耿 良，呂 靜，范 敬

（1. 鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院 鄭州 450008；2. 鄭州衛(wèi)生健康職業(yè)學院中醫(yī)教研室 鄭州 450005；3. 河南中醫(yī)藥大學管理學院 鄭州 450000）

肺瘤平膏是中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院院內制劑，以益氣養(yǎng)陰、清熱解毒活血為組方原則，在臨床應用多年，深受患者好評。既往的基礎研究顯示：腫瘤細胞與腫瘤相關巨噬細胞共培養(yǎng)后，腫瘤細胞的上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）傾向增強，遷移和侵襲能力提高，同時伴有NF-κB 通路活性上調和培養(yǎng)上清中炎性因子水平升高，而肺瘤平干預后可部分逆轉這種現象[1]，這使我們認識到肺瘤平的作用可能與調控炎性微環(huán)境、影響腫瘤對機體細胞的修飾有關。近年來髓源抑制性細胞在肺癌乃至腫瘤中的作用逐漸引起重視，而炎癥正是其募集的內在基礎之一，而通過調控炎性微環(huán)境來抑制腫瘤對骨髓來源細胞的募集和修飾也可能是扶正解毒類中成藥發(fā)揮作用的內在機制之一，本人所主持的一項國家自然科學基金和一項河南省科技廳科技攻關項目的設計思路即來源于此。本研究觀察了肺瘤平聯合環(huán)磷酰胺對肺癌小鼠炎性通路以及髓源抑制性細胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）募集的作用，以進一步探索肺瘤平膏發(fā)揮抗腫瘤作用的內在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、細胞株和藥物

雄性BALB/c 裸鼠、Lewis 肺癌瘤株和實驗藥物肺瘤平膏、環(huán)磷酰胺購買途徑均與本團隊既往研究[2]相同。

1.2 主要試劑和儀器

小鼠白介素1β（IL-1β）單克隆抗體（ab200478）、信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）單克隆抗體（ab119352）、核因子κB（NF-κB p65）多克隆抗體（ab16502）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）單克隆抗體（ab181286）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）單克隆抗體（ab228402）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）單克隆抗體（ab215188）抗體購自美國abcam 公司，血管內皮生長因子A（VEGF-A）單克隆抗體（701124）、缺氧誘導因子1-α（HIF-1α）單克隆抗體（MA1-46457）購自美國Invitrogen 公司，單核細胞趨化蛋白1（MCP1）單克隆抗體（41987）購自美國Cell Signaling 公司，β-actin 單克隆抗體（TA-09）購自中國中杉金橋公司。FITC Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C 流式抗體（553127）、PE Rat anti-mouse CD11b 流式抗體（553311）購自美國BD 公司。小鼠 IL-1β（MLB00C）、VEGF-A（MMV00）、MMP-2（MMP200）、MMP-9（MMP T90）、MCP1（MJE00B）和TNF-α（MTA00B）ELISA 試劑盒購自美國R&D 公司。

流式細胞儀（美國BD 公司）；小型電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國 BIO-RAD 公司）；溫控搖床（美國New Brunswich 公司）；酶標儀（美國BioTek公司）；恒溫箱（中國Blue pard公司）。

1.3 動物造模和藥物干預

建立動物模型和藥物干預的方法同文獻[2]。

1.4 取材和觀察指標

記錄各組小鼠的體質量、腫瘤大小、食物消耗量，繪制腫瘤生長曲線，計算腫瘤增殖指數。各組均在第15天結束給藥，處死小鼠，提取小鼠外周血、脾臟和腫瘤局部的細胞，流式細胞術檢測其中Gr-1+CD11 b+MDSCs的比例。取腫瘤組織采用免疫印跡法檢測炎癥通路 IL1、TNF-α、NF-kB、STAT3 和腫瘤相關因子MMP-2、MMP-9、MCP1、HIF-1α、VEGF-A 的表達。取血 清 采 用 ELISA 法 檢 測 IL-1β、MMP-2、MMP-9、VEGF-A、TNF-α、MCP1的濃度。

1.5 流式細胞術檢測MDSCs的比例

圖1 瘤塊大小

采用參考文獻[3]方法，分別制備腫瘤組織細胞懸液、外周血細胞懸液和脾臟細胞懸液，將荷瘤小鼠外周血、脾臟和腫瘤組織的細胞分別裝入4個試管中，每管細胞數調整為1 × 106個，用PBS 懸浮細胞，混勻后離心棄上清，重復本操作洗滌2 次。前3 管細胞為對照組，1 管細胞不加抗體，1 管細胞加入 0.25 μL 的FITC Ly-6G/Ly-6C 抗體，1 管細胞加入 0.25 μL 的 PE CD11b 抗體，最后1 管作為實驗組加入上述2 種抗體，避光孵育后每管細胞加入PBS 懸浮細胞，混勻后離心棄上清，重復本步驟洗滌2次。每管加入200μL的1×PBS懸浮細胞，上流式細胞儀檢測。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白表達

操作方法同文獻[2]。

1.7 ELISA法測定血清中腫瘤相關因子的表達

摘取小鼠眼球取外周血，放置4 h，離心取血清保存于-20℃。臨用時恢復至室溫，按ELISA試劑盒說明書進行操作，測定小鼠血清 IL-1β、MMP-2、MMP-9、VEGF-A、TNF-α、MCP1的水平。

1.8 統(tǒng)計方法

數據應用SAS 9.2 統(tǒng)計軟件進行處理。統(tǒng)計描述均采用均數±標準差（）表示，假設檢驗均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法；P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義，所有檢驗均采用雙側檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠的腫瘤大小、腫瘤生長曲線和食物消耗量

各組小鼠的腫瘤大小在前9 天無明顯差別，從第10 天開始出現差異，第15 天處死小鼠時H+F 組小鼠的腫瘤體積在各組中最小，F 組小鼠腫瘤體積最大，H組和S 組相近，介于二者之間（圖1）。H+F 組小鼠的瘤塊增值率在各組中最低，食料消耗量最高（圖2-3）。

圖2 瘤塊增殖率

圖3 食料消耗量

2.2 各組小鼠外周血、脾臟、腫瘤組織中MDSCs 的比例

H 組和H+F 組小鼠腫瘤組織中和外周血中MDSCs 比例與 S 組相比呈現下降（圖 4、圖5），其中H+ F 組下降最為明顯，與S 組相比具有顯著差異（P＜0.05）。H 組和H+F 組小鼠脾臟中的MDSCs 比例與S組相比均明顯下降（圖6），與S 組相比具有顯著差異（P＜ 0.05），而H+F組下降的更為明顯（表1）。

圖5 血MDSCs比例（%）

圖6 脾MDSCs比例（%）

表1 腫瘤組織、外周血和脾臟中MDSCs的百分比（n = 10）

2.3 各組腫瘤組織炎癥通路和腫瘤相關因子的蛋白表達

H 和 H + F 組腫瘤組織中 TNF-α/IL-1-NF-κB/STAT3 炎癥通路的蛋白條帶灰度值較S 組明顯下降（P＜ 0.05），其中H + F 組下降的更加明顯，但與H 組相比，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。此外，F 組在 NF-κB/STAT3 和 TNF-α/IL-1 的表達上有所差別，與S 組相比，TNF-α/IL-1 的表達顯著降低（P＜ 0.05），但NF-κB/STAT3則無明顯差異（圖7-圖10、表2）。

H 和 H + F 組 MCP-1、VEGF、MMP-2 的蛋白條帶灰度值較S 組顯著下降，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖12、圖13、圖15）。但對HIF-1α和MMP-9來說，僅有 H + F 組的 HIF-1α和 MMP-9 的蛋白表達顯著降低，H組和F組均未降低，反而呈現升高趨勢（圖11、圖14、表2）。

圖7 TNF-α蛋白灰度值

圖8 IL1β蛋白灰度值

圖9 NF-κB蛋白灰度值

2.4 各組小鼠血清腫瘤相關因子的表達

H+F組小鼠外周血中的IL-1β、MMP-2、MMP-9、VEGF-A 的水平均較S 組顯著下降（P＜ 0.05），此外H組的IL-1β濃度與S 組相比差異也具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），而各組小鼠TNF-α、MCP1 的血清濃度均無顯著性差異（表3）。

圖10 STAT3蛋白灰度值

圖11 HIF-1α蛋白灰度值

圖12 MCP1蛋白灰度值

3 討論

炎癥是腫瘤微環(huán)境的核心特征之一，對腫瘤細胞的增殖、轉移至關重要，而在炎癥的形成和維持中并不是單單依靠腫瘤細胞自身，被腫瘤招募和修飾的各種細胞，如髓源抑制性細胞（MDSCs）、調節(jié)性樹突狀細胞（Regulatory dendritic cells，DCreg）等在其中發(fā)揮著重要作用[4]，這些細胞在被腫瘤細胞招募后，他們的生物學特性就發(fā)生了變化，會被腫瘤細胞修飾，使其向有利于腫瘤進展的方向發(fā)展[5-7]。

表2 各組小鼠腫瘤組織相關指標的蛋白條帶灰度值（n = 10）

圖13 MMP-2蛋白灰度值

圖14 MMP9蛋白灰度值

在被腫瘤招募的細胞中，MDSCs 的地位越來越受到重視，目前的研究發(fā)現，在多種腫瘤人群和荷瘤動物模型中都可見到MDSCs大量擴增，并在腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用[8]。

圖15 VEGF-A蛋白灰度值

表3 各組小鼠腫瘤相關因子的濃度/（ng·mL-1）（n = 10）

我們的研究發(fā)現，單用肺瘤平對荷瘤小鼠的腫瘤生長并沒有明顯的抑制作用，但對TNF-α/IL-1通路接到的炎癥具有一定的抑制作用。而化療藥不但可直接抑制腫瘤生長，也能同時抑制TNF-α/IL-1-和NF-κB/STAT3 通路的表達，但對外周血和腫瘤組織中的MDSCs 數量沒有顯著的影響。而肺瘤平與化療藥聯用后，小鼠腫瘤生長受到抑制最為明顯，同時該組小鼠外周血、脾臟、腫瘤組織中的MDSCs 數量在各組中最低，并伴有TNF-α/IL-1-NF-κB/STAT3 炎癥通路的抑制和 VEGF、MMP-2、IL-1β、MMP-9 等炎性和血管生成因子水平的下調。

既往研究表明，腫瘤細胞可通過自分泌途徑釋放IL-1β、TNF-α等促炎因子，TNF-α和 IL-1β在慢性炎癥的啟動中是必需的，可通過啟動炎癥反應參與腫瘤的血管生成、免疫抑制、上皮間質轉化等多個方面，而且 TNF-α本身即可增加 MDSCs 的數量[9]，IL-1β也可以誘導荷瘤小鼠體內MDSCs 的聚集和免疫的抑制[10]，他們還能通過激活NF-kB 通路放大對MDSCs 的募集力度。NFκB 通路是促炎細胞因子及與慢性炎癥相關重要介質釋放的主要調控器[11]，通過與目標蛋白特定基因序列綁定，可調控包括炎癥、免疫調控、腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移、血管新生和放化療耐受在內超過400 個基因的轉錄，從而在腫瘤的上皮間質轉化和侵襲、免疫抑制、血管生成等多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用[12]。STAT3與NFκB一樣，是機體炎癥調控的主要通路之一，激活后可促進腫瘤的生長增殖，增強腫瘤的侵襲轉移能力，加速免疫抑制微環(huán)境的形成，更是調節(jié)MDSCs的主要轉錄因子之一，其活化后可顯著擴增MDSCs，基因敲除或阻斷 STAT3 后，可減少 MDSCs 數量并促其分化，進而下調免疫抑制，增強免疫抗瘤作用[13]。而且，越來越多的研究表明，NF-κB和STAT3兩條信號通路之間存在著交叉聯系[14，15]。TNF-α/IL-1-NF-κB/STAT3 通路的活化會形成惡性循環(huán)，被募集的細胞會同原有的腫瘤細胞一起產生更多的細胞因子從而加速腫瘤進展。

除了IL-1β、TNF-α等促炎因子外，腫瘤還可通過腫瘤微環(huán)境中另一個核心特征—缺氧誘導HIF-1α表達上調進而啟動腫瘤募集。炎癥是以炎性細胞浸潤為標志，髓細胞系的中性粒細胞、單核/巨噬細胞是自然免疫系統(tǒng)最重要的細胞，炎癥部位的髓細胞約95%是經趨化、召集，通過逆氧梯度的移動，向缺氧部位浸潤的。因此，缺氧和炎癥在腫瘤微環(huán)境中互為因果，密不可分，缺氧能夠通過HIF-1α直接調控炎性因子的表達，反之亦然，IL-1β、TNF-α等致炎性細胞因子也能激活HIF-1α的轉錄活性。HIF-1α不但能通過激活COX-2、NF-κB等炎癥通路從而啟動MDSCs募集以外[16，17]，還可以刺激 MDSCs 分泌更多的精氨酸酶 1 和誘導性一氧化碳合酶，減少自然殺傷細胞對腫瘤細胞的免疫攻擊[18]，以及直接上調VEGF 和MMPs 的表達，從而調控腫瘤的血管生成。

而VEGF、MMPs是腫瘤微環(huán)境中非常重要的細胞因子，VEGF 除了刺激血管生成促進腫瘤生長以外，還是MDSCs 的化學誘導物，能促進MDSCs 的募集，而被募集的MDSCs 又可以分泌VEGF 誘導活化更多的MDSCs[19]。而MMPs 除了可以介導腫瘤細胞的上皮間質轉化和基底膜的降解，以及誘導血管新生從而促進腫瘤生長、轉移以外[20，21]，還可以通過將骨橋蛋白裂解成一種特殊的32 kDa 大小的碎片從而促進MDSCs 的活化和擴增[22]。

綜合我們的結果，我們發(fā)現單用肺瘤平對小鼠的腫瘤生長并沒有明顯的抑制作用，而化療藥則可抑制腫瘤的生長，肺瘤平+化療則抑瘤效果最優(yōu)，因此我們認為肺瘤平和化療藥物在控制肺癌小鼠腫瘤生長上具有協(xié)同作用，而這種協(xié)同作用可能來自于化療藥物對腫瘤細胞的直接殺傷，和二者對TNF-α/IL-1-NF-κB/STAT3炎癥通路的抑制，這種抑制降低了腫瘤局部VEGF、MMP-2、MMP-9、IL-1β等炎癥和血管生成因子的水平，進而減少了腫瘤對MDSCs 的募集、活化和對機體免疫的抑制。此外，HIF-1α-VEGF/MMPs 介導的血管生成也在其中發(fā)揮作用，但其作用強度和具體通路，以及與TNF-α/IL-1-NF-κB/STAT3 炎癥通路的關系如何，還需要下一步更深入的研究加以解答。