段進剛，陳建豪，楊榮榮，馬春江

（哈密市動物疫病預(yù)防控制中心，新疆 哈密 839000）

蜜蜂歐洲幼蟲腐臭?。‥urope foulbrood，EFB） 是一種蜜蜂幼蟲病，又稱爛子病、黑幼蟲病，是由蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton,MSP） 引起蜜蜂幼蟲發(fā)病的一種惡性、細菌性傳染病[1]。該病于1885 年首次在歐洲系統(tǒng)報道，目前廣泛發(fā)生，其傳播迅速快，危害性大，以3～4 日齡未封蓋幼蟲死亡為特征[2]。國際獸醫(yī)局(OIE)將其列為B 類疫病。

該病為多種細菌綜合作用所引起，其中以蜂房蜜蜂球菌為主要致病菌[3]。被污染的蜂蜜、花粉、巢脾是主要傳染源。蜂房蜜蜂球菌能在尸體及蜜粉脾、空脾中存活多年，蜜蜂幼蟲為主要感染對象，各齡及各個品種未封蓋的蜂王、工蜂、雄蜂幼蟲均可感染，尤以1～2 日齡幼蟲最易感，成蜂不感染[4-6]。該病多發(fā)生于春季，夏季少發(fā)或平息，秋季可復(fù)發(fā)，但病情較輕。該病潛伏期一般為2`3 d，主要會引起3～4 日齡未封蓋幼蟲死亡、腐爛。死亡幼蟲開始呈灰白色，不飽滿，無光澤，死后蟲體呈黃灰色，在巢房里腐爛，發(fā)出酸臭味，有滲出液，無黏性，不拉絲。該病為細菌感染引起，用抗菌素治療可以得到較好的效果[7-10]。

近年來，歐洲蜜蜂幼蟲腐臭病呈流行性趨勢，并且在蜜蜂中危害更大，有的已造成重大經(jīng)濟損失，引起了人們的廣泛關(guān)注和重視。目前，用于檢測蜜蜂病原的診斷技術(shù)很多，LAMP 技術(shù)已用于檢測多種蜜蜂病原微生物，如黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus，BQCV）、以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus，IAPV）、歐洲幼蟲腐臭病（Europe foulbrood，EFB）、美洲幼蟲腐臭?。ˋmerican foulbrood，AFB）、黃曲霉?。⊿tone brood，SB）、蜜蜂微孢子蟲病等[11-16]。

在養(yǎng)蜂過程中，開蓋檢查對該病的預(yù)防有滯后性，光學(xué)顯微鏡檢使用相對不可靠，PCR檢測需要昂貴的儀器且核酸擴增反應(yīng)時間較長。歐洲蜜蜂幼蟲腐臭病的防控亟需準(zhǔn)確、快速、方便且特性強的檢測蜂房鏈球菌的方法。本研究以蜂房蜜蜂球菌16S rRNA 基因序列為保守序列設(shè)計6 條特異引物,建立特異檢測蜂房蜜蜂球菌的LAMP 檢測方法，豐富歐洲蜜蜂幼蟲腐臭病分子檢測手段，為基層快速診斷和預(yù)防該病提供了新的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 毒株與病料

蜂房蜜蜂球菌（Melissococcuspluton，MSP）、蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis，APA)、蜜蜂殘翅病毒（Deformed wing virus，DWV）、蜜蜂囊狀幼蟲病毒（Sacbrood virus，SBV）、黑蜂王臺病毒（B lack queen cell virus，BQCV）、以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus，IAPV） 均購自中國獸藥監(jiān)察所；疑似蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病幼蟲及其他樣品（100 份） 由本單位分離保存。

1.2 主要儀器和試劑

PCR 儀、凝膠成像儀、紫外分光光度儀、三氣培養(yǎng)箱、離心機，均購自Thermo Fisher公司；高通量水平電泳儀及電泳槽，購自君意東方公司；恒溫水浴鍋、金屬浴，購自GRANT 公司；移液器，購自Eppendorf 公司，電子天平購自北京賽多利斯公司。

RCR 擴增試劑盒購自TAKARA 公司，Bst DNA 聚合酶、10×ThermoPol 反應(yīng)緩沖液購自自賽默飛生物技術(shù)有限公司公司；dNTPs、甜菜堿（betaine） 購自鼎國昌盛（北京） 有限公司；DL 2000 DNA Marker 購自TaKaRa 公司；硫酸鎂（MgSO4） 購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；溴化乙錠（EB） 和瓊脂糖粉購自上海生工生物公司；細菌基因組DNA 抽提試劑盒購自上海生工生物公司；牛肉膏、蛋白胨均購自北京奧博星生物技術(shù)公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

檢索GenBank 中的所有蜂房蜜蜂球菌的基因序列，通過DNAMAN 和DNASTAR 軟件分析找出特異性的保守靶DNA 序列，然后再通 過 PrimerExplorer V5 在 線 軟 件 （https：//primerexplorer.jp） 設(shè)計出一套特異性的LAMP引物，包括兩條外引物F3、B3，兩條內(nèi)引物FIP、BIP 及兩條環(huán)引物FL、BL，上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。

表1 LAMP 擴增引物序列

1.4 蜂房蜜蜂球菌的培養(yǎng)及核酸的提取與驗證

將疑似有蜂房蜜蜂球菌的蜜蜂樣品在破碎機上打碎，然后按無菌操作取少量樣品，加入少許無菌生理鹽水制成懸浮液，用接種環(huán)蘸取懸浮液，以畫線法接種于牛肉膏瓊脂平板，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中（5% CO2） 觀察，24 h 后挑取單個菌落，接種于新的牛肉膏瓊脂中，37 ℃培養(yǎng)24-48 h。蜂房蜜蜂球菌核酸提取,按生工生物工程(上海)有限公司細菌基因組小量提取試劑盒說明書的方法提取蜂房蜜蜂球菌DNA,并根據(jù)其PCR 特異性引物（F：5′-GAAGAGGAGTTAAAAGGCGC -3′；B：5′-TTATCTCAAGGCGTTCAAAGG -3′）驗證，瓊脂糖凝膠電泳條件為100 V，30 min。置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LAMP 法體系的建立及優(yōu)化

以蜂房蜜蜂球菌DNA 為模板，LAMP 反應(yīng)體系如下：8 U Bst DNA 聚合酶,10×ThermoPol緩沖液，Mg2+終濃度為5～30 mmol/L，dNPTs終濃度為0～1.8 mmol/L，甜菜堿終濃度為0.4～1.4 mol/L，反應(yīng)溫度分別為54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃，反應(yīng)時間10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，內(nèi)、外、環(huán)引物濃度比的優(yōu)化，最后80℃熱處理5 min 終止反應(yīng)。反應(yīng)在恒溫水浴鍋和金屬浴中進行，用移液器取LAMP 擴增反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，加入到1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)凝膠成像儀檢測得到結(jié)果。在優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)條件時都必須進行多次重復(fù)實驗，根據(jù)試驗結(jié)果的穩(wěn)定性，最終確定最佳的濃度及最佳溫度和時間。

1.6 LAMP 與PCR 方法特異性檢測

用優(yōu)化好的LAMP 方法和PCR 方法分別將蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,APA)、蜜蜂殘翅病毒（Deformed wing virus，DWV）、蜜蜂囊狀幼蟲病毒（Sacbrood virus，SBV）、黑蜂王臺病毒（Black queen cell virus，BQCV）、以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus，IAPV） 等作為參照，釆用最佳反應(yīng)條件在LAMP 和PCR 中擴增。每次擴增反應(yīng)的同時設(shè)DEPC 水作陰性對照和蜂房蜜蜂球菌作為陽性對照,以本研究建立的檢測方法進行特異性檢測，同時以常規(guī)PCR 檢測方法為對照，驗證LAMP 檢測方法的特異性，檢測結(jié)果通過電泳及凝膠成像儀分析判斷結(jié)果。

1.7 LAMP 與PCR 方法靈敏性檢測

對蜂房蜜蜂球菌DNA 溶液10 倍梯度稀釋，然后采用本研究建立的LAMP 檢測方法進行檢測，同時進行常規(guī)PCR 檢測，并對各自產(chǎn)擴增物進行瓊脂糖凝膠電泳對比分析，進行靈敏度評估。其中，LAMP 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件以本研究優(yōu)化的最佳體系和條件進行檢測；PCR 反應(yīng)體系為：上下游引物各0.5 μL，PCR Mix 10 μL，蜂房蜜蜂球菌DNA 2μL，d dH2O 6μL，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95℃預(yù)變性30 s、58℃預(yù)變性15 s、72℃預(yù)變性60 s，40 個循環(huán)；72℃預(yù)變性5 min。

1.8 臨床樣本檢測

從10 群蜂中采取蜜蜂幼蟲檢測，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，同時做加入鈣黃綠素?zé)晒庠噭┰囼?，用紫外儀檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂房蜜蜂球菌DNA 的提取及驗證

將PCR 的上下游引物作為驗證性引物，檢測蜂房蜜蜂球菌的核酸，PCR 特異性引物產(chǎn)物條帶為829 bp，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像儀分析，結(jié)果顯示目的序列的理論擴增片段大小與實驗結(jié)果基本相符，說明DNA 是蜂房蜜蜂球菌的。結(jié)果見圖2-0。

圖2-0 PCR 驗證結(jié)果

2.2 LAMP 方法反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

LAMP 擴增體系也會受到一些相關(guān)因素的影響。根據(jù)最新文獻顯示[17,18]，影響擴增反應(yīng)的幾個主要影響因素如：擴增溫度、反應(yīng)時間、引物濃度、Mg2+濃度、Betaine 濃度、dNPTs 濃度等，只有通過進行反復(fù)實驗來優(yōu)化出整個反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)條件。

2.2.1 擴增溫度的優(yōu)化

參照引物的退火溫度，選取54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃、64 ℃六個溫度做平行對照實驗，電泳檢測結(jié)果（見圖2-1），試驗反復(fù)2 次后，當(dāng)溫度控制在58 ℃、60 ℃、62 ℃或64 ℃時，擴增效率均較高。因此，將本試驗的退火溫度設(shè)在58 ℃。

圖2-1 LAMP 溫度優(yōu)化結(jié)果

2.2.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化

分別選取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 六個擴增時間做平行對照實驗，電泳檢測結(jié)果（見圖2-2），20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 均有條帶，50 min 和60 min 的條帶梯度性更好。因此選擇擴增時間為50 min。

圖2-2 LAMP 時間優(yōu)化結(jié)果

2.2.3 引物濃度的優(yōu)化

圖2-3 LAMP 引物濃度優(yōu)化結(jié)果

58℃，50min 的條件下，做5 組不同引物濃度的平行對照實驗，檢測結(jié)果顯示（見圖2-3)。.1～5 泳道分別代表不同的引物濃度擴增結(jié)果。在第4 組可見明顯的特異性擴增，其余泳道擴增條帶梯度型不是很好，即內(nèi)、外、環(huán)引物的最佳反應(yīng)濃度比為1∶4∶8。

2.2.4 鎂離子濃度的優(yōu)化

選取5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM 共6 個Mg2+濃度，在上述最佳反應(yīng)條件下進行LAMP 擴增。檢測結(jié)果顯示(見圖2-4)，6 個泳道都可見梯狀條帶出現(xiàn)，但第6 泳道亮度、梯度較高。因此認(rèn)為Mg2+最優(yōu)終濃度為30 mM。

圖2-4 LAMP Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果

2.2.5 Betaine 濃度的優(yōu)化

在58 ℃的溫度條件下，選擇引物濃度最佳的進行RT－LAMP 擴增，電泳檢測結(jié)果（見圖2-5），1、2、3、4、5 泳道均可見擴增的梯狀帶，亮度相似，但1 泳道的條帶梯度性略高于其它四個泳道。因此認(rèn)為甜菜堿最適終濃度為0.4 M。

圖2－5 LAMP Betaine 濃度優(yōu)化結(jié)果

2.2.6 dNPTs 濃度的優(yōu)化

選取0.3 mmol/L、0.6 mmol/L、0.9 mmol/L、1.2 mmol/L、1.5 mmol/L、1.8 mmol/L 共6 個dNPTs 濃度，在上述最佳反應(yīng)條件下進行LAMP 擴增。電泳結(jié)果顯示(見圖2-6)，1、2、3、4 泳道可見梯狀條帶出現(xiàn)，但第3 泳道的梯度性最好。因此認(rèn)為dNPTs 最優(yōu)終濃度為0.9 mmol/L。

圖2－6 LAMP dNPTs 濃度優(yōu)化結(jié)果

2.2.7 LAMP 與PCR 方法特異性檢測結(jié)果

利用優(yōu)化后的最佳LAMP 反應(yīng)條件，對蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂球囊菌蜜蜂殘翅病毒、蜜蜂囊狀幼蟲病毒、黑蜂王臺病毒、以色列急性麻痹病毒的核酸樣品同時進行LAMP 和PCR擴增。結(jié)果如圖2-7、2-8 所示，表明該引物與上述其他病毒核酸樣品間均沒有擴增條帶，說明該LAMP 方法和PCR 方法具有很好的特異性。

圖2－7 LAMP 特異性檢測結(jié)果

圖2－8 PCR 特異性檢測結(jié)果

2.2.8 LAMP 與PCR 方法靈敏性檢測結(jié)果

用TE 緩沖液將上述已知拷貝數(shù)的DNA 進行10 倍稀釋，取稀釋度為7.231×106拷貝/μL～7.231×10-1拷貝/μL 作為模板，進行LAMP和PCR 擴增，結(jié)果顯示（如圖2-9），LAMP 可以檢測到7.231×101拷貝/μL 的模板量，PCR只能檢測到7.231×103拷貝/μL 的模板量，LAMP 方法的敏感性是常規(guī)PCR 方法的100倍?？梢姳驹囼炈⒌腖AMP 檢測方法在檢測蜂房蜜蜂球菌中具有很高的敏感性，對于早期診斷和基層檢疫具有很重要的意義。

圖2－9 LAMP 敏感性檢測結(jié)果

圖2－10 PCR 敏感性檢測結(jié)果

2.2.9 LAMP 和PCR 方法樣品檢測結(jié)果

利用本試驗建立的LAMP 和PCR 檢測方法，對采集的100 份蜜蜂樣品進行檢測，結(jié)果顯示（如圖2-11、2-12），用LAMP 方法檢測出8 份為陽性，通用PCR 檢測出6 份陽性，說明在LAMP 方法具有很好的檢出率。

圖2－11 LAMP 樣品檢出結(jié)果

圖2－12 PCR 樣品檢出結(jié)果

2.2.10 LAMP 的可視化結(jié)果

在LAMP 反應(yīng)結(jié)束后瞬時離心后，將EP管放到紫外箱中觀察，結(jié)果顯示，反應(yīng)結(jié)束后將PCR 管進行離心，陽性管管底有少量白色沉淀，陰性管反應(yīng)液體清亮無沉淀，加入染料的陽性管為翠綠色，而陰性管為本來的淡橙色；在紫外光下陽性管溶液發(fā)出綠色熒光，陰性對照管溶液為原來的橘黃色熒光（如圖2-13）。

圖2-13 LAMP 的可視化結(jié)果

3 討論

LAMP 是一種新的體外核酸擴增方法，日本R.Vrund 團隊于2000 年開發(fā)，適用于多種基因的體外診斷，也叫環(huán)形核酸擴增法[18]。它利用鏈置換DNA 聚合酶和兩個內(nèi)引物（FIP和BIP） 和兩外引物（F3 和B3），特異識別目標(biāo)靶序列上6 個區(qū)域[17]，另外兩個環(huán)引物（loop-f，loop-b），LAMP 可以在退火擴增循環(huán)的結(jié)構(gòu)上提高反應(yīng)速度和特異性[19]?？梢栽诰W(wǎng)上找到有助于理解的相應(yīng)動畫，LAMP已經(jīng)檢測了許多病原體，認(rèn)為該技術(shù)的性能具有優(yōu)于常規(guī)PCR 的優(yōu)勢。這些包括蜜蜂疾病的檢測，例如蜜蜂球囊菌[20]、以色列急性麻痹病毒[21]、囊狀幼蟲病毒[22]的檢測。

LAMP 技術(shù)是一個非常實用的檢測工具，可以用于目標(biāo)細菌、病毒的驗證性診斷和快速分化。LAMP 在檢測過程中，為了防止開蓋造成的氣溶膠的污染，在試驗前嵌入染料作為LAMP 實時監(jiān)測的檢測策略，這種方法已被成功應(yīng)用[23]。LAMP 的反應(yīng)可以在一個簡單的熱塊或水浴鍋中進行，結(jié)果可以通過肉眼觀察熒光染料的顏色變化來獲得[24]，這使得該技術(shù)在資源有限的基層特別具有吸引力。然而研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)雜的引物設(shè)計是LAMP 的主要缺點，即使使用在線設(shè)計軟件，整個過程也是耗時的，LAMP 引物的好壞直接影響整個試驗的成功與否，所以LAMP 反應(yīng)的成功依賴于所選的引物[25]。

本研究建立的LAMP 體系特異性強，靈敏性高，在58℃反應(yīng)50 min 就可以完成臨床檢測。根據(jù)凝膠電泳建立的反應(yīng)體系在恒溫水浴鍋和金屬浴中就可以實現(xiàn)，而且判定結(jié)果的方法比PCR 法多，較PCR 法更方便早期檢測歐洲幼蟲腐臭病,因此很適合基層的現(xiàn)場檢疫和臨床檢測。

4 結(jié)論

本研究建立了蜂房蜜蜂球菌的LAMP 檢測方法，通過多次重復(fù)試驗優(yōu)化確定了最優(yōu)LAMP 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，反應(yīng)體系中鎂離子濃度為30 mM，Betaine 濃度為0.4M，dNTPs 濃度為0.9 mmol/L，內(nèi)、外、環(huán)引物濃度比為1∶4∶8，最優(yōu)反應(yīng)條件為58℃，50min。在最優(yōu)條件下LAMP 可檢測蜂房蜜蜂球菌DNA 的最低檢測量為7.231×101拷貝/μL，通過特異性檢測實驗表明LAMP 檢測方法具有良好的特異性。本研究所建立的蜂房蜜蜂球菌LAMP 檢測方法具有準(zhǔn)確、靈敏、便捷、成本低以及特異性強等優(yōu)點，為基層快速診斷和預(yù)防該病提供了新的技術(shù)，并且為提前預(yù)防、有效控制歐洲幼蟲腐臭病和降低蜂產(chǎn)品中藥物殘留提供了依據(jù)。