程 遂，逯 峰，黃 勃①，郭云鵬

(1.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 海口 570228；2.南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 ?？?570228；3.教育部熱帶生物資源重點實驗室，海南 ?？?570228)

紅樹蜆(Polymesodaerosa)隸屬于軟體動物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)簾蛤目(Veneroida)蜆科(Corbiculidae)紅樹蜆屬(Polymesoda)，廣泛分布于熱帶、亞熱帶紅樹林和灘涂，是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中特有的雙殼貝類，在我國海南、廣西、廣東和臺灣等主要紅樹林區(qū)均有分布[1]。紅樹蜆體型較大，生長快，是紅樹林周邊居民采集的主要經(jīng)濟貝。臺灣地區(qū)自20世紀(jì)末開展紅樹蜆養(yǎng)殖，現(xiàn)已初具規(guī)模，而廣東和廣西地區(qū)也已開始小規(guī)模養(yǎng)殖[2]。由于紅樹蜆分布地域特殊，對紅樹蜆的研究主要集中在生態(tài)學(xué)方面，如棲息環(huán)境、生活習(xí)性、生長繁殖和種群結(jié)構(gòu)等[3-4]。

當(dāng)前，我國海洋污染狀況嚴(yán)重，由于雙殼貝類種群數(shù)量大，分布范圍廣，移動性差，營濾食生活，對重金屬和有機物的富集能力比其他生物更強，其作為指示物種已被廣泛用于海洋環(huán)境污染的生物監(jiān)測[5]，目前關(guān)于重金屬富集對雙殼貝類的影響研究主要集中在牡蠣、扇貝等經(jīng)濟貝類[6-7]，而對紅樹蜆的相關(guān)研究則較少[8]。

重金屬Cr是造成海洋環(huán)境污染的重要原因之一，Cr6+在參與生物體氧化還原反應(yīng)時可以產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，造成氧化脅迫，而水生生物體內(nèi)含有大量多元不飽和脂肪酸，對氧化反應(yīng)十分敏感[9]，因此其體內(nèi)Cr6+富集易造成過氧化代謝產(chǎn)物積累，從而對各器官產(chǎn)生毒性效應(yīng)[10]。卵黃蛋白的合成與否表示卵母細胞的發(fā)育是否完善[11]，而雙殼貝類卵黃蛋白原由雌激素受體er基因和特異存在于成熟雌性動物體中卵黃蛋白原vtg基因進行調(diào)控[12]，因此這2種基因表達量在一定程度上能夠說明紅樹蜆卵巢發(fā)育的健康和成熟情況。通過分析不同劑量Cr6+暴露下紅樹蜆卵巢性腺指數(shù)(GSI)和2種氧化逆境標(biāo)志物活性及其介導(dǎo)基因表達量的變化情況，研究Cr6+暴露對紅樹蜆的生殖毒性效應(yīng)，可為探究重金屬對紅樹蜆生殖毒性機制、保護貝類種質(zhì)資源和開展海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2019年7月，紅樹蜆繁殖旺季，在海南省文昌市八門灣海區(qū)霞場村附近海域(19°37′28.02″ N、110°47′38.84″ E)采集紅樹蜆。經(jīng)形態(tài)判別后挑選大小相近的紅樹蜆300個用于試驗并測量生物學(xué)性狀，樣本平均殼長為(49.85±3.42) mm，平均殼寬為(26.74±1.58) mm，平均殼高為(45.83±3.57) mm，平均濕重為(35.62±4.31) g。運回試驗室后用自來水刷洗貝殼表面游泥后，擦干表面水分，并在5個100 cm×80 cm×90 cm的養(yǎng)殖箱中培養(yǎng)5 d，養(yǎng)殖條件：海水鹽度為30‰，溫度為(27±1) ℃，pH值為8.0。

1.2 試驗方法

1.2.1暴露試驗方法

配制5組不同質(zhì)量濃度Cr6+溶液：0(對照)、0.25(低濃度)、1(中濃度)、4(較高濃度)和8 mg·L-1(高濃度)。將300個紅樹蜆隨機分為5組，每組60個。試驗期間，每組持續(xù)充氧，每天將養(yǎng)殖用水全部更換一次，早、晚各投喂足量螺旋藻粉。每組分別于暴露試驗0、5、10和15 d時隨機取樣，挑選并解剖5個雌性紅樹蜆用于指標(biāo)測定。

1.2.2雌性紅樹蜆性腺指數(shù)的測定

稱量各雌性紅樹蜆軟體部質(zhì)量，然后分離性腺，將其用生理鹽水沖洗后用濾紙吸去水分，GSI為生物性腺濕重與軟體部濕重的比值[13]。

1.2.3氧化逆境標(biāo)志物的提取與酶活性的測定

切取部分性腺組織用于制備酶液。每1 g組織樣品用預(yù)冷雙蒸水3 mL混合，勻漿5 min，外置冰塊降低溫度。然后將勻漿液倒入離心管中，在0 ℃條件下按20 000 r·min-1(離心半徑為10 cm)離心20 min，取上清液測定紅樹蜆性腺組織抗氧化酶活性，重復(fù)3次?？寡趸δ軠y定指標(biāo)選擇過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)和過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)。各項指標(biāo)均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒進行測定，具體操作參見產(chǎn)品說明書。

1.2.4基因表達的分析

為了研究高濃度與低濃度Cr6+對紅樹蜆卵巢中過氧化氫酶基因cat、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因gst、雌激素受體基因er和卵黃蛋白原基因vtg表達量影響的差異，除對照外，另外選取低濃度處理(0.25 mg·L-1)與高濃度處理(8 mg·L-1)進行測定。

基因表達量采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)方法進行檢測。使用Eastep?Super總RNA提取試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)從樣品中提取總RNA，具體操作參見產(chǎn)品說明書。經(jīng)分光光度計(島津 UV-2450)檢測總RNA純度(OD260/OD280)后，取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。從紅樹蜆轉(zhuǎn)錄組文庫[14]中經(jīng)功能注釋后挑選目的基因序列，并使用Primer 5軟件設(shè)計引物序列(表1)，合成操作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 qPCR引物序列

Table 1 Primers used for qPCR

基因名稱引物序列產(chǎn)物大小/bpcatF:5′-CTCAGCCGGGCCAAAAATCGGCTAG-3′,R:5′-CTAGCCGATTTTTGGCCCGGCTGAG-3′783gstF:5′-ATGCCCGAGTTAGGCTACTGGAAAA -3′,R:5′-TTTTCCAGTAGCCTAACTCGGGCAT -3′852erF:5′-AGGGATGACCTAGAAGCAATATGGA -3′,R:5′-TCCATATTGCTTCTAGGTCATCCCT-3′324vtgF:5′-ATGCCCAGCTGTGCTAAAAGAAGTT-3′,R:5′-AACTTCTTTTAGCACAGCTGGGCAT -3′487β-actinF:5′-ACAGGGAAGCCAAGATGGAA-3′,R:5′-TTGCCGACAGAATGCAGAAG-3′132

qPCR反應(yīng)體系為10 μL，包含SYBR Premix Ex TaqTM5 μL，10 μmol·L-1正反向引物各0.4 μL，10倍稀釋的cDNA 模板1 μL，RNasefree H2O 3.2 μL。qPCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。選取β-actin作為內(nèi)參基因[15]，試驗樣本與對照樣本目標(biāo)基因的相對表達水平采用2-ΔΔCt(Livak)法計算，并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cr6+脅迫下雌性紅樹蜆性腺指數(shù)

GSI值越大，說明紅樹蜆性腺發(fā)育越好。不同濃度Cr6+對紅樹蜆卵巢性腺指數(shù)的影響見圖1。由對照組紅樹蜆卵巢GSI變化趨勢可知，試驗所用紅樹蜆處于成熟期后期。在Cr6+脅迫下，隨暴露時間和暴露濃度的增加，各濃度處理紅樹蜆GSI均呈下降趨勢，且暴露時間越長，下降程度越明顯。試驗前、中期(5和10 d)，低濃度處理(0.25 mg·L-1)紅樹蜆GSI與對照相比無顯著差異(P>0.05)；在整個試驗期，較高和高濃度處理(4和8 mg·L-1)GSI顯著小于低、中濃度處理(0.25和1 mg·L-1)(P<0.05)；8 mg·L-1處理暴露15 d時GSI最小，比對照0 d時下降64%。

直方柱上方英文小寫字母不同表示同一暴露時間不同處理間性腺指數(shù)差異顯著(P<0.05)。

2.2 卵巢氧化逆境標(biāo)志物活性、含量和基因表達水平變化

2.2.1卵巢CAT和GST活性變化

不同濃度Cr6+脅迫后，紅樹蜆卵巢CAT和GST活性變化見圖2。如圖2所示，中、低濃度處理紅樹蜆卵巢CAT活性在試驗前期(5 d時)即受到誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)效果顯著(P<0.05)，但在10 d后其與對照相比無顯著差異(P>0.05)。除8 mg·L-1處理外，其他處理CAT活性在試驗前期(5 d時)達到最大值后，隨暴露時間增加呈下降趨勢。Cr6+濃度越高，紅樹蜆卵巢CAT活性恢復(fù)越難，兩者呈負相關(guān)。

同一分圖中，直方柱上方英文小寫字母不同表示同一暴露時間不同處理間某種酶活性差異顯著(P<0.05)。

如圖2所示，試驗過程中，對照處理紅樹蜆卵巢GST活性變化不顯著，表明沒有Cr6+干擾條件下，紅樹蜆性腺GST活性相對穩(wěn)定。各脅迫組GST活性均隨暴露時間的增加呈先上升后下降趨勢。在試驗前期(5 d時)，除0.25 mg·L-1處理外，其他處理GST活性均比對照顯著升高(P<0.05)，其中8 mg·L-1處理GST活性為對照的2.2倍。與對照相比，除8 mg·L-1處理外，其他處理GST活性在試驗中期(10 d時)均顯著受到誘導(dǎo)(P<0.05)。8 mg·L-1處理GST活性在試驗前期(5 d時)上升最明顯，但隨后迅速降低，15 d時顯著小于對照(P<0.05)。

2.2.2卵巢過氧化氫酶基因cat和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因gst表達量變化

紅樹蜆卵巢cat和gst基因表達水平見圖3。如圖3所示，紅樹蜆卵巢cat基因表達量受到顯著誘導(dǎo)出現(xiàn)在試驗前、中期(5和10 d時)。與高濃度處理相比，低濃度處理更容易促進紅樹蜆性腺cat基因的表達，在5 d時上調(diào)幅度顯著(P<0.05)，為對照的5.9倍，隨后cat基因表達量逐漸降低，15 d時恢復(fù)至正常水平(P>0.05)。在試驗前、中期(5和10 d時)，高濃度處理會顯著抑制cat基因的表達(P<0.05)，15 d時高濃度處理cat表達量僅為對照的30%。

如圖3所示，3個處理紅樹蜆卵巢gst基因表達量都呈先升高后降低趨勢。5 d時，與同時期對照相比，8 mg·L-1處理gst表達量顯著上升7.6倍(P<0.05)，隨后急劇降低。0.25 mg·L-1處理gst基因表達量變化趨勢則較為平緩，其最大值僅為對照的3.2倍。

同一分圖中，直方柱上方英文小寫字母不同表示同一暴露時間不同處理間某種基因相對表達量差異顯著(P<0.05)。

2.2.3卵巢MDA含量變化

不同濃度Cr6+脅迫后，紅樹蜆性腺MDA含量隨時間變化見圖4。

直方柱上方英文小寫字母不同表示同一處理不同暴露時間之間MDA含量差異顯著(P<0.05)。

如圖4所示，對照處理紅樹蜆性腺MDA含量相對穩(wěn)定。除0.25 mg·L-1處理外，其他處理MDA含量在前期(5 d時)均受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)，其中4和8 mg·L-1處理誘導(dǎo)程度更為強烈，與對照相比，其MDA含量增加1.7～3.1倍。隨著暴露時間增加，0.25 mg·L-1處理MDA含量逐漸恢復(fù)至對照水平，而1、4和8 mg·L-1處理紅樹蜆性腺MDA含量恢復(fù)能力則與Cr6+脅迫濃度呈負相關(guān)。

2.3 卵巢雌激素受體er基因和卵黃蛋白原vtg基因表達量變化

紅樹蜆卵巢er和vtg基因表達水平見圖5。在試驗期間，各處理紅樹蜆er和vtg基因表達量總體呈先升高后降低趨勢。對照er和vtg基因表達量在試驗前期(5 d時)均出現(xiàn)明顯上調(diào)，分別為0 d時的3.5和2.8倍，這表明紅樹蜆正處于成熟期后期。不同濃度Cr6+脅迫處理均顯著抑制2個基因的表達(P<0.05)，0.25 mg·L-1處理er和vtg基因表達量峰值分別為0 d時的3.2和1.9倍；而8 mg·L-1處理er和vtg基因表達量峰值則僅為0 d時的1.2倍和90%。在試驗中、后期(10、15 d時)，8 mg·L-1處理2個基因表達量均顯著低于對照(P<0.05)，這說明Cr6+濃度越高，其對er和vtg基因表達的抑制作用越明顯。

同一分圖中，直方柱上方英文小寫字母不同表示同一暴露時間不同處理間某種基因相對表達量差異顯著(P<0.05)。

3 討論

近年來我國海洋環(huán)境污染日益嚴(yán)重，尤以重金屬污染問題較為突出，而海洋貝類屬于濾食性生物，其生活習(xí)性和生理特點決定貝類易于累積重金屬[16]。部分海域一些貝類Cd和As污染的健康風(fēng)險超出可接受水平[17]；廈門養(yǎng)殖貝類中，只有牡蠣沒有受到污染，縊蟶、毛蚶、文蛤和花蛤均受到輕度Pb、Hg和Cu污染以及嚴(yán)重As污染，花蛤和文蛤還受到輕度Cr污染[18]。

性腺指數(shù)GSI又稱生殖腺指數(shù)，是反映性成熟度的一個指標(biāo)，常用來表示卵巢發(fā)育或睪丸發(fā)育來衡量動物的性成熟程度[19]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，Cr6+暴露會對紅樹蜆性腺發(fā)育和功能產(chǎn)生一定干擾，不同濃度Cr6+脅迫對紅樹蜆性腺指數(shù)產(chǎn)生影響的程度不同，其中，較高和高濃度(4和8 mg·L-1)Cr6+脅迫對紅樹蜆GSI造成的影響更為顯著(P<0.05)。各處理GSI均隨試驗時間的增加而逐漸降低，這表明Cr6+在性腺中的累積可能影響紅樹蜆卵巢發(fā)育，并損傷其正常組織。

CAT和GST活性以及MDA含量是研究生物對各種脅迫影響效應(yīng)中受到密切關(guān)注的生理指標(biāo)[20]。抗氧化酶CAT可以清除氧自由基保護機體，能間接反映生物體內(nèi)自由基含量變化，GST具有解毒和抑制脂質(zhì)過氧化作用[21]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，0.25和1 mg·L-1處理紅樹蜆性腺CAT活性在Cr6+暴露前期(5 d時)達到最大值，且較0 d時顯著上升(P<0.05)，而4和8 mg·L-1處理對CAT活性的誘導(dǎo)作用有限，甚至隨著試驗時間的增長而產(chǎn)生抑制作用。隨著暴露時間的增長，低濃度Cr6+處理酶活性比高濃度處理更快恢復(fù)到對照水平。Cr6+脅迫濃度越高，紅樹蜆卵巢CAT活性恢復(fù)就越困難，Cr6+脅迫濃度與CAT活性恢復(fù)力呈負相關(guān)。在試驗前、中期(5和10 d時)，0.25 mg·L-1處理卵巢cat基因表達水平比對照顯著提高(P<0.05)，隨后恢復(fù)至對照水平，但Cr6+脅迫濃度越高，其表達水平就越難恢復(fù)。紅樹蜆卵巢GST活性變化較CAT有一定滯后性，0.25 mg·L-1處理GST活性在試驗前期(5 d時)無明顯變化，而除8 mg·L-1處理外，其他處理GST活性在試驗中期皆受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)，且最大值出現(xiàn)在4 mg·L-1處理的試驗中期(10 d時)。當(dāng)紅樹蜆卵巢GST活性較低時，CAT會表現(xiàn)出一定活性，以維持產(chǎn)生氧自由基與保護抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡，此與賴廷和等[8]研究結(jié)果相似。有研究[22]認(rèn)為超氧化物歧化酶(SOD)催化O2-的歧化反應(yīng)不是CAT底物H2O2的唯一來源，H2O2也可能來自氨基酸或細胞色素P450氧化酶的激活，這可能是初期CAT活性較高的原因。在筆者試驗后期，8 mg·L-1處理CAT和GST活性受到顯著抑制(P<0.05)，而同時卵巢cat和gst基因表達水平與對照相比顯著降低(P<0.05)，這可能是由于高濃度Cr6+暴露下，紅樹蜆卵巢內(nèi)產(chǎn)生過多H2O2，超出了機體清除能力，從而抑制了相關(guān)基因的表達，這表明性腺組織已受到Cr6+的嚴(yán)重破壞。

MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，對細胞膜有很強的破壞作用，其含量可反映機體內(nèi)自由基產(chǎn)生量及對機體的影響程度。BEBIANNO等[23]提出高MDA含量是抗氧化防御機能喪失的結(jié)果。生物體在Cr6+脅迫后會導(dǎo)致組織MDA含量增加，進而造成肝臟和腎臟硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)水平升高，損傷肝、腎功能[24]。筆者試驗發(fā)現(xiàn)，與其他處理不同，8 mg·L-1處理紅樹蜆卵巢gst基因表達量最大值出現(xiàn)在試驗前期(5 d時)，且此時GST活性也顯著高于對照(P<0.05)，這表明機體可能通過加強gst基因表達產(chǎn)生更多GST，以便清除迅速積累的自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，此與ZHANG等[25]的研究結(jié)果相似。MDA含量峰值出現(xiàn)在8 mg·L-1處理15 d時，并且在整個試驗過程中，高濃度Cr6+處理MDA含量顯著高于低濃度處理，這表明過高濃度的Cr6+已破壞生物體抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致機體活性氧迅速累積，從而加劇膜脂過氧化作用。另外，受到Cr6+脅迫后，紅樹蜆卵巢MDA含量無法恢復(fù)至最初水平，說明Cr6+對紅樹蜆MDA含量產(chǎn)生不可逆影響。

卵黃蛋白原(VTG)常被用作檢測內(nèi)分泌干擾物的生物標(biāo)志物[26]。OSADA等[12]研究發(fā)現(xiàn)雙殼貝類VTG在卵巢中合成并且在er和vtg基因的介導(dǎo)下由雌二醇(E2)調(diào)控，因此er和vtg基因表達量在生物體生殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用。筆者試驗發(fā)現(xiàn)，對照er和vtg基因表達量在試驗初期(5 d時)均出現(xiàn)明顯上調(diào)，分別為0 d時的3.5和2.8倍，這表明紅樹蜆正處于成熟期后期，er基因表達量變化與性腺發(fā)育相吻合，這與MATSUMOTO等[27]對牡蠣和扇貝卵巢的研究結(jié)果相似。在整個試驗中，8 mg·L-1處理vtg和er基因表達量顯著低于0.25 mg·L-1和對照處理。這可能是由于高濃度Cr6+進入紅樹蜆體內(nèi)后，能夠通過影響性腺激素含量進而影響激素調(diào)控的er和vtg等相關(guān)基因的表達，而er基因含量的變化又會導(dǎo)致依賴er基因介導(dǎo)的一系列基因的表達發(fā)生變化，最終對紅樹蜆產(chǎn)生明顯生殖毒性效應(yīng)。

4 結(jié)論

以紅樹蜆為試驗對象，研究了不同濃度Cr6+暴露下紅樹蜆卵巢中氧化逆境標(biāo)志物及生殖基因表達的變化。研究結(jié)果表明，Cr6+對紅樹蜆卵巢具有組織損傷和代謝干擾效應(yīng)，并且高濃度Cr6+能對紅樹蜆造成明顯生殖毒害作用。紅樹蜆由于其分布地域的特殊性，目前對該物種的研究與其他雙殼貝類相比還較少，該研究可為進一步研究Cr6+對紅樹蜆生殖毒性機制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。下一步將開展Cr6+暴露對雄性紅樹蜆性腺的影響研究。