜂的地理分布范圍非常廣泛，從格林蘭島到亞馬遜平原；它們的棲息地種類多樣，從高山草甸到熱帶雨林[3]。到目前為止，人們不清楚是什么分子機(jī)制導(dǎo)致了熊蜂具有如此廣泛的分布能力。對(duì)于這一問題的了解有助于更好地利用熊蜂進(jìn)行授粉服務(wù)，也有利于采取恰當(dāng)?shù)拇胧?duì)熊蜂進(jìn)行保護(hù)。串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeat）是基因組中高度變異的遺傳元件。我們通過對(duì)兩種基因組已經(jīng)測(cè)序的熊蜂進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)重復(fù)序列的變異很可能為熊蜂的環(huán)境適應(yīng)提供了良好的遺傳變異素材[4]。我們的研究也鑒定出101個(gè)編碼區(qū)含有串聯(lián)重復(fù)序列的熊蜂基因，基因中串聯(lián)重復(fù)序列的變異引起它們所編碼蛋白質(zhì)序列長度的變化。Smr基因就是這些基因之一。

Smr基因編碼一個(gè)異常大的、由3604個(gè)氨基酸組成的SMRTER（SMRT-related and ecdysone receptor interacting factor）蛋白，是一種在真核細(xì)胞中表達(dá)并且在進(jìn)化上高度保守的轉(zhuǎn)錄因子[5]。SMRTER[6]不僅對(duì)ecdysone通路有抑制作用，而且對(duì)卵泡細(xì)胞和翅膀的Notch通路也有抑制作用。Smr基因的突變會(huì)導(dǎo)致果蠅存在以下缺陷：翅膀和腿變形、產(chǎn)卵形態(tài)缺陷、生殖力下降[5]。

本研究旨在利用基因合成技術(shù)獲得熊蜂Smr基因的編碼區(qū)，并把其克隆進(jìn)大腸桿菌表達(dá)載體。在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)SMRTER重組蛋白，并對(duì)表達(dá)出的可溶性蛋白進(jìn)行純化。制備兔抗SMRTER多克隆抗體，并檢驗(yàn)所制備的多克隆抗體的特異性。該研究為進(jìn)一步研究Smr基因在熊蜂中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也有利于研究該基因中串聯(lián)重復(fù)序列所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)長度變化是否會(huì)影響該蛋白的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

Ezfusion同源重組酶購自上海捷瑞生物工程有限公司，DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒品牌為Axygen，感受態(tài)細(xì)胞類型為TOP10，親和層析柱料購自武漢匯研生物科技有限公司，酶標(biāo)二抗品牌為Jackson，TMB購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 基因合成

通過基因合成的方式合成Smr基因的編碼區(qū)，由多條引物序列合成，擴(kuò)增引物序列信息見表1（由武漢金開瑞生物科技有限公司合成）。

1.3 基因擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為正反引物各1μl（10pmol），模板1μl（20～50ng），5μl 10* pfu buffer，pfu DNA聚合酶1μl（5U），補(bǔ)去離子水至50μl，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表2。

2 載體與目的基因的連接與轉(zhuǎn)化

取Pet-b2m載體（該載體為武漢金開瑞生物科技有限公司改造）50ng，目的基因150ng，Ezfusion同源重組酶2μl，T4 DNA Ligase 1μl，補(bǔ)去離子水至20μl，在16℃條件下孵育1h進(jìn)行連接。

表1 引物序列信息

表2 基因擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件

將載體與目的基因連接的產(chǎn)物加入到裝有TOP10感受態(tài)細(xì)胞的管中（50μl感受態(tài)細(xì)胞需要25ng DNA），輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物，冰浴30min；將離心管混合物放入加溫至42℃的循環(huán)水中，熱激90s；快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min；每管加入200μl SOC液體培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到設(shè)置為37℃的搖床上，220rpm培養(yǎng)45min，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗性標(biāo)記基因；將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板達(dá)200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上；倒置平板，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌斑。

2.1 菌落PCR驗(yàn)證

待平板上長出菌落，隨機(jī)挑取若干個(gè)，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，檢測(cè)轉(zhuǎn)化。

2.2 測(cè)序驗(yàn)證

陽性克隆由武漢金開瑞生物工程有限公司測(cè)序平臺(tái)測(cè)序驗(yàn)證。

3 SMRTER蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

3.1 陽性克隆小量表達(dá)與鑒定

挑選含重組質(zhì)粒的單菌落至3ml LB液體培養(yǎng)基（卡那抗性）中，37℃培養(yǎng)過夜后-20℃保種；分別挑選含重組質(zhì)粒的單菌落至3ml LB液體培養(yǎng)基（卡那抗性）中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約0.6；取部分菌液作為對(duì)照組，余下菌液加入IPTG誘導(dǎo)劑（終濃度1mM），37℃震蕩培養(yǎng)3h；分別取兩組菌液0.15ml，12000×g離心2min，菌體沉淀以40μl 1×loading buffer重懸裂解，SDS-PAGE檢測(cè)。

3.2 蛋白大量表達(dá)及破菌檢測(cè)

取保存于-20℃的菌種100μl接種于100ml LB液體培養(yǎng)基（卡那抗性）中震蕩培養(yǎng)過夜；取100ml菌液接種于2000ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約0.6，降低培養(yǎng)溫度到30℃；加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.5mM，30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)8h；8000rpm離心3min收集菌體，重懸于50ml預(yù)冷NTA-0緩沖液中，冰浴30min；超聲破碎菌體，參數(shù)設(shè)置為功率200W、工作3s、暫停4s、時(shí)間25～30min；16000rpm 4℃離心50min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，剩余上清及沉淀置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

3.3 包涵體蛋白純化

沉淀以50ml NTA-0緩沖液重懸，加入DTT至終濃度1mM；超聲促進(jìn)雜蛋白溶解，參數(shù)設(shè)置為功率200W、工作3s、暫停3s、時(shí)間10min；10000rpm 4℃離心10min，去上清；重復(fù)以上三步至上清透明；沉淀以PBS重懸，超聲，參數(shù)設(shè)置為功率200W、工作3s、暫停3s、時(shí)間5min；16000rpm 4℃離心10min，去上清；以3ml 6M鹽酸胍重懸包涵體，加DTT至終濃度5mM；220rpm 37℃震蕩3h至包涵體全部溶解；10000rpm 4℃離心10min，取上清。取蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

3.4 包涵體蛋白復(fù)性

以2倍體積的3M鹽酸胍稀釋蛋白溶液，在4℃環(huán)境下以注射器逐滴加入到200ml復(fù)性液（pH 8.0）中，轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至最大，攪拌24h；降低轉(zhuǎn)速，攪拌24h；取蛋白溶液于透析袋中，以PEG20000濃縮體積至50～100ml；4℃ TE緩沖液透析過夜；取蛋白溶液，以PEG20000濃縮體積至2～4ml；4℃ TE緩沖液透析過夜。

3.5 復(fù)性蛋白純化

上清蛋白溶液用0.22μm過濾器過濾備用；準(zhǔn)備Ni-NTA柱；以1ml/min的流速上樣上清蛋白溶液；以NTA-0緩沖液（pH 8.0）洗柱至流出液不含蛋白（G250檢測(cè)液不變色）；分別以20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗脫，分段收集洗脫液至G250檢測(cè)液不變色；以3倍柱體積去離子水洗滌柱料，以20%乙醇封柱；對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

4 SMRTER多克隆抗體的制備與純化

將純化的SMRTER蛋白混入弗氏佐劑免疫健康狀態(tài)良好的實(shí)驗(yàn)兔，免疫程序：一免，抗原+完全弗佐+PBS，皮下注射，400ug（抗原）/只，反應(yīng)時(shí)間2周；二免，抗原+完全弗佐+PBS，皮下注射，400ug（抗原）/只，反應(yīng)時(shí)間2周；三免，抗原+完全弗佐+PBS，皮下注射，400ug（抗原）/只，反應(yīng)時(shí)間2周（效價(jià)檢測(cè)，見ELISA效價(jià)檢測(cè)操作記錄）；四免，抗原+不完全弗佐+PBS，皮下，400ug（抗原）/只，反應(yīng)時(shí)間1周（效價(jià)檢測(cè)，見ELISA效價(jià)檢測(cè)操作記錄）。共免疫2只日本大耳白兔子：兔子編號(hào)分別為G872、G873；G872、G873兔子免疫原都為SMRTER重組蛋白，免疫次數(shù)共4次。

純化：層析柱預(yù)處理，10倍柱床體積的去離子水沖洗3～5遍，流速1ml/min，10倍柱體積的0.02M PB+0.3M NaCl 沖洗3～5遍，流速1ml/min；樣品上樣，10ml抗血清/腹水，用0.02M PB稀釋后，0.22um濾器過濾后上柱，調(diào)整流速為5～7s/滴；洗雜，0.02M PB沖洗至檢測(cè)（G250不變藍(lán)）無蛋白流出為止，流速2s/滴；抗體洗脫，0.1M PH=3.0甘氨酸以3～5s/滴過柱洗脫，收集洗脫物并用G250檢測(cè)洗脫產(chǎn)物至不變藍(lán)為止；PH值調(diào)節(jié)，飽和碳酸鈉調(diào)節(jié)洗脫產(chǎn)物PH至中性；超濾濃縮，10kDa超濾管，超濾濃縮至1～3ml左右；透析，5L，0.01M PH=7.4 PBS透析過夜，第二天換液1次后再透析4～6h左右后跑SDS膠并測(cè)定抗體濃度后裝入標(biāo)記好EP管，可暫存于4℃?zhèn)溆没蛑苯颖４嬗?20℃；層析柱洗滌與貯存，去離子水沖洗層析柱，5倍柱床體積20%乙醇沖洗層析柱后，4℃封存。

5 多克隆抗體特異性檢測(cè)

間接ELISA法，通過對(duì)抗體的梯度稀釋，直觀反映了抗體的效價(jià)和靈敏度?？乖唬河冒灰合♂尶乖?μg/ml，100μl/孔加入96孔酶標(biāo)反應(yīng)板中，4℃過夜包被；洗滌：次日棄掉孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次；封閉：加200μl/孔封閉液，37℃溫育2h；洗滌：用洗滌液洗 3 次；加待測(cè)樣品（一抗）：加入抗血清（取血4℃ 4000rmp 離心10min取上清），用稀釋液將血清按1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000......進(jìn)行倍比稀釋（空白血清同比稀釋做陰性對(duì)照），每孔100μl，37℃孵育1h；洗滌：用洗滌液洗3次；加酶標(biāo)抗抗體：加入HRP標(biāo)記IgG二抗，100μl/孔，37℃孵育40min（羊抗小鼠-HRP 1:10000～1:5000，羊抗兔-HRP 1:10000～1:5000）。洗滌：用洗滌液洗5次后拍干；顯色：加新鮮配制的底物溶液100μl/孔，37℃遮光放置5～20min；終止反應(yīng)、比色：加50μl/孔終止液，顏色變黃；用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處各孔的吸光值。

6 結(jié)果

6.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

將Smr基因的編碼序列插入表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，挑選具有抗生素抗性的陽性菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，并對(duì)質(zhì)粒上目的基因插入?yún)^(qū)域進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：目的基因已經(jīng)正確地插入到表達(dá)載體之中。測(cè)序結(jié)果如下：

agcaatagcggtggtaatagcggcaccgttggtggtgcacctggtggttatg ttgcagttccgatgcctggtagcctgcgttatattcatccgtatccgagcacaccgac cagcgcaagcgttccggcagttgccaccatggttaccagcgccagcagcgcacc gacaccgattccggttccggcaccggcagcagcaccggttaatccgcctaccgtta gccagacaccgcctccgagcctgagcggcacctatgcaacccgtgatggtggcta tcgtggcaccaccaccaatgttaatgaacgtattgcaattagcgttagcagcagtcc gctgagccagattggtgttggtgtgggtgttgttgcagcagaatatgcagcaaatagc ggtattggtagcggtatggcaggcggtcgtggtgatcgtccgcgtattagcctgctgc ctccggcaagcgttaccccgacaccgtcaccgaccgcaccggattatcagcatgtt agcagtgcacgtaatagccgtattgcactgatgccggttcagccggatcagtattgta atcgtaccgcagttgaaatggcaaatctgcaagaagcaccgccttttaagaaaattc gtctgagccagccgacacagattcagctgcagagccagagccagtcacgttgtca tagcctgagtccggcagatccgtgtgttaaacaagaacatgttgtacagctgcagca accgctgcgtattgatacccgtcagcctgcaaccgaagcatatacaccgcagacc gaagcaattagcccgacactgcctgaaccgaatacacaagaagatgcacagtttc gtagcaccaaagatgatttactgcagcagattagcaaagtggatcgtgaaattgcaa aacgtgaaagccagattaacaaactgcgcaaaaaactgaaagagctggaagaaa ccgcaaataaaccgctggaagcaagcggtctgaaacgtcaggttgaagaacagag tcagcagccgaaacatcagagcctggcacagaaaatctatgcagaaaatcgtcgta aagcagaagaagcacatcgtctgctggaacgtctgggtccgaaagttgaactgccg ctgtataatcagccgagcgataccagcgtttatcaagaaaatcgcaccaaacacca gacctgtatgcgtgcacgtctgattgcccgtctgcgtcgttaa

圖1 目的基因小量表達(dá)后的SDS-PAGE電泳檢測(cè)

6.2 Smr基因的小量表達(dá)

我們使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)Smr基因進(jìn)行小量表達(dá)實(shí)驗(yàn)，以查看目的基因是否能夠成功表達(dá)。結(jié)果顯示：與沒有加IPTG誘導(dǎo)劑的全細(xì)菌蛋白相比，加誘導(dǎo)劑的全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，在目的大?。?2kDa）處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶（圖1）。因此，我們所構(gòu)建的表達(dá)載體能夠使Smr基因成功表達(dá)。

6.3 Smr基因的大量表達(dá)

對(duì)大腸桿菌進(jìn)行大量培養(yǎng)并加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)。超聲破碎菌體并離心后，分別取少量上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示，該基因大量表達(dá)后，產(chǎn)生的目的蛋白（即SMRTER）主要以包涵體的形式存在（圖2）。

圖2 目的基因大量表達(dá)后的SDS-PAGE電泳圖

6.4 SMRTER包涵體蛋白的復(fù)性與純化

我們對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行了復(fù)性，并使用Ni-NTA柱對(duì)復(fù)性的蛋白進(jìn)行了純化。取少量純化后的蛋白洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示：通過對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性、純化，我們得到了高質(zhì)量的目的蛋白（圖3）。

6.5 SMRTER蛋白多克隆抗體的制備及特異性檢測(cè)

通過4次免疫家兔，我們獲得了SMRTER蛋白的多克隆抗體；我們對(duì)抗體進(jìn)行了收集與純化，并使用如下兩種方法對(duì)獲得的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)：

圖3 目的蛋白復(fù)性純化后的SDS-PAGE電泳檢測(cè)

檢測(cè)方法1：間接ELISA法。通過對(duì)抗體進(jìn)行梯度稀釋，直觀反映了抗體的效價(jià)和靈敏度。當(dāng)稀釋比例為9.8ng/ml，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光值檢測(cè)為0.1915，結(jié)果符合預(yù)期（圖4）。

圖4 SMRTER蛋白的多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)方法2：Western blotting（WB）雜交印記法。重組抗原的WB檢測(cè)中，在約62kDa處有特異性識(shí)別，條帶相對(duì)單一，這表明我們得到了特異性的抗體（圖5）。

7 討論

本研究利用基因合成技術(shù)獲得熊蜂Smr基因的編碼序列，并將其克隆進(jìn)細(xì)菌表達(dá)載體；在0.5mmol/l IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了SMRTER重組蛋白，并對(duì)表達(dá)出的蛋白進(jìn)行了純化；成功制備了兔抗SMRTER多克隆抗體，并且制備的SMRTER多克隆抗體具有很好的效價(jià)和特異性。

圖5 SMRTER蛋白的多克隆抗體的WB雜交檢測(cè)結(jié)果

本研究所制備的SMRTER多克隆抗體為研究Smr基因在熊蜂中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。另外，由于該基因中串聯(lián)重復(fù)序列的變異導(dǎo)致熊蜂種間該基因所編碼蛋白質(zhì)序列的長度發(fā)生變異，因而本研究所制備的抗體也有利于研究串聯(lián)重復(fù)序列所產(chǎn)生的突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。