王亞平，彭春艷，朱名安

1．錦州醫(yī)科大學(xué)研究生院(錦州121000)；2．湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科(十堰442000)； 3．湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(十堰 442000)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(Coronary artery disease，CAD)簡(jiǎn)稱冠心病，是最常見(jiàn)的心血管疾病[1]。代謝綜合征(Metabolic syndrome,MS)是心血管疾病及糖尿病等相關(guān)危險(xiǎn)因素的綜合體，這些因素包括脂代謝紊亂、血糖異常、血壓升高和內(nèi)臟肥胖，也被認(rèn)為是CAD發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。許多臨床研究表明，MS能增加CAD發(fā)生的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的病死率[3]。同時(shí)，MS患者中風(fēng)和CAD的風(fēng)險(xiǎn)比正常人增加了3倍[4-5]。因此，對(duì)CAD合并MS患者的危險(xiǎn)因素的早期檢測(cè)已經(jīng)變得越來(lái)越重要。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇代謝關(guān)鍵基因，對(duì)維持脂質(zhì)平衡十分關(guān)鍵[6]。一般來(lái)說(shuō)，SREBP-1激活脂肪酸和甘油三酯的合成，而SREBP-2則增加膽固醇的合成[7]。在本研究中，我們以SREBPs為切入點(diǎn)，聯(lián)合MS的高危因素，進(jìn)行CAD合并MS的相關(guān)性研究，為其早期篩查及診斷提供理論支持。

資料與方法

1 一般資料 收集2017年12月至2018年11月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院心內(nèi)科住院的CAD患者，根據(jù)患者是否同時(shí)合并MS，將其分為CAD合并MS組和CAD組。冠心病的診斷依據(jù)參照患者的冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果。MS的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)(CDS，2004)基礎(chǔ)上修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟器質(zhì)性疾病如先天性心臟病等；②肝腎功能嚴(yán)重?fù)p害如尿毒癥等；③嚴(yán)重的全身感染性疾?。虎苁褂妹庖咭种苿┗蚧熕幬?。最終納入CAD組70例和CAD合并MS組73例。在體檢中心收集以年齡、性別匹配，血管造影正常的同期健康個(gè)體作為對(duì)照組，共159例。所有研究對(duì)象均已簽署書(shū)面知情同意書(shū)。使用SYNTAX網(wǎng)頁(yè)(www.syntaxscore.com)對(duì)CAD合并MS患者的造影結(jié)果進(jìn)行評(píng)分：低危組0～22分，中危組23～32分，高危組≥33分。本研究把0～22分作為低風(fēng)險(xiǎn)組，共28例；≥ 33分作為高風(fēng)險(xiǎn)組，共45例。

2 研究方法

2.1 生化指標(biāo)檢測(cè)：抽取晨間空腹12 h靜脈血，離心后取血清進(jìn)行15個(gè)生物學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)。脂質(zhì)代謝標(biāo)志物：總膽固醇(Total cholesterol，TC)，甘油三酯(Triglycerides，TG)，高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，載脂蛋白A1(Apolipoprotein A1，Apo-A1)，載脂蛋白B(ApolipoproteinB，Apo-B)，脂蛋白a[Lipoprotein a，LP(a)]。心肌酶標(biāo)志物：肌酸激酶(Creatine kinase，CK)，肌酸激酶-MB(Creatine kinase-MB，CK-MB)，乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)，羥丁酸脫氫酶(Hydroxybutyratedehydrogenase，HBDH)。炎癥標(biāo)志物：高敏C-反應(yīng)蛋白(High-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)。蛋白質(zhì)代謝標(biāo)志物：同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)。腎功能標(biāo)志物：胱抑素-C(Cystatin C，Cys-C)。葡萄糖代謝標(biāo)記物：糖化血清蛋白(Glycated Serum Protein，GSP)。所有樣本在-80℃保存，僅使用時(shí)解凍一次。所有生化指標(biāo)均在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科中心實(shí)驗(yàn)室通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)。

2.2 外周血白細(xì)胞SREBPs相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列：引物序列：SREBP-1上、下游引物：5’-TGCATTTTCTGACACGCTTC-3’；5’- CCAAGCTGTACAGGCTCTCC-3’；SREBP-2上、下游引物：5’- TGGCTTCTCTCCCTACTCCA-3’，5’- GAGAGGCACAGGAAGGTGAG-3’；內(nèi)參GAPDH上、下游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,5’- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，62℃退火34 s，72℃延伸1 min 40個(gè)循環(huán)(Bio-Rad公司CFX96)。結(jié)果分析計(jì)算采用2-△△ct。

結(jié) 果

1 三組研究對(duì)象的一般資料比較 與對(duì)照組相比，CAD組和CAD合并MS組的年齡和性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均> 0.05)；CAD組TC、HDL-C、LDL-C、Apo-A1、Apo-B和GSP水平降低(P均< 0.05)，LP(a)、CK和hs-CRP水平升高(P均< 0.05)；CAD合并MS組TC、HDL-C和CK降低(P均< 0.001)，TG、LP(a)、AST、CK-MB、HBDH、hs-CRP和GSP水平升高(P均< 0.05)。與CAD組相比，CAD合并MS組TG、LDL-C、Apo-B、AST和GSP水平升高(P均< 0.05)。見(jiàn)表1。

表1三組研究對(duì)象的一般資料比較

注：P1為對(duì)照組與單純冠心病組比較；P2為對(duì)照組與CAD合并MS組比較；P3為單純冠心病組與CAD合并MS組比較

2 外周血白細(xì)胞SREBPs mRNA的相對(duì)表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，CAD組外周血白細(xì)胞SREBP-1mRNA和SREBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；CAD合并MS組外周血白細(xì)胞SREBP-1mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，SREBP-2mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與CAD組相比，CAD合并MS組SREBP-1mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，SREBP-2mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 外周血白細(xì)胞SREBPsmRNA相對(duì)表達(dá)水平

3 外周血白細(xì)胞SREBP-1mRNA水平與各生化指標(biāo)相關(guān)性分析 通過(guò)對(duì)外周血白細(xì)胞SREBP-1 mRNA水平和各生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析得出：在所有樣本中(n=302)，SREBP-1mRNA水平與血清中TC、HDL-C、Apo-A1、CysC的含量呈正相關(guān)，與血清中hs-CRP、CK-MB、HCY的含量呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)；在疾病組樣本中(n=143)，SREBP-1mRNA水平與血清中HDL-C、GSP的含量呈正相關(guān)，與血清中HCY、hs-CRP的含量呈負(fù)相關(guān)(P均< 0.05)。見(jiàn)表2。

表2SREBP-1水平與各生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

4 多因素Logistic回歸分析 在多因素Logistic回歸模型中校正相關(guān)危險(xiǎn)因素后，分析結(jié)果顯示，SREBP-1表達(dá)水平是CAD合并MS的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素[優(yōu)勢(shì)比(OR)= 0.346，95%可信區(qū)間(CI)=(0.191～0.625)，P<0.001]，且可能受到血脂，血糖，高血壓等危險(xiǎn)因素的影響。見(jiàn)表3。

表3SREBP-1相對(duì)表達(dá)水平與CAD合并MS風(fēng)險(xiǎn)因素分析

5 SREBP-1表達(dá)水平在CAD合并MS患者的診斷價(jià)值 用SPSS做低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組的SREBP-1表達(dá)水平ROC曲線，同時(shí)用SREBP-1分別與血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C、Apo-A1、Apo-B)聯(lián)合做ROC曲線分析，見(jiàn)表4。SREBP-1單獨(dú)預(yù)測(cè)CAD合并MS嚴(yán)重程度指標(biāo)時(shí)，靈敏度較高但特異度較低[AUC為0.627(0.492～0.763)，敏感性=75%，特異度=53.5%，P=0.069]；聯(lián)合HDL-C后AUC面積及特異度明顯升高，靈敏度較高[AUC為0.640(0.507～0.774)，敏感性=50%，特異度=77.8%，P=0.045]；聯(lián)合Apo-A1后AUC面積及特異度明顯升高，靈敏度較高[AUC為0.648(0.479～0.751)，敏感性=60.7%，特異度=75.6%，P=0.034]。

表4外周血白細(xì)胞SREBP-1表達(dá)水平預(yù)測(cè)CAD合并MS危險(xiǎn)程度

討 論

2016年發(fā)布的《心臟病和卒中統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)》指出，心血管疾病是影響人類健康主要醫(yī)療問(wèn)題，CAD仍然是造成世界人民健康問(wèn)題的主要因素[9]。MS是CAD的極高危因素。許多流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，MS患者合并CAD的風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的3倍[10]。MS的患病率在健康人群中為22%，在CAD患者中則為41%，合并MS的CAD患者有更高的冠狀動(dòng)脈病變風(fēng)險(xiǎn)，這增加了心血管疾病發(fā)病率和病死率[11-12]。脂質(zhì)代謝異常是MS中的重要組成部分，參與CAD的發(fā)生和發(fā)展[13]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)是調(diào)控一系列脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子，本研究中我們通過(guò)檢測(cè)外周血白細(xì)胞SREBPs的表達(dá)水平，聯(lián)合脂代謝相關(guān)指標(biāo)共同探討其在CAD合并MS中的作用機(jī)制。

SREBPs是一類具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)維持細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)所需基因的表達(dá)[14]。SREBPs的轉(zhuǎn)錄激活需要與SREBP切割活化蛋白(SCAP)結(jié)合，將SREBPs不活躍的前體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)到高爾基體，然后遷移到細(xì)胞核與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的甾醇反應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[15]。在哺乳動(dòng)物中包含SREBP-1和SREBP-2兩種類型的基因，SREBP-1主要參與脂肪酸和膽固醇合成，SREBP-2調(diào)控膽固醇合成和攝取，它們?cè)诠δ苌霞扔薪徊娴蚕嗷オ?dú)立。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組和單純冠心病組相比，CAD合并MS患者外周血白細(xì)胞SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平均顯著降低，SREBP-2 mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化。有學(xué)者通過(guò)采用代謝和脂質(zhì)組學(xué)分析測(cè)定動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血清樣本，發(fā)現(xiàn)致動(dòng)脈粥樣硬化飲食在早期階段(8周)小鼠心臟中SREBP-1的水平升高；16周后無(wú)明顯變化；在連續(xù)喂養(yǎng)至25周后，SREBP-1表達(dá)呈下降趨勢(shì)。這說(shuō)明SREBP-1在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程具有波動(dòng)性，在動(dòng)脈粥樣硬化早期SREBP-1可發(fā)揮正常的調(diào)控功能，隨著動(dòng)脈粥樣硬化程度的加重，SREBP-1表達(dá)水平下降。這與我們研究中CAD合并MS組中SREBP-1的表達(dá)水平變化相一致。以上結(jié)果顯示，SREBP-1的表達(dá)水平下降與動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度及脂代謝紊亂有關(guān)。SREBP-2與膽固醇代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)并受到細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的調(diào)控。與對(duì)照組和CAD組相比，CAD合并MS患者外周血白細(xì)胞SREBP-2 mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化，這可能與CAD合并MS患者服用他汀類藥物有關(guān)。他汀類藥物通過(guò)抑制HMG-CoA還原酶活性，使膽固醇的合成減少，從而維持血清膽固醇水平處于正常參考范圍內(nèi)相對(duì)低的水平。

脂質(zhì)代謝紊亂通常是指TG和(或)LDL-C水平升高，和(或)HDL-C水平降低。有研究發(fā)現(xiàn)CAD危險(xiǎn)系數(shù)隨血漿TG水平的升高而增加，MS患者通常由于吸收膽固醇少而合成膽固醇增多，導(dǎo)致TG和Apo-B增高。當(dāng)攝取LDL-C能力超過(guò)巨噬細(xì)胞清除氧化LDL-C的能力時(shí)，可導(dǎo)致LDL-C累積及泡沫細(xì)胞壞死，釋放出大量溶酶體酶，引起細(xì)胞壞死，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈硬化的發(fā)生和發(fā)展。相較于對(duì)照組和CAD組，CAD合并MS患者中血清TG、LDL-C、Apo-B、AST和GSP升高，這表明CAD合并MS群體中血脂代謝水平更為紊亂，且以血清TG 和LDL-C水平升高為主要表現(xiàn)。作為脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要激活因子，SREBP-1的下調(diào)可能與血清TG、LDL-C、Apo-B、AST和GSP紊亂有關(guān)；脂類的積累可能阻止了SREBP-SCAP復(fù)合物的易位和斷裂，破壞了脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，這是一個(gè)基于自我調(diào)節(jié)的反饋過(guò)程。此外，Logistic回歸分析評(píng)估SREBP-1 mRNA水平降低與CAD合并MS風(fēng)險(xiǎn)增加的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SREBP-1表達(dá)水平降低是CAD合并MS的一個(gè)潛在危險(xiǎn)因素，且與高脂血癥、糖尿病、高血壓等有關(guān)，這表明SREBP-1可能通過(guò)調(diào)控糖尿病、高脂血癥、高血壓等疾病通路來(lái)參與CAD合并MS的發(fā)病，未來(lái)仍需大規(guī)模的樣本進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

通過(guò)對(duì)外周血白細(xì)胞SREBP-1mRNA水平和CAD傳統(tǒng)危險(xiǎn)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析得出：在所有樣本中，SREBP-1mRNA水平與血清中TC、HDL-C、Apo-A1、CysC的含量呈正相關(guān)，與血清中hs-CRP、CK-MB、HCY的含量呈負(fù)相關(guān)；在疾病組樣本中，SREBP-1mRNA水平與血清中HDL-C、GSP的含量呈正相關(guān)，與血清中HCY、hs-CRP的含量呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明了SREBP-1與脂代謝及胰島素抵抗等CAD傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素有關(guān)，它們之間的相互作用可能造成心血管疾病發(fā)病率的增加。

此外，我們進(jìn)一步評(píng)估了外周血白細(xì)胞SREBP-1表達(dá)水平在CAD合并MS患者的診斷價(jià)值，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用SREBP-1預(yù)測(cè)CAD合并MS嚴(yán)重程度指標(biāo)時(shí)，靈敏度較高但特異度較低；當(dāng)聯(lián)合HDL-C或Apo-A1預(yù)測(cè)診斷后，特異度明顯升高但靈敏度較低?？梢?jiàn)，CAD合并MS患者外周血SREBP-1表達(dá)水平降低可導(dǎo)致其血漿多種指標(biāo)水平升高，聯(lián)合多種血脂指標(biāo)檢測(cè)的準(zhǔn)確性可能優(yōu)于單一指標(biāo)檢測(cè)，這有可能成為CAD及其高?；颊吆Y選和診斷的新策略。

綜上所述，SREBP-1在聯(lián)系CAD與MS之間起到了橋梁作用，并提示外周血白細(xì)胞SREBP-1mRNA水平是CAD患者合并MS的潛在危險(xiǎn)因素，SREBP-1 可能是CAD患者合并MS重要的生物學(xué)標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性：比如樣本量少，研究對(duì)象只在鄂西北人群中進(jìn)行，未進(jìn)行SREBPs蛋白水平檢測(cè)等等。這些不足將會(huì)在接下來(lái)的研究中進(jìn)行完善。