曾昭清，高慧新，朱 華，田 慧

（1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530002）

褐苞薯蕷（Dioscorea persimilis Prain et Burkill），藥材名為廣山藥，為薯蕷科薯蕷屬植物，別名廣西壯族自治區(qū)（以下簡稱“廣西”）淮山，淮山藥，山板薯，分布在海拔100-1950 m 的山坡、路旁、山谷雜木林或灌叢中。我國南方各地有栽培，主產(chǎn)于廣西陸川、玉林、桂平、平南、靈山[1]。褐苞薯蕷是廣西的道地藥材，根莖入藥，其性味甘、平，具有“補脾養(yǎng)胃，生津益肺，補腎澀精”的功效，用于脾虛食少，久瀉，脾虛咳喘，腎虛遺精，帶下，尿頻，虛熱消渴等癥。此外，該藥也被《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準》收載，其性味甜、平，具有“調(diào)谷道氣道水道，補肺腎”的功效，用于埃?。人裕∪馓穑ㄏ剩┑劝Y[2]。

ISSR（inter-simple sequence repeat）即簡單重復(fù)序列，具有多態(tài)性高、重復(fù)高、穩(wěn)定性好、操作方便及成本低等優(yōu)點[3，4]。近年來ISSR 分子標記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于品種鑒定和親緣關(guān)系分析、系統(tǒng)發(fā)育遺傳多樣性的分析和與目標基因連鎖的ISSR 標記輔助育種等方面。張盾等[5]在對野生山莨菪遺傳多樣性進行研究，采用ISSR 分子標記法，研究結(jié)果表明：野生山莨菪居群之間具有較高的遺傳多樣性，各居群間遺傳距離與地理距離顯著相關(guān)。中藥的野生品與栽培品之間質(zhì)量多有不同，對臨床療效有影響。王飛等[6]比較分析了栽培山藥和野生山藥的營養(yǎng)品質(zhì)，研究表明栽培山藥營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)于野生山藥，而關(guān)于野生和栽培褐苞薯蕷遺傳多樣性分析尚未見報道。因此，本研究采用ISSR分子標記法分析野生和栽培廣山藥遺傳多樣性，研究結(jié)果將為廣山藥親緣關(guān)系和品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

表1 用于ISSR分析的褐苞薯蕷的樣品

1 實驗材料

1.1 實驗樣品的采集

本實驗采集褐苞薯蕷地上部分，分別來自廣西南寧、桂林、貴港、柳州、欽州、玉林、百色、梧州、賀州、防城港、河池、來賓、湖南永州、廣東韶關(guān)，摘取其新鮮葉片作為供試材料，立刻裝入含硅膠的密封袋中，并勤換硅膠，直至樣品干燥完全。所采集的樣品經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧教授鑒定為：薯蕷科薯蕷屬褐苞薯蕷。樣品保存于廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心樣品儲存室-20℃冰箱，備用。樣品采集信息見表1。

1.2 ISSR引物合成與處理

本實驗所用150 條引物，其中100 條來自哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的通用引物，其余50 條為自設(shè)引物，自設(shè)引物遵循ISSR 引物設(shè)計原則：2-3 個堿基簡單重復(fù)4-5 次，一端或者兩端加2-4 個錨定堿基。引物均由華大基因公司合成。引物合成后，按要求對引物進行處理：將引物管離心數(shù)秒，使DNA 聚集到管底，小心開啟管蓋，以免引起粉末飛揚丟失。按說明書加入適量ddH2O或TE緩沖液將其稀釋成10 μM 的濃度，分裝置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗儀器與試劑

2.1 實驗儀器

自動高壓滅菌鍋（Panasonic MLS-3781L），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒DHG-9240A），手掌型離心機（大龍D1008），高速冷凍離心機（德國賽默飛），梯度PCR 儀（Bio-Rad T100），電泳儀（Bio-Rad），凝膠成像儀（Bio-Rad），超純水一體機（Merck Millipore Direct-Q 5UV），渦旋振蕩儀（上海滬西XW-80A），水浴鍋(上海天恒HWS-24)

2.2 實驗試劑

DNA 提取試劑盒、RNase 酶、D2000 DNA Marker（天根生化科技有限公司），GelRed 染料（美國Biotium公司），瓊脂糖（美國英杰生命技術(shù)有限公司）

3 實驗方法

3.1 葉片基因組DNA提取

對所有樣品進行總DNA 的提取，方法按照植物總DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）操作步驟，將提取的總DNA分裝至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 引物的篩選

用104份褐苞薯蕷樣品對150條ISSR 引物進行擴增篩選，所有的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠（含GelRed 核酸染料）檢測，篩選出條帶多、清晰、多態(tài)性好的引物用于本次實驗。

3.3 PCR擴增

ISSR-PCR 反應(yīng)體系設(shè)置為：PCR 反應(yīng)體系的體積為20 μL，2 × Taq PCR Mastermix 10 μL，引物1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 8 μL。ISSR-PCR 擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性40 s，退火45 s（不同引物Tm值決定），72℃延伸2 min，34個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存[7]。

3.4 電泳檢測

取7 μL PCR 產(chǎn)物置于1.2%的瓊脂糖凝膠（含GelRed 染料）中進行電泳，電壓60 V，電泳80 min，用D2000 DNA Marker 作為標準參照。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像儀中觀察并拍照保存。

3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

3.5.1 擴增條帶的統(tǒng)計與矩陣圖的建立

ISSR 為顯性標記，同一引物擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認為是同一位點的產(chǎn)物[8]。對凝膠電泳圖進行分析，同一位點有相同的擴增條帶記為“1”，無則記為“0”，從而得到“1”和“0”的矩陣圖[9]。

表2 ISSR擴增中使用的引物

3.5.2 分析軟件對數(shù)據(jù)的處理

采用 POPGENE1.32、NTSYS2.10 軟件對 SSR-PCR數(shù)據(jù)進行歸類和分析。利用POPGENE1.32計算出：等位基因數(shù)（Number of alleles，Na）、有效等位基因（Number of effective alleles，Ne）、Shannon's 信息指數(shù)（I）、Nei's 基因多樣性指數(shù)（h）等遺傳多樣性參數(shù)，居群內(nèi)基因多樣性（Hs）、居群總基因多樣度（Ht）、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）以及基因流（Nm）等遺傳分化指標，然后利用NTSYS2.10軟件做聚類分析圖。

4 結(jié)果

4.1 引物的篩選

本實驗從150 條引物中篩選出9 條重復(fù)性好、條帶清晰且多態(tài)性高的引物，其中包含通用引物7條，自設(shè)引物2 條（自設(shè)引物序列在此因保密要求不做公開），可用于遺傳多樣性分析。引物序列見表2。

表3 褐苞薯蕷居群ISSR選擇性擴增引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶

4.2 遺傳多樣性分析

4.2.1 引物擴增結(jié)果

采用篩選出的9 條引物的最佳退火溫度對104 份褐苞薯蕷總DNA 進行擴增，共擴增出條帶106 條（圖1、表3），其中多態(tài)性條帶104 條，多態(tài)性百分比（PPB）為98.11%。其中引物多態(tài)性百分比最高達100%，引物多態(tài)性百分比最低為88.89%。

4.2.2 不同居群的樣品遺傳多樣性分析

本實驗采用POPGENE1.32 軟件對不同居群的褐苞薯蕷樣品進行遺傳多樣性分析（表4），居群名稱后“1”代表栽培樣品居群，“2”代表野生樣品居群。通過等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因（Ne）、Nei's 基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon's 信息指數(shù)（I）這幾個參數(shù)來反映供試樣品的遺傳多樣性。由整體樣本的物種水平可知，褐苞薯蕷的 Na 值為 1.9811，Ne 值為 1.6357，H 值為0.3675，I 值為0.5439，說明供試褐苞薯蕷樣品整體遺傳多樣性水平較高；野生樣品居群的Na值、Ne值、H值、I 值平均為 1.5006、1.3847、0.2108、0.3039，栽培樣品 居 群 的 Na 值 、Ne 值 、H 值 、I 值 平 均 為 1.4163、1.3080、0.1698、0.2469，兩者比較來看，供試褐苞薯蕷野生居群樣品比栽培居群樣品具有更高的遺傳多樣性。

表4 褐苞薯蕷居群間的遺傳多樣性指數(shù)

圖1 引物UBC823的PCR擴增電泳圖（圖中樣品編號分別對應(yīng)表1中各樣品）

表5 褐苞薯蕷居群間遺傳分化系數(shù)及基因流

4.2.3 遺傳分化的分析

本實驗采用POPGENE1.32 軟件對不同居群苞薯蕷樣品進行遺傳分化分析，結(jié)果見表5，來自不同居群褐苞薯蕷居群總基因多樣度（Ht）為0.3527，居群內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.1892，居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.4636。其中Gst＞Hs，說明褐苞薯蕷居群間遺傳分化度比居群內(nèi)遺傳分化度更高?；蛄鳎∟m）為0.5785 ＜1，說明褐苞薯蕷居群間遺傳分化水平較低，不同居群間基因交流較少。

4.2.4 遺傳距離的分析

采用POPGENE1.32 軟件對不同居群褐苞薯蕷的遺傳距離進行分析，褐苞薯蕷的Nei's 遺傳相似度和Nei's遺傳距離見表6。不同居群的褐苞薯蕷遺傳相似度在0.7105-0.9107 范圍內(nèi)，遺傳距離在0.0936-0.3418范圍內(nèi)，說明不同居群的遺傳相似度較高，遺傳距離較近；其中，湖南永州和廣東韶關(guān)樣品的遺傳相似度為0.9107，遺傳相似度最高；欽州和賀州樣品的遺傳相似度為0.7105，遺傳相似度最低。湖南永州和廣東韶關(guān)的遺傳距離為0.0936，遺傳距離最??；欽州和賀州樣品的遺傳距離為0.3418，遺傳距離最大。

4.2.5 不同居群樣品的NTSYS聚類分析

采用NTSYS2.10軟件對不同居群褐苞薯蕷進行聚類分析，聚類圖見圖2。遺傳相似度在0.78，可將褐苞薯蕷分成兩大類，第1類包括12個居群的樣品，第2類包括4個居群的樣品。

遺傳相似度在0.82 時，可將第1 類分為3 個亞類，第1 亞類為南寧居群的栽培和野生樣品；第2 亞類為桂林、柳州、百色、河池、賀州居群的野生樣品；第3 亞類為桂林、貴港、梧州、賀州的栽培居群樣品。遺傳相似度在 0.82 時，可將第 2 類分為 2 個亞類，第 1 亞類為欽州和玉林居群的栽培樣品；第2 亞類為湖南永州居群的栽培樣品和廣東韶關(guān)居群的野生樣品。

由上可知，大部分的野生樣品居群聚在一起，大部分的栽培樣品也是聚在一起的，表明供試褐苞薯蕷的野生樣品和栽培樣品是存在差異的；南寧居群的野生和栽培樣品聚為一類，表明南寧居群的栽培樣品為就近移栽；相近居群的野生樣品和栽培樣品分別聚在一起，表明大部分樣品的遺傳距離與地理位置有關(guān)。

表6 不同褐苞薯蕷居群遺傳相似度（左上角）與遺傳距離（右上角）

圖2 不同褐苞薯蕷居群聚類圖，居群名稱參見表1

5 討論

褐苞薯蕷作為一種很有發(fā)展前景的藥食兩用的植物，已受到人們廣泛關(guān)注，民間有崇尚食用野生廣山藥進補的傳統(tǒng)，市場上大宗商品多為栽培品[10]。已有一些研究表明，褐苞薯蕷褐可以作為山藥長期藥用及食用且具有一定的科學(xué)根據(jù)[11，12]。如今，ISSR 分子標記技術(shù)已廣泛被應(yīng)用于野生與栽培品種鑒定，蔣雨晗等[13]在對白芍親緣關(guān)系進行研究，ISSR 分子標記技術(shù)能有效檢測栽培白芍遺傳多樣性，揭示白芍遺傳背景以及栽培白芍遺傳距離的大小和親緣關(guān)系的遠近。孫稚穎等[14]采用ISSR 標記對金銀花種質(zhì)資源遺傳多樣性進行分析，研究顯示ISSR標記可以很好為金銀花的種質(zhì)資源鑒定、遺傳關(guān)系分析及栽培育種提供分子生物學(xué)依據(jù)。有學(xué)者[15-19]采用ISSR技術(shù)對中藥的野生品與栽培品進行了比較，研究結(jié)果均顯示該分子標記在遺傳多樣性方面能區(qū)分野生品和栽培品。

本研究采用ISSR 技術(shù)對不同居群褐苞薯蕷進行遺傳分析，篩選出9 條擴增效果較好的引物用于此次實驗，擴增多態(tài)性條帶104 條，多態(tài)性百分比（PPB）為98.11%，有效等位基因（Ne）為1.6305，Nei's 基因多樣性指數(shù)（H）為 0.3653 和 Shannon's 信息指數(shù)（I）為0.5413，以上結(jié)果均表明ISSR 分子標記方法適用于褐苞薯蕷的遺傳多樣性分析，本次實驗所采樣本在褐苞薯蕷DNA 水平上具有較高的遺傳多樣性水平；野生樣品居群的 Na 值、Ne 值、H 值、I 值均高于栽培樣品居群，表明褐苞薯蕷野生居群樣品比栽培居群樣品具有更高的遺傳多樣性；聚類結(jié)果表明褐苞薯蕷遺傳距離與地理距離具有一定的相關(guān)性，樣品所在地理位置和氣候特點愈相似，樣品間的生物遺傳信息愈相近；同時野生品和栽培品之間存在遺傳差異。

本研究利用ISSR 分子標記技術(shù)從基因組水平揭示了不同居群褐苞薯蕷種質(zhì)資源的遺傳差異及親緣關(guān)系，進而分析其遺傳多樣性，有助于褐苞薯蕷種質(zhì)資源的利用、發(fā)展與保護。