鄧春穎，李海濱，毛文靜，李世英，劉 斌△

1．華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院(唐山063000)；2.河北省遵化市人民醫(yī)院(唐山063000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，多發(fā)于老年人，主要臨床表現(xiàn)為記憶力下降、執(zhí)行能力下降、人格及行為改變，嚴重時甚至?xí)霈F(xiàn)精神癥狀，嚴重影響患者的日常生活，給家庭和社會帶來沉重的負擔[1]。其發(fā)病機制尚不十分明確，較為公認的學(xué)說包括炎癥與免疫學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、中樞膽堿能損傷學(xué)說等[2]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一種廣泛存在于海馬和皮層的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其表達增加可影響AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[3-4]。堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)對神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞等有神經(jīng)營養(yǎng)作用[5]，其表達量對AD大鼠認知功能恢復(fù)有促進作用。丁苯酞(dl-3-N-butylphthalidle，NBP)是一種新藥，目前主要應(yīng)用于缺血性腦血管病，主要通過拮抗自由基、保護損傷的神經(jīng)元起到腦保護作用。另有研究表明，NBP具有拮抗炎性反應(yīng)、抑制神經(jīng)元凋亡、保護受損的腦細胞等作用，主要通過對細胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)發(fā)揮作用的。本實驗通過研究NBP對AD模型大鼠海馬CA1區(qū)BDNF和bFGF蛋白表達，探討NBP對AD模型大鼠腦保護作用的機制。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：選取72只2～3個月齡250～280 g健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(北京華阜康生物科技有限公司)，合格證號為：SCXK[京]2014-0010。于華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動物實驗室喂養(yǎng)大鼠，室溫、濕度適宜，12 h明暗交替光照，實驗前適應(yīng)喂養(yǎng)一周。

1.2 藥物與試劑：丁苯酞軟膠囊(國藥準字H20050299，批號121101，0.1 g/粒)。一抗：兔抗大鼠BDNF多克隆抗體(購自北京博奧森生物公司)、兔抗大鼠bFGF抗體(購自北京博奧森生物公司)；兔二步法免疫組化試劑盒(北京中杉生物有限公司)；DAB 顯色液(北京中杉生物有限公司)。DAB 顯色液、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子質(zhì)量標準蛋白(北京中杉生物有限公司)。

1.3 主要儀器：石蠟組織切片機(德國LEICA公司)。透射電子鏡(日本HITACHI公司)。腦立體定位儀(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。Morris 水迷宮(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。電凝儀(張家港市航天醫(yī)療電器有限公司)。

2 研究方法

2.1 動物分組：實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)組、AD模型組(AD)組、丁苯酞治療組(NBP)組，造模成功后，將上述各組隨機分為造模后 1、2、4 和 8 周 4 個亞組。

2.2 模型制備：用無菌生理鹽水處理Aβ1-42，制成濃度為1 μg/μl溶液，將其孵育達到凝聚狀態(tài)。通過Morris水迷宮篩選實驗動物，去除先天性癡呆及游泳姿勢不良等大鼠。10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，應(yīng)用腦立體定位儀定位，向AD組及治療組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)注入5 μl聚集態(tài)1 μg/μl Aβ溶液，然后緩慢撤出針頭，用骨蠟封閉骨質(zhì)創(chuàng)口，縫合切口皮膚，手術(shù)區(qū)用硫酸慶大霉素注射液消毒。Sham組注射5 μl生理鹽水。

2.3 給藥方法:NBP組將NBP與食用油混合后制成的NBP混合溶液進行灌胃(濃度8 mg/ml，劑量1 ml/100 g)，每日2次；Sham組和AD組采用同等劑量的食用油進行灌胃，對各組大鼠進行灌胃處理，每日2次，分別連續(xù)給藥1、2、4、8周。

2.4 行為學(xué)測試:采用Morris水迷宮實驗測試實驗造模成功給藥后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[3]。采用水迷宮實驗分別觀察各組大鼠灌胃后1周、2周、4周和8周穿越平臺的次數(shù)。

2.5 免疫組織化學(xué)檢測:腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠后，快速灌注0.9%氯化鈉溶液，排出血管內(nèi)血漬、肝臟變白后，滴注4%多聚甲醛至大鼠全身肌肉僵硬，斷頭取腦，并剝離腦組織，4%多聚甲醛-PBS固定過夜后石蠟包埋含海馬的腦組織切片備用。取組織標本，加入羊血清封閉液，滴加一抗，20 μl抗BDNF蛋白(1∶300)、抗bFGF蛋白(1∶200)4℃過夜，滴加二抗孵育1 h，進行DAB顯色。具體操作步驟按試劑說明書操作要求進行。BDNF、bFGF免疫組織化學(xué)陽性標準，細胞胞漿和胞核呈棕褐色。應(yīng)用OLYMPUS攝像顯微鏡(400×)對組織切片采集圖像，隨機觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)不重疊的6個視野，應(yīng)用 Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

2.6 Western blot檢測:各組實驗大鼠喂養(yǎng)至各個時相點后，麻醉、斷頭、取腦組織，加入組織裂解液后研磨裂解40 min，離心后將清液置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒌鞍锥?、分裝，調(diào)蛋白濃度至800 μg/ml，加等體積的上樣緩沖液，置于沸水中煮5 min。冷卻后放入4℃冰箱備用。

檢測方法：取等量蛋白樣品(50 μg)置于10% SDS聚丙烯酸銨凝膠電泳，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，室溫封閉2 h。分別加入一抗，抗BDNF蛋白(1∶500)、抗bFGF蛋白(1∶400)，4℃冰箱過夜，次日漂洗后加羊抗兔二抗(1∶2000)，于37℃環(huán)境反應(yīng)2 h，PBS洗膜后加BCIP/NBT顯色數(shù)分鐘，雙蒸餾水終止顯色，Image J軟件進行灰度值測定分析。

結(jié) 果

1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測結(jié)果 與Sham組比較，AD組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與AD組比較，NBP組大鼠穿越平臺次數(shù)增加(P<0.01)。見表1。

2 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF檢測結(jié)果

2.1 免疫組化法結(jié)果:BDNF蛋白在Sham組大鼠各時間點海馬CA1區(qū)均可見少量表達。在AD組大鼠各時間點表達增多，1周時有多量表達，2周時表達繼續(xù)增多，4周時表達量最高，8周時稍有下降但仍處于較高水平。與Sham組相比，BDNF蛋白在AD組大鼠各時間點表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與AD組比較，BDNF蛋白在NBP組大鼠各時間點表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2、圖1。

表1各組大鼠穿越平臺次數(shù)(次)

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

表2各組大鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF 免疫組化結(jié)果(個/高倍視野)

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

注：A為Sham組；B為AD組；C為NBP組；1、2、3、4 分別為1、2、4、8周

2.2 Western blot檢測結(jié)果:BDNF蛋白在假手術(shù)組大鼠各時間點海馬CA1區(qū)有少量表達。與假手術(shù)組相比，BDNF蛋白在AD模型組各時間點表達明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，4周時達高峰。與AD模型組比較，BDNF蛋白在NBP治療組各時間點表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖2。

表3各組大鼠海馬 CA1 區(qū)BDNF Western blot結(jié)果

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF Western blot結(jié)果

3 各組大鼠海馬CA1區(qū)bFGF檢測結(jié)果

3.1 免疫組化法結(jié)果：bFGF蛋白在Sham組大鼠各時間點海馬CA1區(qū)均可見少量表達。在AD組大鼠各時間點表達增多，1周時有多量表達，2周時表達繼續(xù)增多，4周時表達量最高，8周時稍有下降但仍處于較高水平。與Sham組相比，bFGF蛋白在AD組大鼠各時間點表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與AD組比較，bFGF蛋白在NBP組大鼠各時間點表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4、圖3。

表4各組大鼠海馬 CA1 區(qū) bFGF 免疫組化結(jié)果(個/高倍視野)

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

注：A為Sham組；B為AD組；C為NBP組；1、2、3、4 分別為1、2、4、8周

3.2 Western blot檢測結(jié)果:bFGF蛋白在假手術(shù)組大鼠各時間點海馬CA1區(qū)有少量表達。與假手術(shù)組相比，bFGF蛋白在AD模型組各時間點表達明顯增多(P<0.01)，4周時達高峰。與AD模型組比較，bFGF蛋白在NBP治療組各時間點表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表5、圖4。

表5各組大鼠海馬 CA1 區(qū)bFGF Western blot結(jié)果

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

圖4 各組大鼠海馬CA1區(qū)bFGF Western blot結(jié)果

討 論

AD是全世界最普遍的癡呆癥，多發(fā)生于中年或老年的早期，病初有輕度認知功能障礙，隨著病情進展，發(fā)展為嚴重的不可逆的神經(jīng)變性、認知功能退化、精神行為異常。目前治療AD公認的有效藥物包括多奈哌齊、美金剛、加蘭他敏、卡巴拉汀等，本文為AD治療發(fā)現(xiàn)新的藥物。NBP是從芹菜種籽內(nèi)分離得到，呈黃色油狀液體，是我國自主研發(fā)的擁有知識產(chǎn)權(quán)的新藥。它具有改善腦部微循環(huán)、保護線粒體等作用，近年來研究表明NBP還具有神經(jīng)保護、促進認知功能恢復(fù)、抑制Aβ沉積、抗炎等[6-9]作用。本研究測試了實驗大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，與AD組比較，NBP組大鼠穿越平臺次數(shù)增加，表明NBP能改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并且研究其可能機制。

BDNF是1982年Barde等在豬腦中發(fā)現(xiàn)的一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，海馬和皮質(zhì)表達量最高，對神經(jīng)元的分化、生長有重要作用[10]。BDNF 可通過多種途徑保護受損細胞，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。無論在體內(nèi)或體外條件下，BDNF均能促進膽堿能神經(jīng)元的分化和存活。BDNF通過調(diào)節(jié)突觸可塑性、促進神經(jīng)發(fā)生尤其是海馬的神經(jīng)發(fā)生，改善已經(jīng)破壞受損的學(xué)習(xí)及記憶能力，BDNF增加可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[11-12]。本實驗結(jié)果顯示，AD大鼠海馬CA1區(qū)BDNF高于Sham組，當神經(jīng)功能缺失、神經(jīng)細胞退化，可刺激腦組織內(nèi)BDNF表達，保護神經(jīng)功能、修復(fù)神經(jīng)元。給予NBP治療后的大鼠，腦組織海馬CA1區(qū)BDNP表達量進一步增多，明顯高于AD組，證明NBP能明顯增加AD大鼠腦組織內(nèi)的BDNF表達，同時大鼠學(xué)習(xí)記憶能力也得到改善。Lv等[13]研究表明，NBP能改善快速老化鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并能上調(diào)BDNF表達，與本實驗結(jié)果一致。

bFGF是1940年在腦和垂體發(fā)現(xiàn)的一種能夠促進成纖維細胞生長的物質(zhì)，是含有155個氨基酸的多肽生長因子，能提高神經(jīng)元的存活、誘導(dǎo)軸突向外生成，能促進神經(jīng)干細胞增殖、抑制分化[14-18]。bFGF能對抗多種損傷，如缺血、低血糖、自由基等，故而起到對神經(jīng)元的保護作用。在大鼠學(xué)習(xí)記憶和鍛煉過程中bFGF mRNA水平上升。本研究結(jié)果顯示，AD大鼠海馬CA1區(qū)bFGF高于Sham組，當神經(jīng)功能缺失、神經(jīng)細胞退化，可刺激腦組織內(nèi)bFGF表達，保護神經(jīng)功能、修復(fù)神經(jīng)元。給予NBP治療后的大鼠，腦組織海馬CA1區(qū)bFGF表達量進一步增多，明顯高于AD組，證明NBP能明顯增加AD大鼠腦組織內(nèi)的bFGF表達，而且大鼠學(xué)習(xí)記憶能力也得到改善。

綜上研究顯示，NBP改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能是通過上調(diào)BDNF和bFGF的表達而實現(xiàn)的，為AD治療提供新思路。