唐流斌，何念軍，趙凱輝，孫 亮 ，文一帆，金藝鵬*

(1.陜西佛坪國家級自然保護(hù)區(qū)，陜西 佛坪 723400；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

大熊貓隸屬于食肉目熊科大熊貓屬，是我國特有物種，被稱為“國寶”?，F(xiàn)存的大熊貓種群主要分布于我國中西部四川盆地西、北邊緣及相鄰的秦嶺南緣的陜南、甘南地區(qū)六個相互隔離的山系中[1]，可分為四川種群和秦嶺種群[2]。目前，得益于我國的一系列政策的支持和保護(hù)力度的加強，大熊貓種群數(shù)量在歷次調(diào)查中穩(wěn)步上升[3-4]，在IUCN評級中已經(jīng)由瀕危降為易危[5]。

大熊貓主要以竹子為食，其食物組成中99%為竹子[6]。竹子粗纖維含量很高，大熊貓無法通過自身的轉(zhuǎn)錄翻譯功能產(chǎn)生纖維素酶來對粗纖維進(jìn)行消化。早期的研究發(fā)現(xiàn)，大熊貓腸道微生物中有協(xié)助大熊貓降解纖維素的基因[7]，可以將竹子中富含的多聚糖轉(zhuǎn)換為單糖、二糖而被大熊貓利用吸收[8-11]。盡管如此，大熊貓還是不能完全消化這些食物，竹子(特別是竹竿)在經(jīng)過大熊貓腸道的時候會給腸道很大的負(fù)荷。腸道寄生蟲是野生大熊貓面臨的最大困擾[12-13]，不僅會影響大熊貓的營養(yǎng)吸收，嚴(yán)重的還會引起腸道穿孔和腹膜炎等。早期研究表明腸道寄生蟲引起的腸道疾病是野生大熊貓死亡的最重要原因之一[14]。正常生理狀態(tài)下，大熊貓腸道上皮細(xì)胞會分泌大量的黏液協(xié)助排便，黏液層具有維持正常調(diào)節(jié)功能，當(dāng)杯狀細(xì)胞分泌的黏液減少，缺乏黏液的小鼠會出現(xiàn)自發(fā)性的結(jié)腸炎[15]。在前期的野生大熊貓救助工作中，我們發(fā)現(xiàn)死亡野生大熊貓的腸道中普遍存在慢性炎癥表象。為了評估野生大熊貓健康狀況，特別是消化吸收功能，我們亟需一個有效的參考指標(biāo)對野生大熊貓的腸道疾病進(jìn)行評估，該指標(biāo)的建立測量過程需要滿足野生大熊貓生活隱蔽、采樣困難等的特殊性。

鈣衛(wèi)蛋白(Calprotectin，S100A8/A9)在人體中分布廣泛，是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的主要蛋白質(zhì)，由兩條重鏈(14 000 KD)和一條輕鏈(8 000 KD)非共價結(jié)合而成的異二聚體[16], 相對分子量約為36 000 KD。在中性粒細(xì)胞中，鈣衛(wèi)蛋白約占細(xì)胞總蛋白的5%, 存在于溶酶體外的細(xì)胞液中, 含量約為5～15 mg·ml-1，為中性粒細(xì)胞更新的標(biāo)志物，在許多炎癥情況下都可升高[16]。犬鈣衛(wèi)蛋白S100A8相對分子質(zhì)量約為10 374.8 KD，S100A9相對分子質(zhì)量約為14 670.3 KD。鈣衛(wèi)蛋白可以在血清和糞便中檢測出，糞便中鈣衛(wèi)蛋白濃度與腸道炎癥的嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性。例如，在慢性腸炎患犬中，糞便中的鈣衛(wèi)蛋白濃度是血清鈣衛(wèi)蛋白濃度的數(shù)倍[17]。同時，在胃腸道急性炎癥狀態(tài)下，糞便中鈣衛(wèi)蛋白濃度也會上升。在一項研究中，急性出血性腹瀉綜合征(AHDS)的患犬，它們的胃腸道病理結(jié)果顯示在伴隨著血管通透性增加導(dǎo)致的蛋白丟失和出血及炎性浸潤情況下，糞便中鈣衛(wèi)蛋白是隨病情發(fā)展不斷變化的[18]。除此以外，胃腸道的腫瘤也會導(dǎo)致鈣衛(wèi)蛋白濃度上升。糞便鈣衛(wèi)蛋白作為一種生物標(biāo)記物，可以初步檢測動物各種胃腸道疾病。通常,以50 μg·g-1為分界線，作為診斷犬慢性腸炎的指標(biāo)[19]。

1 材料與方法

陜西佛坪國家級自然保護(hù)區(qū)在距陜西省珍稀野生動物救助與繁育中心157 km的秦嶺山脈中，是野生大熊貓分布最集中的地方之一。前期野生大熊貓調(diào)查結(jié)果顯示在佛坪縣就有野生大熊貓110～130只，占秦嶺大熊貓種群總數(shù)的四成以上。本研究中的所有野生大熊貓糞便樣本均來源于佛坪國家級自然保護(hù)區(qū)的三官廟保護(hù)站和西河保護(hù)站。野生大熊貓糞便樣本采樣季節(jié)主要為冬季(竹葉糞便)和春季(竹筍糞便)，根據(jù)糞便表層黏液分布程度，判斷樣本新鮮程度，所有樣本新鮮程度均為1～2 d。發(fā)現(xiàn)大熊貓新鮮糞便后，用無菌采樣袋裝取，采集過程中盡量避免人為帶去的糞便完整性破壞，并做好標(biāo)記，8 h內(nèi)運回保護(hù)站進(jìn)行處理，運輸過程均為冰塊冷凍保存，運回保護(hù)站后-20 ℃冷凍保存，待分析。

糞便樣本在實驗室無菌環(huán)境下剝離外層2 cm左右的部分，取中心位置的約1 g糞便，裝入無菌離心管中，加入10 ml去離子水。充分混勻之后在高速離心機1 000 rpm情況下離心20 min，取上清液待檢。剩余液體留存。為了減少糞便樣本污染，稱量紙等儀器和耗材均經(jīng)過紫外消毒或者高壓蒸汽滅菌處理。用于取樣的鑷子經(jīng)高壓滅菌，每一次取樣之后都使用75%酒精進(jìn)行反復(fù)處理3次。采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)方法進(jìn)行檢測，利用犬鈣衛(wèi)蛋白檢測試劑盒。說明書所記錄的操作方法進(jìn)行實驗操作。為了減少實驗誤差，每個樣本檢測三次，最后取平均值。

從NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)下載包括人、大熊貓、貓和狗等25個物種的S100A8和S100A9氨基酸序列，用Mega 6.0 軟件進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。在R 3.5.1(R Core Team, 2015)中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用T檢驗來比較兩組之間的統(tǒng)計差異，所有檢驗均為雙尾檢驗P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 S100A8和S100A9基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

S100蛋白家族基因進(jìn)化相對保守。S100A8蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖1 a)，熊科與食肉目的貓科和犬科物種聚集在同一支，結(jié)果表明大熊貓S100A8蛋白序列與犬、貓等具有高度相似性。S100A9蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖1 b)，熊科與貓科動物聚在同一支，而與犬科物種存在一定差異，結(jié)果表明大熊貓S100A8蛋白序列與貓等物種具有高度相似性。

圖1 S100A8(a)、S100A9(b)進(jìn)化關(guān)系分析

2.2 酶聯(lián)免疫吸附劑測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

對購買的犬鈣衛(wèi)蛋白檢測試劑盒用標(biāo)準(zhǔn)樣液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，共進(jìn)行了12次檢測(圖2)。從標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果可以看出，吸光度與標(biāo)準(zhǔn)樣液濃度成線性相關(guān)，測出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對穩(wěn)定。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 酶聯(lián)免疫吸附劑測定檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 大熊貓采食竹葉和竹筍期鈣衛(wèi)蛋白濃度變化

本研究共采集野生大熊貓糞便樣本23份，其中大熊貓采食竹筍期樣本6份，采食竹葉期樣本17份。用犬鈣衛(wèi)蛋白檢測試劑盒對所有樣本進(jìn)行檢測，每個樣本檢測3次，測量后得出平均值。糞便測量值誤差穩(wěn)定在10%以內(nèi)，同一批檢測試劑盒板間與板內(nèi)變異系數(shù)在10%以內(nèi)。對大熊貓采食竹葉和竹筍不同時期的鈣衛(wèi)蛋白濃度進(jìn)行比較，結(jié)果分析表明大熊貓在采食竹葉期糞便(64.86 ± 2.37 ng·ml-1)中鈣衛(wèi)蛋白的濃度顯著高于采食竹筍期(23.79±4.92 ng·ml-1)(t=7.50,df=7.73,p<0.05)(圖3)。

圖3 大熊貓采食竹葉和竹筍時鈣衛(wèi)蛋白濃度變化

3 討論

在臨床研究中，使用了很多方法對炎癥指示物例如IL-6、IL-8等進(jìn)行了檢測，其中，使用酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法在檢測方面的變異系數(shù)在可接受的2.95%～9.8%[20]，考慮到本研究所需要的條件，可以說酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法是最適合的方式。同時，鈣衛(wèi)蛋白在環(huán)境中的穩(wěn)定性在研究中得到證實，在約23 ℃的室溫條件下，犬鈣衛(wèi)蛋白在兩周以內(nèi)能夠穩(wěn)定存在[21]。在低溫狀態(tài)下，其能穩(wěn)定存在的時間更長，人鈣衛(wèi)蛋白在2～8 ℃下保存10 d，-20 ℃下能保存1 a，并且能經(jīng)受4次凍融過程。鑒于野外采集新鮮大熊貓糞便的難度，大熊貓糞便中的鈣衛(wèi)蛋白是適合監(jiān)測野生腸道疾病的良好指標(biāo)。

我們利用進(jìn)化發(fā)育關(guān)系對大熊貓和其它不同物種進(jìn)行分析，結(jié)果表明大熊貓鈣衛(wèi)蛋白與犬鈣衛(wèi)蛋白具有同源性，可以利用犬鈣衛(wèi)蛋白ELISA檢測試劑盒對大熊貓鈣衛(wèi)蛋白進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同樣處理下的大熊貓糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測值均在試劑盒準(zhǔn)確檢測的范圍內(nèi)。盡管如此，大熊貓鈣衛(wèi)蛋白與犬或貓中鈣衛(wèi)蛋白仍存在一定差異，后期研究中或者應(yīng)該可以考慮利用大熊貓?zhí)禺愋缘脑噭┖羞M(jìn)行檢測。

本研究中盡管大熊貓糞便樣本數(shù)量有限，但是在比較野生大熊貓采食不同食物期間糞便鈣衛(wèi)蛋白濃度發(fā)現(xiàn)，竹葉糞便樣本鈣衛(wèi)蛋白檢測值要顯著高于筍期。這種現(xiàn)象的主要原因可能有兩種：(1)采食竹葉期間，竹葉較為粗糙，大熊貓腸道可能存在一定的損傷，更容易引發(fā)炎癥；(2)竹筍糞便水分較多，可能對鈣衛(wèi)蛋白濃度存在一定稀釋作用。遺憾的是本研究未得到有明顯腸道炎癥癥狀大熊貓的糞便樣本，所以無法對比正常狀態(tài)與病理情況下野生大熊貓糞便鈣衛(wèi)蛋白的含量變化。野生大熊貓糞便樣本獲取難度很大，尤其是病理情況下的樣本，這需要在今后的研究中對所需要樣本進(jìn)行長時間的積累。