宋 敏，鞏彥龍，董萬(wàn)濤，黃 凱，董 平，3，侯紅艷，宋志靖，文浩楠

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，蘭州 730000；2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，蘭州 730020；3. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，呼和浩特，010010）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）的發(fā)生發(fā)展涉及到機(jī)體多系統(tǒng)、多組織、多器官功能的異常，統(tǒng)計(jì)顯示，骨質(zhì)疏松癥影響了近54%老年患者的生活質(zhì)量[1]，女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（postmenopausal osteoporosis，PMOP）的發(fā)病率是男性的三倍，這主要是由絕經(jīng)后雌激素缺乏引起的[2]。OP 與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（neuroendocrine-immune，NEI）網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)，可從脾腎進(jìn)行論治[3]。骨密度（bone mineral density，BMD）監(jiān)測(cè)可以診斷和預(yù)防骨質(zhì)疏松，尤其對(duì)絕經(jīng)后婦女顯得更為重要[4]。通過(guò)監(jiān)測(cè)BMD，不僅可以預(yù)測(cè)OP 性骨折的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，還可以根據(jù)患者具體情況，積極采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施，以減少OP 及骨折的發(fā)生。固本增骨方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[5，6]，其可從激素、礦物質(zhì)代謝等方面改善骨質(zhì)量，以達(dá)到防治OP 的目的。本研究采用切卵巢法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，給予固本增骨方進(jìn)行干預(yù)，旨在觀察去勢(shì)大鼠骨密度、骨代謝、骨生物力學(xué)性能及骨組織中游離[Ca2+]i 濃度的變化情況，為固本增骨方治療PMOP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的雌性SD 大鼠60只，180±20 g，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)。

1.2 藥物

固本增骨方由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供。戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂(lè)，規(guī)格1mg*21 片，國(guó)藥準(zhǔn)字J20030089，批號(hào)：208A）；水合氯醛250g/瓶（上海邦景實(shí)業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：302-17-0）。

1.3 試劑

大鼠血清BGP ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)E-EL-R0243c）、TRAP-5b ELISA 試劑盒（廣州徠智生物科技有限公司，貨號(hào)BSE12945R1）、Calcium Crimson（TM）、AM 熒光探針（Invitrogen公司，貨號(hào)C3018）。

1.4 儀器

雙能X 線骨密度儀（美國(guó)Hologic 公司，型號(hào)Discovery Wi），AG-X 系列臺(tái)式電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（島津公司，日本），激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，型號(hào)FV3000），震蕩切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)VT1000），（日本型號(hào)，型號(hào)HADAIA3601）。

1.5 方法

1.5.1 大鼠造模及分組

60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10 天后，隨機(jī)分為6 組：空白對(duì)照組、模型組、戊酸雌二醇組、固本增骨方高、中、低劑量組，各10 只。除空白對(duì)照組外，其余大鼠均采用去卵巢法[6]復(fù)制骨質(zhì)疏松模型，以上實(shí)驗(yàn)操作均在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.5.2 大鼠行為學(xué)改變

觀察動(dòng)物生理情況如精神狀態(tài)、毛色、攝食、飲水、行為、糞便、分泌物等，并記錄體質(zhì)量。

1.5.3 干預(yù)方法

采用雙能X 線骨密度測(cè)量?jī)x于造模后3月檢測(cè)各組大鼠骨密度，以確定骨質(zhì)疏松模型成功。各組大鼠給予對(duì)應(yīng)藥物干預(yù)，空白組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，固本增骨方低、中、高劑量組以成人常規(guī)劑量按人-動(dòng)物的體表面積計(jì)算法折算成等效劑量（分別為0.1 g·kg-1、0.2 g·kg-1、0.4 g·kg-1，并按照1 ml/每100 g體質(zhì)量蒸餾水稀釋?zhuān)瞥晒瘫驹龉欠胶幓鞈乙汗辔?，戊酸雌二醇組按人鼠等效劑量給予，每日90 ug·kg-1。

1.5.4 血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè)

所有動(dòng)物用藥干預(yù)12 周后，禁食水，腹腔注射麻醉，心臟取血 3 mL，3000 r·min-1離心 10 min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。各指?biāo)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測(cè)大鼠血清骨生成代謝指標(biāo)骨鈣素（osteocalcin，BGP）及骨吸收代謝指標(biāo)抗酒石酸磷酸酶（tartrate-resistant phosphatase，TRACP-5b），在 450 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度（OD 值），計(jì)算血清BGP、TRAP-5b含量。

1.5.5 大鼠全身骨密度檢測(cè)

上述各組大鼠在藥物干預(yù)12 周后，禁食12 h，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，采用雙能X 線骨密度測(cè)量?jī)x（包含有大鼠梯級(jí)標(biāo)準(zhǔn)模型和分析軟件）檢測(cè)，獲得大鼠全身骨密度。

1.5.6 三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)

解剖分離左側(cè)股骨標(biāo)本，剔除標(biāo)本周?chē)∪?、韌帶等軟組織，進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。將大鼠左側(cè)股骨置于AG-X 系列臺(tái)式電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，兩支點(diǎn)跨距為17 mm，設(shè)置加壓點(diǎn)為股骨中點(diǎn)，以2 mm·min-1加載速度開(kāi)始檢測(cè)后，用計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，采用C語(yǔ)言編程處理載荷變形曲線得出最大載荷、彈性模量等骨生物力學(xué)指標(biāo)值。

1.5.7 股骨組織中游離[Ca2+]i濃度測(cè)定

各組大鼠麻醉處死后立即取股骨組織，用振蕩切片機(jī)切成厚度約200-300 um 的薄片，染色后，觀察染色的組織細(xì)胞的某一層面的熒光圖像。Laser sharp 2000軟件掃描并拍攝圖片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析，設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)改變

造模前，各組動(dòng)物精神狀態(tài)良好，被毛光潔聳立，反應(yīng)靈敏，攝食、飲水、尿量正常，大便成形。造模術(shù)后24 h，大鼠恢復(fù)正常飲食、飲水，生存狀態(tài)良好。術(shù)后切口恢復(fù)良好。用藥干預(yù)12周，空白對(duì)照組動(dòng)物體質(zhì)量逐漸增加，飲水、攝食、尿量均正常，且毛色光亮，行動(dòng)敏捷。模型對(duì)照組動(dòng)物精神狀態(tài)較差，逐漸出現(xiàn)毛色不光、食量減少、行為遲緩、喜聚堆、弓背蜷縮、稀便等，體質(zhì)量增加不明顯；各藥物干預(yù)組狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠骨密度比較

造模后3 月，各組大鼠BMD 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠BMD 顯著性降低（P＜ 0.05），證明OP 模型成功。給予藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組BMD 值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且固本增骨方高濃度組明顯高于低濃度組（P＜0.05），呈量效依賴(lài)關(guān)系，固本增骨方各組與戊酸雌二醇組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（表1）。

2.3 各組大鼠血清骨生成及骨吸收代謝指標(biāo)比較

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠BGP、TRAP-5b 含量明顯升高（P＜ 0.05）；給予藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組BGP、TRAP-5b 含量均明顯下降（P＜ 0.05）；固本增骨方高濃度組優(yōu)于固本增骨方低濃度組（P＜0.05）（表2）。

2.4 大鼠股骨生物力學(xué)測(cè)試

大鼠股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠股骨最大載荷、彈性模量明顯降低（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組對(duì)比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組股骨最大載荷、彈性模量升高，且固本增骨方高濃度組與低濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），呈量效依賴(lài)關(guān)系，固本增骨方各組與戊酸雌二醇組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（表3）。

表1 各組大鼠全身骨密度測(cè)量值比較（，n=10）

表1 各組大鼠全身骨密度測(cè)量值比較（，n=10）

注：造模后3 月，與空白對(duì)照組比較*P ＜0.05；干預(yù)12w 后，與模型對(duì)照組比較**P ＜0.05，與固本增骨方低劑量組比較△P ＜0.05，與戊酸雌二醇組比較▲P ＞ 0.05。

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組戊酸雌二醇組固本增骨方低濃度組固本增骨方中濃度組固本增骨方高濃度組干預(yù)后0.182±0.014 0.146±0.001 0.178±0.011**0.172±0.006**▲0.185±0.008▲0.189 ± 0.011**△▲B(niǎo)MD（g·cm-2）干預(yù)前0.185±0.007 0.143±0.007*0.141±0.002*0.139±0.006*0.145±0.001*0.146±0.010*

表2 各組大鼠全身骨密度測(cè)量值比較（，ng/mL，n=10）

表2 各組大鼠全身骨密度測(cè)量值比較（，ng/mL，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較*P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較▲P ＜0.05，與固本增骨方低濃度組比較△P ＜0.05。

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表3 各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲（左）試驗(yàn)的結(jié)果（，n=10）

表3 各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲（左）試驗(yàn)的結(jié)果（，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較■P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較*P ＜0.05，與固本增骨方低濃度組比較△P ＜0.05，與戊酸雌二醇組比較▲P ＞0.05。

彈性模量（mPa）197.05±26.68 147.78±16.88■192.54±15.65*169.58±15.40*▲177.16±12.16▲198.39 ± 9.42*△▲組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組戊酸雌二醇組固本增骨低濃度組固本增骨中濃度組固本增骨高濃度組最大載荷（N）35.88±7.90 15.90±2.39■36.83±9.91*25.18±3.20*▲26.50±7.44▲33.03 ± 7.56*△▲

2.5 大鼠股骨游離[Ca2+]i濃度比較

圖1 各組大鼠股骨游離[Ca2+]i濃度（×100 um）

表4 各組大鼠股骨組織[Ca2+]i（熒光值）比較（，n=10）

表4 各組大鼠股骨組織[Ca2+]i（熒光值）比較（，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較■P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較*P ＜0.05，與固本增骨方低濃度組比較△P ＜0.05，與戊酸雌二醇組比較▲P ＞0.05。

熒光值45.32±1.93 29.41±3.07■39.27±2.58*35.29±1.76*▲35.81±2.18▲37.74 ± 2.26*△▲組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組戊酸雌二醇組固本增骨低濃度組固本增骨中濃度組固本增骨高濃度組

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠股骨游離[Ca2+]i 濃度明顯降低（P＜ 0.05）；藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組股骨游離[Ca2+]i 濃度均明顯升高（P＜0.05）；且固本增骨方高濃度組優(yōu)于固本增骨方低濃度組（P＜0.05）（圖1、表1）。

3 討論

我國(guó)是世界人口大國(guó)，人口基數(shù)大，隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加快，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也在逐步增加，骨質(zhì)疏松及其導(dǎo)致的骨折等嚴(yán)重并發(fā)癥，不僅給患者造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且占據(jù)了大量的醫(yī)療資源。PMOP 尤其令人關(guān)注，因它導(dǎo)致骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加，對(duì)老年婦女的健康產(chǎn)生負(fù)面影響[7]。雌激素可通過(guò)降低核因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor kabba beta ligand，RANK）的活性和增加成骨細(xì)胞中的BGP 表達(dá)而降低破骨細(xì)胞分化，以調(diào)節(jié)骨質(zhì)量和骨微結(jié)構(gòu)；而絕經(jīng)和卵巢切除術(shù)后，骨轉(zhuǎn)化率增加50%-100%，由于雌激素短期內(nèi)急劇減少可以通過(guò)上調(diào)核因子-κB受體活化因子RANK 的表達(dá)和增加促炎細(xì)胞因子的活性，以激活骨細(xì)胞的骨破壞作用[8]。

PMOP 屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨枯”等范疇。《景岳全書(shū)·痿論》曰：“腎者，水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”，可見(jiàn)骨痿由腎藏于骨之髓不充滿所致，即所謂“骨枯髓空”；《靈樞·決氣篇》曰“谷氣入滿，淖澤注于骨”，言明了飲食化生水谷精微影響骨的生長(zhǎng)，骨與脾胃關(guān)系密切；《素問(wèn)·五臟生成篇》曰：“腎之合骨也，其榮在發(fā)，其主脾也”，即若脾虛不運(yùn)，則肌肉痿弱，水谷精微不能生精化髓，骨髓濡養(yǎng)無(wú)源，引發(fā)“骨痿”，可見(jiàn)先天腎與后天脾共司骨骼與肌肉作為人體運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)[9]。本研究治PMOP 從中醫(yī)辨證理論及中藥藥理出發(fā)，以“骨枯髓空、骨肉不相親”為病機(jī)關(guān)鍵，從脾、腎論治，治以益氣健脾、補(bǔ)腎壯骨，確立“固本增骨丸”方。

骨密度是臨床骨質(zhì)疏松診斷、危險(xiǎn)性、預(yù)后及療效評(píng)估的金指標(biāo)，但是單純的全身或局部骨密度測(cè)定無(wú)法全面的了解患者的骨代謝、各組織器官水平與骨形成/破壞相關(guān)的信息，在一定程度上無(wú)法完全反映骨生物力學(xué)、生物信息的完整性[10]。通過(guò)對(duì)骨生物力學(xué)的研究，不僅能反應(yīng)骨組織在外力作用下的力學(xué)特性，而且能反映出骨組織在受力后所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，單位體積內(nèi)骨量減少、骨質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)（包括骨小梁結(jié)構(gòu)、密度等）的改變均能影響骨生物力學(xué)，從而降低骨生物力學(xué)強(qiáng)度。生物力學(xué)性能包括骨組織的結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)，常見(jiàn)指標(biāo)包括最大載荷、彈性模量等，骨生物力學(xué)是評(píng)價(jià)藥物對(duì)骨質(zhì)量的一項(xiàng)可靠指標(biāo)[11]。骨骼鈣狀況對(duì)OP 風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估非常重要[12]，直接測(cè)量的電離鈣（M-ICA）被認(rèn)為是OP 評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)[13]，骨骼中游離的鈣離子在鈣調(diào)蛋白、蛋白激酶、腺苷酸環(huán)化酶和環(huán)磷酸腺苷磷酸二酯酶等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用下，沉積在骨骼，有利于骨健康[14]。

本研究各組大鼠全身BMD測(cè)量結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠BMD 值顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明在大鼠卵巢切除3 月后，全身BMD 下降，OP 模型復(fù)制成功；給予藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方組均可不同程度地提高BMD 值，且固本增骨方呈量效依賴(lài)關(guān)系，說(shuō)明固本增骨方可以明顯改善卵巢切除大鼠骨密度。研究顯示：成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）分泌BGP[15]，血清BGP 的變化能反映OB 的活性，TRACP-5b[16]可反映破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）數(shù)量及功能活性。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠血清BGP、TRACP-5b 含量均增高（P＜ 0.05），說(shuō)明大鼠卵巢切除后，OC 和OB 活性均增強(qiáng)，骨轉(zhuǎn)換速率加快導(dǎo)致骨量流失增加，呈“高轉(zhuǎn)換型”。而經(jīng)過(guò)用藥干預(yù)后，與模型對(duì)照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組血清BGP、TRACP-5b 含量均明顯降低（P＜0.05），說(shuō)明戊酸雌二醇組和固本增骨方均可影響OC 和OB 活性而改善骨代謝。大鼠股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠股骨最大載荷、彈性模量明顯降低（P＜0.05），而經(jīng)過(guò)固本增骨方治療12 周后，能明顯改善卵巢切除大鼠股骨結(jié)構(gòu)生物力學(xué)性能，最大載荷、彈性模量均有所升高（P＜0.05），說(shuō)明大鼠卵巢切除后，隨著體內(nèi)雌激素水平的降低，骨量丟失，骨脆性增大，固本增骨方在一定程度上可以改善卵巢切除大鼠股骨結(jié)構(gòu)的生物力學(xué)性能性，增加骨強(qiáng)度，提高骨剛度及抗骨變性和骨折能力；大鼠股骨游離[Ca2+]i 濃度比較顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠股骨游離[Ca2+]i 濃度明顯降低（P＜ 0.05），藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組股骨游離[Ca2+]i 濃度均明顯升高（P＜0.05）；且固本增骨方高濃度組優(yōu)于固本增骨方低濃度組（P＜0.05），說(shuō)明去卵巢OP 大鼠，骨組織中鈣離子濃度降低，固本增骨方在一定程度上能提高骨組織中鈣離子濃度，從而發(fā)揮抗OP 的作用；而戊酸雌二醇組和固本增骨方不同劑量組結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明固本增骨方在改善骨生物力學(xué)性能及提高骨組織中鈣離子濃度方面，具有雌激素樣作用。

固本增骨方是甘肅中醫(yī)藥大學(xué)宋敏教授應(yīng)用于臨床多年總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，由炙黃芪、白條黨參、岷當(dāng)歸、炙淫羊藿、燙狗脊、鹽補(bǔ)骨脂組成，方中大量應(yīng)用君藥炙黃芪以補(bǔ)氣升陽(yáng)，生津養(yǎng)血；臣藥黨參補(bǔ)中益氣、生津和胃，二藥相配健脾補(bǔ)氣[17]，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，二者共為臣藥，輔助黃芪，在益氣養(yǎng)血的同時(shí)，提高脾之運(yùn)化功能，增加后天氣血生化之源，健脾，后天脾氣資助先天腎氣。補(bǔ)骨脂、淫羊藿溫腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨，燙狗脊補(bǔ)益肝腎、填精益髓，三藥合用，則可溫腎陽(yáng)、填精髓、壯腰膝，共為佐藥[18，19]。諸藥合用，共奏脾腎雙補(bǔ)、溫陽(yáng)益氣、活血通絡(luò)之功效，標(biāo)本兼顧，有效緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥狀。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：固本增骨方可改善卵巢切除大鼠模型全身骨密度，改善骨代謝，有效提升骨生物力學(xué)性能，提高股骨組織游離[Ca2+]i 濃度，從而發(fā)揮對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治作用。