洪 鑫，韓 成，孔 帆，周豐武，吳少松，鐘文輝①，劉 標(biāo)

(1.南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院江蘇省物質(zhì)循環(huán)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所國(guó)家環(huán)境保護(hù)生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042)

復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物包含多個(gè)外源基因的轉(zhuǎn)入，外源基因間或其與植物原有基因間可能存在關(guān)聯(lián)、非關(guān)聯(lián)和代謝等作用，改變蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，對(duì)生物產(chǎn)生不利影響或?qū)е缕渌穷A(yù)期反應(yīng)，加大復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)[1]。姜偉麗等[2]研究發(fā)現(xiàn)抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因棉花田中刺吸式害蟲數(shù)量顯著低于Bt棉田害蟲數(shù)量。在轉(zhuǎn)基因作物生長(zhǎng)過(guò)程中，外源基因表達(dá)產(chǎn)物主要通過(guò)植株殘?bào)w(含花粉)和根系分泌物進(jìn)入土壤[3]。植物根系生長(zhǎng)伴隨整個(gè)作物季，外源基因表達(dá)產(chǎn)物將會(huì)直接與根際土壤環(huán)境接觸，吸附或結(jié)合在黏土顆粒、腐殖質(zhì)組分或有機(jī)礦物復(fù)合物表面并在土壤中積累，從而影響土壤微生物群落變化[4]。江帆等[5]研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米雄穗的CP4 EPSPS蛋白表達(dá)量比耐除草劑玉米顯著高31.6%，而抗蟲玉米葉片中Cry1Ac蛋白表達(dá)量比抗蟲耐除草劑玉米顯著高129%，在噴施多倍草甘膦的條件下，抗蟲耐除草劑玉米與耐除草劑玉米株高無(wú)顯著差異，但是均顯著高于抗蟲玉米?？梢姡D(zhuǎn)基因作物種植可能會(huì)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。另外，多種外源基因轉(zhuǎn)入可改變作物代謝途徑，其根系分泌物組成及含量也會(huì)發(fā)生變化，并影響根際微生物群落。據(jù)報(bào)道，轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因棉花比親本棉花能分泌更多的賴氨酸和甲硫氨酸，而轉(zhuǎn)Bt基因棉花與其親本相比，根系分泌物組成相同，但是酪氨酸、亮氨酸等含量有顯著差異[6]。目前，大部分研究者主要集中關(guān)注單一性狀轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤根際微生物的影響[7]，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物如何影響根際土壤微生物群落的報(bào)道鮮見。

土壤酶活性與土壤微生物活性密切相關(guān)，在催化有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮重要作用，常常被用作衡量微生物活性和土壤肥力的指標(biāo)[8]。熒光素二乙酸酯(FDA)水解酶是土壤中能催化水解FDA的一類非專一性酶，包括蛋白酶、酯酶和脂肪酶等，其與土壤微生物活性、土壤各養(yǎng)分指標(biāo)均顯著相關(guān)，能夠很好地反映土壤微生物活性和有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]，因而被廣泛應(yīng)用于土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)。以往報(bào)道常采用平板培養(yǎng)[10]、變性梯度凝膠電泳[11]等技術(shù)研究轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物的影響；而平板培養(yǎng)技術(shù)僅能研究土壤微生物中的極少部分，變性梯度凝膠電泳技術(shù)也有檢出限低的缺點(diǎn)，不能全面評(píng)價(jià)微生物群落。近年來(lái)，定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)具有實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，高通量測(cè)序技術(shù)能全面解析復(fù)雜土壤樣品中微生物群落，在土壤微生物學(xué)和生物安全研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[12]。

該研究基于溫室微區(qū)實(shí)驗(yàn)，采集抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米“雙抗12-6”及其非轉(zhuǎn)基因親本玉米“鄭單958”拔節(jié)期和成熟期根際土壤，測(cè)定土壤FDA水解酶活性以表征土壤微生物活性，采用定量PCR、Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)分析根際土壤細(xì)菌和真菌群落豐度、組成和多樣性，研究抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落的影響。上述研究結(jié)果可為抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 玉米微區(qū)種植及根際土壤采集

選用轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和G10evo-spsps基因抗蟲耐除草劑玉米“雙抗12-6”(GM)及非轉(zhuǎn)基因玉米品種“鄭單958”(CK)，種植于南京師范大學(xué)仙林校區(qū)溫室微區(qū)內(nèi)，微區(qū)由1 m×1 m×0.5 m混凝土筑成，處理間留有0.5 m隔離帶，各重復(fù)之間設(shè)置0.1 m厚隔層，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，每個(gè)微區(qū)種植4株玉米，微區(qū)內(nèi)隨機(jī)填充旱地土壤。供試土壤填充前采用風(fēng)干、粉碎、機(jī)械研磨和機(jī)械混勻等方式確保土壤均勻，并采用四分法采集4份土壤測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)，保存于-20 ℃條件下。供試土壤預(yù)處理前所測(cè)理化性質(zhì)、微生物活性及數(shù)量的變異系數(shù)范圍為0.3%～4.8%，土壤均一性較好。玉米種植期為2018年5月至8月，以玉米幼苗破土記為0 d，共生長(zhǎng)105 d。溫室內(nèi)設(shè)置降溫系統(tǒng)，控制室溫為18～35 ℃。玉米種植前每個(gè)微區(qū)施基肥(包括發(fā)酵后雞糞1 kg，復(fù)合肥60 g)并混勻，生長(zhǎng)期根據(jù)每周玉米長(zhǎng)勢(shì)施肥(共施復(fù)合肥240 g、尿素390 g)，平均每2 d澆水1次。于玉米幼苗破土10 d后，使用試劑盒(QuickStixTMKIT forCry1AbCorn Leaf & Seed， EnviroLogix，USA)法檢測(cè)玉米苗外源蛋白表達(dá)狀況，確保供試轉(zhuǎn)基因玉米具有外源蛋白表達(dá)且非轉(zhuǎn)基因玉米無(wú)外源蛋白表達(dá)。

于玉米生長(zhǎng)60 d時(shí)拔節(jié)期(營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)代表時(shí)期，S1)、105 d時(shí)成熟期(生殖生長(zhǎng)代表時(shí)期，S2)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米植株進(jìn)行破壞性采樣，收集根際土壤[13]。土壤樣品及時(shí)分離過(guò)篩，一部分土壤存于4 ℃條件下，用于土壤理化性質(zhì)和微生物活性指標(biāo)測(cè)定；一部分土壤于-80 ℃條件下保存，用于微生物群落測(cè)定。

1.2 土壤理化性質(zhì)和FDA水解酶測(cè)定

土壤pH按w(土)∶V(水)=1∶2.5搖勻靜置后測(cè)定；土壤有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法測(cè)定；土壤速效鉀含量采用乙酸銨-原子吸收法測(cè)定；土壤全氮含量采用開氏消煮法[12]測(cè)定；土壤有機(jī)碳和可溶性有機(jī)碳含量采用TOC自動(dòng)分析儀(Shimadzu TOC-L，Japan)[14]測(cè)定。FDA水解酶采用熒光素比色法[15]測(cè)定。

1.3 土壤總DNA提取及微生物豐度測(cè)定

每個(gè)土壤樣品稱取0.5 g鮮土，采用試劑盒(FastDNA?Spin Kit for Soil，MP，Biomedicals， USA)法提取土壤總DNA。采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo，USA)測(cè)定DNA溶液的純度和濃度，DNA溶液于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定土壤細(xì)菌16S rRNA基因和真菌ITS基因豐度分別表征細(xì)菌和真菌群落豐度。細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增采用引物對(duì)515F(5′-GTGNCAGCMGCCGCGGTAA-3′)/926R(5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′)[16]，反應(yīng)體系體積為20.0 μL，包含10.0 μL 2 × SYBR Premix Ex Taq、0.3 μL上下游引物、1.0 μL稀釋10倍后DNA樣品和8.4 μL滅菌超純水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性，3 min；40個(gè)循環(huán)(95 ℃變性10 s,56 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s)，每輪循環(huán)結(jié)束后采集熒光數(shù)據(jù)，并采用溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；采用含有16S rRNA基因的濃度為6.53×102～6.53×108copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率為85.3%(R2為0.994)。真菌ITS基因擴(kuò)增采用引物對(duì)ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)/ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)[17]，反應(yīng)體系體積為20.0 μL，包含10.0 μL 2 × SYBR Premix Ex Taq、0.3 μL上下游引物、1.0 μL稀釋10倍后DNA樣品和8.4 μL滅菌超純水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性，5 min；40個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光數(shù)據(jù)，并采用溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；采用含有ITS基因的濃度為1.83×102～1.83×108copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率為101.5%(R2為0.994)。每個(gè)樣品共3個(gè)技術(shù)重復(fù)并設(shè)置陰性對(duì)照。

1.4 高通量測(cè)序分析

采用515F/926R和ITS1F/ITS2R分別對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V4 + V5區(qū)和真菌ITS基因ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并委托廣東美格基因科技有限公司完成高通量測(cè)序。測(cè)序采用Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序Paire-end方法，從每條序列的5′和3′端產(chǎn)生250 bp的reads，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理獲得有效數(shù)據(jù)；將PE reads拼接成Tags，再次過(guò)濾獲得目標(biāo)片段，通過(guò)QIIME[18]平臺(tái)在97%相似水平上對(duì)OTU進(jìn)行分類，并基于Silva[19]和UNITE[20]數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)16S rRNA基因和ITS基因進(jìn)行OTU分類注釋。

細(xì)菌樣品共獲得411 226條有效序列數(shù)，CK處理S1和S2時(shí)期各獲得22 695～28 405和23 266～36 758條有效序列數(shù)，GM處理S1和S2時(shí)期分別獲得16 007～25 165和21 634～29 628條有效序列數(shù)。真菌樣品共獲得1 519 764條有效序列數(shù)，CK處理S1和S2時(shí)期分別獲得75 391～105 131和94 265～133 401條有效序列數(shù)，GM處理S1和S2時(shí)期分別獲得70 194～90 973和86 665～104 663條有效序列數(shù)。選取細(xì)菌和真菌群落的門、屬數(shù)量以及Chao1、Shannon指數(shù)分別表征細(xì)菌和真菌群落的α多樣性；采用Bray-Curtis距離和多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)比較不同樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異；選取門、屬水平上相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌和真菌群落分析其群落組成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件(IBM，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差(Tukey檢驗(yàn)，P<0.05，n=4)分析比較不同樣品間土壤理化性質(zhì)、微生物活性、豐度和多樣性的差異；采用雙因素方差(Tukey檢驗(yàn))分析比較玉米品種或生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)土壤理化性質(zhì)、微生物群落活性、多樣性和門水平上群落組成差異的影響力大小。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析比較玉米品種或生長(zhǎng)時(shí)期屬水平上微生物群落組成的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)根際土壤理化性質(zhì)、微生物活性及數(shù)量的影響

根際土壤pH約為7.2，呈中性。單因素方差分析顯示，GM處理S2時(shí)期根際土壤DOC含量比GM處理S1時(shí)期顯著高40.1%(P<0.05)，S1時(shí)期GM和CK處理土壤C/N比值比S2時(shí)期2個(gè)處理顯著提高17.2%和19.3%(P<0.05)，與CK處理相比，GM處理均未顯著影響土壤C/N比值和DOC含量；4個(gè)處理間根際土壤pH，TOC、TN、AP和AK含量均無(wú)顯著差異。雙因素方差分析顯示，玉米品種未顯著影響土壤理化性質(zhì)，但生長(zhǎng)時(shí)期顯著影響根際土壤DOC(P< 0.01)、TN含量(P<0.01)和C/N比值(P<0.001)；根際土壤AP含量(P<0.05)顯著受到玉米品種和生長(zhǎng)時(shí)期的交叉影響。根際土壤FDA水解酶活性為5.24～6.81 μg·g-1·h-1，細(xì)菌16S rRNA基因豐度為6.26×1010～7.65×1010copies·g-1，真菌ITS基因豐度為2.72×108～5.20×108copies·g-1。單因素方差分析顯示，根際土壤FDA水解酶活性、細(xì)菌16S rRNA基因和真菌ITS基因豐度在各處理間均無(wú)顯著差異。雙因素方差分析顯示，細(xì)菌16S rRNA基因豐度顯著受生長(zhǎng)時(shí)期影響(P<0.05)，F(xiàn)DA水解酶活性和真菌ITS基因豐度未顯著受到玉米品種或生長(zhǎng)時(shí)期的影響(表1)。

表1 玉米根際土壤理化性質(zhì)、微生物活性和數(shù)量

Table 1 Maize rhizospheric soil physicochemical properties, microbial activity and community abundance

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=4)。同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示2個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期不同處理間某指標(biāo)顯著差異，ND表示未測(cè)定，分析方法為單因素方差分析(Tukey檢驗(yàn))，P<0.05，n=4。采用雙因素方差分析(Tukey檢驗(yàn))對(duì)不同品種處理和不同時(shí)期之間做比較分析，其中，F(xiàn)為膨脹系數(shù)，表示影響力大小。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。A為豐度，B為細(xì)菌16S rRNA基因，C為真菌ITS基因，D為FDA水解酶活性。

2.2 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)根際土壤細(xì)菌及真菌群落α多樣性的影響

細(xì)菌群落在門和屬水平上分類的有效數(shù)量分別為27～29和251～264。單因素方差分析顯示，CK處理S1時(shí)期細(xì)菌群落門、屬水平上的數(shù)量均顯著高于GM處理S2時(shí)期(P<0.05)；GM處理S1時(shí)期Shannon指數(shù)顯著高于CK處理S2時(shí)期(P<0.05)；細(xì)菌群落Chao1指數(shù)在各處理間無(wú)顯著差異。雙因素方差分析顯示，細(xì)菌群落門(P<0.01)和屬(P<0.05)水平上的數(shù)量、Chao1指數(shù)(P<0.05)、Shannon指數(shù)(P<0.01)均顯著受生長(zhǎng)時(shí)期的獨(dú)立影響。真菌群落在門和屬水平上分類的有效數(shù)量分別為6～7和156～179。單因素方差分析顯示，真菌群落門和屬水平上的數(shù)量、Chao1指數(shù)以及Shannon指數(shù)在各處理間均無(wú)顯著差異。雙因素方差分析顯示，真菌群落門和屬水平上的數(shù)量、Chao1指數(shù)以及Shannon指數(shù)均未顯著受玉米品種或生長(zhǎng)時(shí)期的影響(表2)。

2.3 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落β多樣性的影響

細(xì)菌群落PCoA分析見圖1(a)。第1和2主坐標(biāo)解釋度分別為55.27%和13.59%，樣品在第1、2主坐標(biāo)排序中聚成2組，GM處理S1時(shí)期和CK處理S1時(shí)期聚成1組，GM處理S2時(shí)期和CK處理S2時(shí)期聚成1組，2組的Bray-Curtis相似度指數(shù)分別為0.178和0.180(P>0.05)，說(shuō)明GM處理S1時(shí)期和CK處理S1時(shí)期之間、GM處理S2時(shí)期和CK處理S2時(shí)期之間群落結(jié)構(gòu)相似。GM處理S1和S2時(shí)期、CK處理S1和S2時(shí)期的Bray-Curtis相似度指數(shù)分別為0.420和0.556(P< 0.05)，說(shuō)明GM處理S1和S2時(shí)期之間、CK處理S1和S2時(shí)期之間的群落結(jié)構(gòu)差異顯著。真菌群落PCoA分析見圖1(b)。第1、2主坐標(biāo)解釋度分別為60.70%和12.02%，樣品在第1、2主坐標(biāo)排序中均沒(méi)有聚類，S1時(shí)期GM和CK處理、S2時(shí)期GM和CK處理、CK處理S1和S2時(shí)期以及GM處理S1和S2時(shí)期的Bray-Curtis相似度指數(shù)分別為0.277、0.081、0.126和0.213(P>0.05)，說(shuō)明各處理真菌群落結(jié)構(gòu)相似。

表2 玉米根際土壤細(xì)菌和真菌群落α多樣性

Table 2 Community diversity of bacteria and fungi in maize rhizosphere soils

處理細(xì)菌16S rRNA基因真菌ITS基因PGChao1指數(shù)Shannon指數(shù)PGChao1指數(shù)Shannon指數(shù)GM_S129±0ab256±2ab1 567±34a7.56±0.18a6±0a179±5a936±26a5.03±0.63aCK_S128±0a264±3a1 572±26a7.43±0.21ab6±0a156±11a865±38a3.67±0.81aGM_S227±0b251±3b1 479±60a5.95±0.64ab6±0a158±8a902±41a3.65±0.76aCK_S227±0ab253±1ab1 431±50a5.73±0.43b7±0a170±9a863±37a4.39±0.54a品種0.2733.3660.2470.1780.4290.4022.2980.199時(shí)期11.000??8.087?6.588?16.232??0.4290.1200.2640.229品種×?xí)r期0.0911.0180.3570.0103.8574.0720.1912.292

數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=4)。同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示2個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期不同處理間某指標(biāo)顯著差異，分析方法為單因素方差分析(Tukey檢驗(yàn))，P<0.05，n=4。采用雙因素方差分析(Tukey檢驗(yàn))對(duì)不同品種處理和不同時(shí)期之間做比較分析，其中，F(xiàn)為膨脹系數(shù)，表示影響力大小。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。P和G為門水平上和屬水平上分類的有效數(shù)量。

RAdonis為非參數(shù)多因素方差分析(nonparametric MANOVA)指數(shù)，基于Bray-Curtis距離計(jì)算得到；*表示2個(gè)處理間差異顯著。

2.4 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落組成的影響

共獲取12個(gè)門水平上相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌類群，有奇古菌門(Thaumarchaeota)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和酸桿菌門(Acidobacteria) 5個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落，占總細(xì)菌群落的80%以上〔圖2(a)〕。其中，奇古菌門相對(duì)豐度最高，占總細(xì)菌群落的13.9%～44.6%。其次是變形菌門，其相對(duì)豐度占總細(xì)菌群落的17.9%～31.0%。雙因素方差分析顯示，放線菌門顯著受玉米品種或生長(zhǎng)時(shí)期的獨(dú)立影響；奇古菌門、變形菌門、酸桿菌門等均顯著受生長(zhǎng)時(shí)期的獨(dú)立影響。共獲取3個(gè)門水平上相對(duì)豐度大于1%的真菌類群，其中，子囊菌門(Ascomycota)相對(duì)豐度占總真菌群落的38%～73%〔圖2(b)〕。雙因素方差分析顯示，子囊菌門、擔(dān)子菌門(Basidiomycota) 未顯著受玉米品種或生長(zhǎng)時(shí)期的獨(dú)立影響；接合菌門(Zygomycota)受玉米品種和生長(zhǎng)時(shí)期的交叉影響。

選取細(xì)菌屬水平上相對(duì)豐度大于1%且變化量絕對(duì)值總和位居前10位的物種進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析(表3)。表3顯示，S1時(shí)期GM處理Candidatus_Nitrososphaera相對(duì)豐度比CK處理顯著降低0.98%；S2時(shí)期GM處理Candidatus_Nitrososphaera相對(duì)豐度比CK處理顯著降低6.02%；其中，Marmoricola是放線菌門屬水平上相對(duì)豐度變化最大的物種，在S1和S2時(shí)期，GM處理Marmoricola相對(duì)豐度分別比CK處理高1.46%和1.03%。CK處理S2時(shí)期Candidatus_Nitrocosmicus、Candidatus_Nitrososphaera相對(duì)豐度分別比S1時(shí)期顯著升高20.76%和6.09%，而CK處理S2時(shí)期MND1、Sphingomonas、Flavisolibacter等相對(duì)豐度顯著低于S1時(shí)期。

*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

表3 屬水平上細(xì)菌和真菌相對(duì)豐度變化量

Table 3 Changes in relative abundance of bacterial and fungal taxa at the genus level

界屬名稱相對(duì)豐度變化量/%GM_S1-CK_S1GM_S2-CK_S2CK_S2-CK_S1GM_S2-GM_S1細(xì)菌Candidatus_Nitrocosmicus-2.320.2520.76?23.33?Candidatus_Nitrososphaera-0.98?-6.02?6.09?1.05?Marmoricola1.461.03-1.31?-1.74MND10.230.69-2.39?-1.93?Sphingomonas-0.200.71-2.27??-1.37Flavisolibacter-0.910.36-1.48??-0.21Nitrospira-0.810.03-1.40??-0.56Luteimonas0.160.50-0.83?-0.50Ramlibacter0.090.19-0.66???-0.56?Chryseolinea0.110.24-0.60??-0.47真菌Fusarium1.22?-2.212.78?-0.65Staphylotrichum0.91??-0.540.49-0.96??Lophiostoma-0.25-0.004??-0.25-0.01

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)各處理做比較分析，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。如GM_S1-CK_S1表示S1時(shí)期GM處理屬水平相對(duì)豐度減去CK處理屬水平相對(duì)豐度。

GM處理S2時(shí)期Candidatus_Nitrocosmicus、Candidatus_Nitrososphaera相對(duì)豐度分別比S1時(shí)期顯著升高23.33%和1.05%，而GM處理S2時(shí)期MND1、Ramlibacter相對(duì)豐度顯著低于S1時(shí)期。選取真菌屬水平上相對(duì)豐度大于1%的物種進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析(表3)。S1時(shí)期GM處理Fusarium、Staphylotrichum相對(duì)豐度顯著高于CK處理。S2時(shí)期GM處理Lophiostoma相對(duì)豐度顯著低于CK處理。CK處理S2時(shí)期Fusarium相對(duì)豐度顯著高于S1時(shí)期。GM處理S2時(shí)期Staphylotrichum相對(duì)豐度顯著低于S1時(shí)期。

3 討論

3.1 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)根際土壤微生物活性的影響

FDA水解酶能夠很好地反映土壤微生物活性和土壤質(zhì)量變化，是土壤生物學(xué)重要指標(biāo)之一[21]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米未顯著改變根際土壤理化性質(zhì)和FDA水解酶活性，成熟期根際土壤可溶性有機(jī)碳和全氮含量顯著高于拔節(jié)期根際土壤(表1)。孫彩霞等[22]通過(guò)短期種植轉(zhuǎn)Bt基因水稻和棉花，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因性狀均未顯著影響土壤全碳、全氮和速效磷等理化性質(zhì)，筆者研究結(jié)果與之相似。景小鵬等[23]研究發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因玉米相比，轉(zhuǎn)Bt基因玉米未顯著影響根際土壤全氮含量，但是在特定時(shí)期會(huì)顯著影響根際土壤有機(jī)質(zhì)、全磷等其他理化性質(zhì)。SUN等[4]研究指出轉(zhuǎn)Bt基因棉花組織可能會(huì)刺激土壤微生物活性，從而使土壤脲酶、轉(zhuǎn)化酶、纖維素酶活性普遍提高。SHEN等[24]研究表明轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因棉花的根際土壤脲酶和蛋白酶活性等沒(méi)有顯著差異，筆者研究結(jié)果與之有相似之處。筆者研究認(rèn)為在玉米種植過(guò)程中追施尿素和復(fù)合肥，可能是導(dǎo)致玉米成熟期根際土壤可溶性有機(jī)碳和全氮含量顯著高于拔節(jié)期的主要原因。

3.2 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)根際土壤細(xì)菌群落的影響

細(xì)菌最多可占土壤微生物總量的90%，是土壤微生物組成中最大的類群，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的作用至關(guān)重要[25]。根際土壤細(xì)菌群落非常敏感，可能受作物種類、植株生長(zhǎng)時(shí)期和耕種管理方式等生物和非生物因素的影響[26]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米未顯著影響根際土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性，而生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)細(xì)菌群落豐度和多樣性有顯著影響(表1)。劉凱等[27]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米未顯著影響根際土壤細(xì)菌、氨化細(xì)菌和好氧性固氮菌數(shù)量。BARRIUSO等[28]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米與親本玉米根際細(xì)菌豐度和豐富度均無(wú)顯著差異，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較小，而植物生長(zhǎng)時(shí)期或環(huán)境因素可能對(duì)微生物群落產(chǎn)生更顯著的影響。GRIFFITHS等[29]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米對(duì)土壤微生物有一定影響，但是受土壤類型和植株生長(zhǎng)時(shí)期的影響更大，這可能是因?yàn)椴煌衩字晗甸g自然變異所致，筆者研究結(jié)果與之相似。

筆者研究發(fā)現(xiàn)奇古菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門是細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)種群，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)土壤細(xì)菌放線菌門有顯著影響(圖2)。放線菌廣泛存在于土壤中，對(duì)土壤有機(jī)物礦化有著重要作用[30]。筆者研究中GM處理土壤樣品總有機(jī)碳(TOC)含量在2個(gè)時(shí)期均高于CK處理，其中在S1時(shí)期達(dá)到顯著水平(t檢驗(yàn)，P<0.05)，環(huán)境因子的微小變化可能對(duì)土壤微生物有顯著影響，這可能是GM處理放線菌門相對(duì)豐度顯著高于CK處理的原因(圖2)。對(duì)細(xì)菌同時(shí)期不同處理屬水平上物種進(jìn)行分析，GM處理Candidatus_Nitrososphaera相對(duì)豐度在2個(gè)時(shí)期分別比CK處理顯著低0.98%和6.02%，GM處理Marmoricola相對(duì)豐度在2個(gè)時(shí)期分別比CK處理高1.46%和1.03%(表3)，這可能是造成放線菌門產(chǎn)生品種差異的主要物種。土壤可溶性有機(jī)碳(DOC)可直接被土壤微生物利用，筆者研究中S2時(shí)期根際土壤DOC含量顯著高于S1時(shí)期，這可能是S2時(shí)期2個(gè)處理放線菌門相對(duì)豐度顯著高于S1時(shí)期的主要原因。BARRIUSO等[28]連續(xù)4 a種植轉(zhuǎn)Bt基因玉米，發(fā)現(xiàn)根際土壤細(xì)菌中優(yōu)勢(shì)種群主要是變形菌門、酸桿菌門和放線菌門，筆者研究與之有所不同。奇古菌門主要組成部分是氨氧化古菌，與土壤硝化作用密切相關(guān)[31]。筆者研究中各處理奇古菌門相對(duì)豐度較高，可能是由于在玉米生長(zhǎng)過(guò)程中多次施肥導(dǎo)致，S2時(shí)期根際土壤全氮含量顯著高于S1時(shí)期(P<0.01)，這可能是S2時(shí)期2個(gè)處理奇古菌門相對(duì)豐度顯著高于S1時(shí)期的主要原因。對(duì)細(xì)菌同一處理不同時(shí)期屬水平上差異物種變化進(jìn)行分析，S2時(shí)期Candidatus_Nitrocosmicus和Candidatus_Nitrososphaera相對(duì)豐度分別比S1時(shí)期顯著增加20.76%～23.33%和1.05%～6.09%(表3)，S2時(shí)期根際土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)(P<0.05)和Shannon指數(shù)(P<0.01)均顯著低于S1時(shí)期，說(shuō)明大量施加氮肥會(huì)增加物種豐度，降低物種多樣性，筆者研究結(jié)果與之相符。

3.3 抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)根際土壤真菌群落的影響

真菌是土壤微生物區(qū)系的重要組成部分，具有較高的生物活性[32]。根際真菌群落的組成和功能具有很強(qiáng)的動(dòng)態(tài)性，受植物生長(zhǎng)階段、土壤類型、年際和品種類型的影響較小[33]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米未顯著影響根際土壤真菌群落豐度、多樣性和門水平上群落組成。LEE等[34]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻根際真菌群落豐度和多樣性與親本水稻間無(wú)顯著差異，筆者研究結(jié)果與之相似。王敏等[35]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米未顯著影響根際土壤真菌數(shù)量，Bt玉米對(duì)根際細(xì)菌群落的影響大于真菌群落，筆者研究結(jié)果與之相似。LI等[36]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因棉花未顯著影響根際土壤真菌群落豐度和多樣性，真菌群落多樣性顯著受生長(zhǎng)時(shí)期的影響，根系微環(huán)境會(huì)顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)。目前大多數(shù)關(guān)于土壤真菌群落的研究表明，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤真菌的影響與其親本相似。通過(guò)對(duì)真菌屬水平上差異物種變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，僅Fusarium、Staphylotrichum和Lophiostoma屬有顯著差異。相較于細(xì)菌，各處理真菌屬水平物種變化量較小，此與前人研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

近年來(lái)，由于轉(zhuǎn)基因作物在世界范圍內(nèi)的釋放以及對(duì)傳統(tǒng)作物的替代，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境和人類健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)一直備受關(guān)注，許多風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估都集中于轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物的影響。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米未顯著影響根際土壤真菌群落，對(duì)細(xì)菌群落有一定程度的影響，但是受植株生長(zhǎng)時(shí)期的影響更顯著。目前，轉(zhuǎn)基因作物使用的基因種類繁多，尚無(wú)通用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，研究轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響還需要長(zhǎng)期連續(xù)監(jiān)測(cè)，確定外源基因?qū)胨鶐?lái)的影響，為轉(zhuǎn)基因作物推廣提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。