,*,4,*

(1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院,上海 200120;2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院,上海 201203;3.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200234;4.上海交通大學(xué)藥學(xué)院,上海 200240)

伊立替康(irinotecan,CPT-11)是一種衍生自喜樹(shù)堿的化合物,廣泛應(yīng)用于各類腫瘤疾病治療,如非小細(xì)胞肺癌、胃癌和直腸癌等[1]。CPT-11進(jìn)入體內(nèi)后能迅速在胃腸道和肝臟組織中水解為活性化合物SN-38,SN-38在肝葡萄糖醛酸化過(guò)程中代謝為無(wú)活性代謝物SN-38葡糖苷酸(SN-38G),隨后被輸出到腸道[2]。但是,SN-38G可被腸道細(xì)菌β-D-葡糖醛酸糖苷酶水解為SN-38,從而導(dǎo)致腸毒性[3]。研究表明[4],CPT-11還會(huì)造成脊髓抑制毒性、中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)。

雙歧桿菌是活的腸道微生物,作為藥物或食品補(bǔ)充劑有助于維持人類或其他宿主消化道的微量平衡,并且可以通過(guò)自身轉(zhuǎn)化吸收微量元素,改變生理生化功能[5]。研究表明[6],益生菌制劑具有低毒性、良好的耐受性等優(yōu)點(diǎn),可通過(guò)降低腸道β-D-葡糖醛酸糖苷酶的活性,緩解伊立替康治療引起的腹瀉。微量元素硒(selenium,Se)是人體必需元素,與蛋白質(zhì)組成硒蛋白維持生理功能,與25-30種遺傳特異性酶組成硒酶維持催化功能,在生物化學(xué)和生理學(xué)上具有重要作用[7]。研究表明[8-9],有機(jī)硒具有顯著的低毒性和可接受的生物利用度,可作為化療預(yù)防劑,以防止抗癌藥物伊立替康的毒性,并協(xié)同增強(qiáng)體外和體內(nèi)的抗腫瘤治療效果。據(jù)此,本實(shí)驗(yàn)室在高硒培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)雙歧桿菌,通過(guò)特定條件使培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)硒吸收轉(zhuǎn)化為自身硒蛋白,制備具備硒功能和雙歧桿菌功能的富硒益生菌(Selenium-enrichedBifidobacteriumlongum,Se-DD98)。研究表明[10],雙歧桿菌經(jīng)富硒培養(yǎng)后,黏附能力顯著提升,且可能與細(xì)菌表面Tuf黏附蛋白的改變有關(guān)。

有研究表明[11-13],富硒益生菌可影響體內(nèi)硒蛋白基因表達(dá)、免疫功能、和谷胱甘肽過(guò)氧化酶的活性,并且與CPT-11聯(lián)用后可以增強(qiáng)抗腫瘤作用。富硒長(zhǎng)雙歧桿菌可降低CPT-11誘導(dǎo)的小鼠死亡率并預(yù)防小鼠小腸黏膜炎[14]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,Se-DD98能夠改善5-FU導(dǎo)致的化療性腸黏膜炎[15]。CPT-11的嚴(yán)重不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用,因此本研究旨在探討Se-DD98輔助用藥后對(duì)CPT-11所致不良反應(yīng)的緩解作用,包括對(duì)小鼠體重、腹瀉等級(jí)、免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響,為后期研究和開(kāi)發(fā)活性更優(yōu)的新型富硒益生菌產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

48只健康雄性SPF級(jí)ICR小鼠 6～8周齡,體質(zhì)量(20±2) g,由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2014-0018,普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,飼養(yǎng)溫度21-25 ℃,相對(duì)濕度40%～70%;長(zhǎng)雙歧桿菌DD98菌株(CGMCC 16573) 本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)高通量篩選得到耐硒長(zhǎng)雙歧桿菌優(yōu)勢(shì)菌株[16],經(jīng)16S rRNA測(cè)序及核苷酸序列BLAST分析,結(jié)果表明DD98菌株是一種新的長(zhǎng)雙歧桿菌;鹽酸伊立替康原料藥 齊魯制藥;二甲基亞砜 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;糞便基因DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司;亞硒酸鈉 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;BBL瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

ALC-210.3電子天平 賽多利斯有限公司;AG22331 Hamburg離心機(jī) 艾本德;Forma 900系列超低溫冰箱 賽默飛世爾;XH-C漩渦混合器 金壇市白塔新寶儀器廠;AJD14L010臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特;DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾;LGJ-22D冷凍干燥劑 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;BC-2800vet全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 Se-DD98的培養(yǎng):前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明[17],將長(zhǎng)雙歧桿菌DD98接種于BBL瓊脂培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)12 h后,向培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,在高硒環(huán)境下發(fā)酵可制備得到Se-DD98。Se-DD98冷凍干燥48 h后得到凍干菌粉,密封保存于4 ℃,實(shí)驗(yàn)前采用平板涂布法檢測(cè)樣品活菌數(shù)。參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),測(cè)定菌粉Se-DD98的硒含量為0.349 mg/g(硒重量/菌粉重量)。

給藥溶液的配制:高劑量菌液(菌液活菌數(shù)1×109CFU/kg)配制:平板涂布法測(cè)得菌粉活菌數(shù)為5.196×108CFU/g(菌粉重量),根據(jù)小鼠灌胃體積0.2 mL/10 g(小鼠體重),最終確定配制溶液濃度為0.096 g/mL,使用無(wú)菌蒸餾水溶解菌粉。低劑量菌液(菌液活菌數(shù)1×108CFU/kg)配制:使用梯度稀釋法,用無(wú)菌蒸餾水將高劑量菌液稀釋10倍,得到低劑量菌液。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為4組,每組12只,分別為正常對(duì)照組、CPT-11組、Se-DD98低劑量組、Se-DD98高劑量組。正常對(duì)照組和CPT-11組灌胃蒸餾水,Se-DD98低劑量組灌胃低劑量菌液(菌液活菌數(shù)1×108CFU/kg),Se-DD98高劑量組灌胃高劑量菌液(菌液活菌數(shù)1×109CFU/kg),灌胃體積0.2 mL/10 g(小鼠體重),1次/d。

參照文獻(xiàn)方法[18],建立伊立替康小鼠腹瀉模型。第0～24 d,各組小鼠灌胃無(wú)菌蒸餾水或者菌液;第18 d,正常對(duì)照組腹腔注射無(wú)菌生理鹽水,其余各組每只小鼠腹腔注射150 mg/kg CPT-11,注射體積0.1 mL/10 g(小鼠體重);第17 d和第24 d,每組各取6只小鼠,考察生理生化指標(biāo)及腸道菌群變化;第18～24 d,觀察各組小鼠腹瀉情況。

表2 qRCR引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)體系Table 2 qPCR primer design and reaction system

1.2.3 小鼠體重 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后分別于第18、19、20、21、22、23、24 d每天早上9:00觀察小鼠狀態(tài),測(cè)量各組小鼠體重并記錄[19],按照公式(1)計(jì)算各組小鼠原始體重百分比。

原始體重百分比(%)=Wn/W0×100

式(1)

式中:Wn:第n(0～24) d各組小鼠體重;W0:第0 d各組小鼠體重。

1.2.4 小鼠腹瀉發(fā)生率和腹瀉等級(jí)評(píng)價(jià) 參考文獻(xiàn)方法[20],伊立替康注射24 h后,分別在24、48、72、96、120和144 h觀察小鼠腹瀉情況并進(jìn)行腹瀉評(píng)分(表1),按照公式(2)和(3)分別計(jì)算各組小鼠腹瀉發(fā)生率和小鼠平均腹瀉等級(jí)。

腹瀉發(fā)生率(%)=(N/N0)×100

式(2)

式中:N:各組小鼠腹瀉只數(shù);N0:各組小鼠總只數(shù)。

平均腹瀉等級(jí)=M/N0

式(3)

式中:M:各組小鼠腹瀉等級(jí)之和;N0:各組小鼠總只數(shù)。

表1 小鼠腹瀉評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Diarrhea evalution criteria in mice

1.2.5 小鼠脾臟指數(shù)和外周血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定 第17和24 d,各組小鼠隨機(jī)取出6只并稱重,采用眼內(nèi)眥法采集血液至含肝素的抗凝管中,上下顛倒混勻,在2 h內(nèi)使用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血常規(guī)。所有操作步驟都需要嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行,以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)比分析外周血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果,包括白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。

第17 d和第24 d,采用頸椎脫臼法處死小鼠,冰上操作,取出脾臟并稱重,按照公式:臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)計(jì)算脾臟指數(shù)。

1.2.6 小鼠腸道微生物相對(duì)豐度測(cè)定 第17 d和第24 d,采用頸椎脫臼法處死小鼠,冰上操作,取出0.2 g盲腸內(nèi)容物裝入干凈的EP管中,放入-80 ℃冰箱凍存。使用糞便基因DNA提取試劑盒提取糞便總DNA,超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度并稀釋。參照文獻(xiàn)方法[21-23],使用熒光定量qPCR測(cè)定擬桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、梭菌和大腸桿菌的相對(duì)豐度,CT檢測(cè)限為40個(gè)循環(huán)(表2和表3)。

表3 qPCR反應(yīng)條件Table 3 qPCR reaction conditions

1.2.7 小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)的觀察 采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色法分別于第17 d和第24 d,采用頸椎脫臼法處死小鼠,距回盲瓣5 cm處獲取回腸組織,0.9%生理鹽水沖洗干凈,福爾馬林固定24 h。將石蠟組織切片脫蠟至水,水洗3次,每次2 min;將切片置于蘇木素液中浸染5 min,之后水洗1 min;鹽酸酒精分化30 s之后,流水沖洗5 min;伊紅染液浸染3 min,之后流水沖洗30 s;逐級(jí)乙醇脫水,最后用二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片固定后,于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間的差異采用t-test進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,P<0.05表示存在顯著性差異,P<0.01表示存在極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,伊立替康組、Se-DD98低劑量組和高劑量組小鼠的原始體重百分比在第18 d注射伊立替康后均呈現(xiàn)先下降后回升的趨勢(shì)(圖1)。

表4 小鼠在18 d到24 d的原始體重百分比Table 4 Percentage of initial mouse body weight from the 18 d to the 24 d

圖1 小鼠原始體重百分比變化Fig.1 Changes of percentage of initial mouse body weight

注：與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與伊立替康組比較,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;與低劑量比較,#P<0.05,##P<0.01。表5～6同。

由表4可知,與正常對(duì)照組比較,注射伊立替康后,伊立替康組、Se-DD98低劑量組和高劑量組的原始體重百分比均顯著降低(P<0.05)。但與伊立替康組比較,Se-DD98低劑量組的原始體重百分比在18～19 d顯著降低(P<0.05),在23和24 d顯著升高(P<0.05);與伊立替康組比較,Se-DD98高劑量組的原始體重百分比在18 d極顯著降低(P<0.01),在20 d以后均極顯著升高(P<0.01);且Se-DD98高劑量組的原始體重百分比顯著高于低劑量組(P<0.05)。結(jié)果表明,伊立替康會(huì)造成小鼠體重下降,而長(zhǎng)期給予Se-DD98菌粉能夠抑制伊立替康造成的體重下降,并且存在劑量依賴性。

表5 Se-DD98 對(duì)伊立替康所致腹瀉小鼠平均腹瀉等級(jí)的影響Table 5 Effect of Se-DD98 on average diarrhea levels in diarrhea mice induced by irinotecan

2.2 Se-DD98對(duì)小鼠腹瀉發(fā)生率和平均腹瀉等級(jí)的影響

研究表明,伊立替康誘導(dǎo)的高腹瀉發(fā)生率將影響藥物的臨床治療,并且嚴(yán)重的腹瀉等級(jí)也會(huì)致使脫水等生命危險(xiǎn)[24]。伊立替康組腹瀉發(fā)生率隨著時(shí)間增加呈現(xiàn)先逐漸上升,后期下降后保持不變的趨勢(shì)。Se-DD98低劑量組在96 h下降后保持不變,Se-DD98高劑量組在48 h下降后保持不變,但Se-DD98高、低劑量組的腹瀉發(fā)生率均低于伊立替康組(圖2)。

圖2 Se-DD98對(duì)伊立替康所致腹瀉小鼠腹瀉發(fā)生率的影響Fig.2 Effect of Se-DD98 on diarrhea incidencein diarrhea mice induced by irinotecan

伊立替康組和Se-DD98高、低劑量組的平均腹瀉等級(jí)也顯示隨時(shí)間而變化,出現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象。伊立替康組在各時(shí)間點(diǎn)的平均腹瀉等級(jí)均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。Se-DD98低劑量組在144 h,Se-DD98高劑量組在72～144 h的平均腹瀉等級(jí)均顯著低于伊立替康組(P<0.05)(表5)。結(jié)果表明,伊立替康會(huì)導(dǎo)致小鼠不同程度的腹瀉且平均腹瀉等級(jí)呈現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象,給予Se-DD98菌粉能夠降低小鼠腹瀉發(fā)生率和平均腹瀉等級(jí)。由此推知,Se-DD98能夠緩解伊立替康所致的小鼠持續(xù)腹瀉。

2.3 Se-DD98對(duì)小鼠免疫指標(biāo)的影響

研究認(rèn)為,雙歧桿菌對(duì)正常小鼠免疫功能影響的水平低于其對(duì)免疫功能低下小鼠模型各項(xiàng)免疫指標(biāo)的影響[25];與單獨(dú)給予硒或者單獨(dú)給予益生菌比較,富硒益生菌具有更多優(yōu)勢(shì),能夠增強(qiáng)環(huán)磷酰胺治療的荷瘤小鼠的免疫功能[12,26]。由表6可知,第17 d(伊立替康注射前),各組小鼠的脾臟指數(shù)、白細(xì)胞指數(shù)、淋巴細(xì)胞指數(shù)和中性粒細(xì)胞指數(shù)均沒(méi)有顯著差異。第24 d(伊立替康注射后),與正常對(duì)照組比較,伊立替康組的脾臟指數(shù)和白細(xì)胞數(shù)目均極顯著降低(P<0.01)。與伊立替康組比較,Se-DD98低劑量組的脾臟指數(shù)和中性粒細(xì)胞指數(shù)均顯著升高(P<0.05),Se-DD98高劑量組的脾臟指數(shù)、白細(xì)胞指數(shù)和中性粒細(xì)胞均顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明,伊立替康注射前,長(zhǎng)期給予Se-DD98菌粉對(duì)正常小鼠免疫功能沒(méi)有明顯的影響。伊立替康注射后造成小鼠免疫功能下降,Se-DD98菌粉能夠提高小鼠免疫功能。由此推知,Se-DD98菌粉對(duì)正常小鼠免疫功能影響甚微,但能抑制伊立替康所致的機(jī)體免疫功能下降,具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。

表6 Se-DD98對(duì)伊立替康所致腹瀉小鼠免疫指標(biāo)的影響Table 6 Effect of Se-DD98 on immune indexes in diarrhea mice induced by irinotecan

圖3 Se-DD98對(duì)小鼠腸道菌群相對(duì)豐度的影響Fig.3 Effect of Se-DD98 on relative abundance of intestinal microflora in mice 注:A:梭菌;B:大腸桿菌;C:擬桿菌;D:雙歧桿菌。與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與伊立替康組比較,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;與低劑量比較,#P<0.05,## P<0.01。

2.4 Se-DD98對(duì)小鼠腸道菌群的影響

研究表明[23,27-28],擬桿菌、梭菌和大腸桿菌能夠增強(qiáng)β-D-葡糖醛酸糖苷酶的活性,促使腸道內(nèi)非活性化合物SN-38G轉(zhuǎn)化為活性化合物SN-38,從而加劇小鼠腹瀉。Kulkarni課題組研究表明[29],飲食中的長(zhǎng)雙歧桿菌能夠影響某些與β-D-葡糖醛酸糖苷酶相關(guān)的腸道微生物菌群的代謝活性。

第17 d(伊立替康注射前),與正常對(duì)照組比較,Se-DD98高、低組的大腸桿菌和擬桿菌相對(duì)豐度顯著減少(P<0.05);而雙歧桿菌相對(duì)豐度顯著增加(P<0.01)。有研究表明,益生菌制劑減少正常小鼠糞便中大腸桿菌等有害菌含量,增加雙歧桿菌等有益菌含量[30]。由此推知,長(zhǎng)期給予Se-DD98,能夠增加正常小鼠糞便雙歧桿菌等有益菌含量,減少梭菌、大腸桿菌和擬桿菌的含量。

第24 d(伊立替康注射后),與正常對(duì)照組比較,伊立替康組的梭菌和擬桿菌顯著增加(P<0.01),大腸桿菌和雙歧桿菌顯著減少(P<0.01);Se-DD98低、高劑量組的大腸桿菌、擬桿菌顯著減少(P<0.01),而梭菌和雙歧桿菌顯著增加(P<0.01)。與伊立替康組比較,Se-DD98低、高劑量組的梭菌、大腸桿菌和擬桿菌相對(duì)豐度顯著減少(P<0.01),而雙歧桿菌顯著增加(P<0.01)。Se-DD98低、高劑量組的擬桿菌的減少和雙歧桿菌的增加呈劑量依賴性(圖3)。

圖4 Se-DD98對(duì)伊立替康所致腹瀉小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of Se-DD98 on histologic structure of the ileum in diarrhea mice induced by irinotecan注:A：第17 d正常對(duì)照組;B:第17 d伊立替康組;C:第17 d Se-DD98低劑量組;D:第17 d Se-DD98高劑量組;E:第24 d正常對(duì)照組;F:第24 d伊立替康組;G:第24 d Se-DD98低劑量組;H:第24 d Se-DD98高劑量組。

上述結(jié)果表明,伊立替康注射后導(dǎo)致小鼠腸道內(nèi)與β-D-葡糖醛酸糖苷酶相關(guān)的梭菌和擬桿菌相對(duì)豐度增加。長(zhǎng)期給予Se-DD98菌粉能夠降低小鼠腸道內(nèi)的梭菌、大腸桿菌和擬桿菌相對(duì)豐度,增加長(zhǎng)雙歧桿菌相對(duì)豐度。由此推知,Se-DD98菌粉能夠緩解伊立替康所致小鼠腹瀉,可能其降低與β-D-葡糖醛酸糖苷酶相關(guān)的腸道菌含量并且增加雙歧桿菌含量有關(guān)。

2.5 Se-DD98對(duì)小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)的影響

研究表明,伊立替康導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重腹瀉,并對(duì)腸道結(jié)構(gòu)和細(xì)胞有損害作用[31]。第17 d(伊立替康注射前),各組小鼠的小腸腸壁各層結(jié)構(gòu)完好,無(wú)潰瘍形成,腺體大小、形態(tài)、分布正常,腸壁未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。第24 d(伊立替康注射后),與正常對(duì)照組比較,伊立替康組小腸粘膜變薄、粘膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落,見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),腺體有萎縮,腸腺減少。與伊立替康組比較,Se-DD98低、高劑量組只顯示部分粘膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)。

結(jié)果表明,伊立替康會(huì)導(dǎo)致小鼠回腸粘膜變薄、粘膜細(xì)胞變性以及腺體萎縮等損傷。長(zhǎng)期給予Se-DD98菌粉對(duì)正常小鼠回腸粘膜、細(xì)胞和腺體無(wú)影響,但能夠減輕由伊立替康導(dǎo)致的腸道粘膜、細(xì)胞和腺體的損傷。由此推知,Se-DD98對(duì)正常小鼠腸道結(jié)構(gòu)和細(xì)胞無(wú)損害作用,但對(duì)伊立替康所致的腸道損傷有保護(hù)作用;Se-DD98緩解小鼠腹瀉可能與其保護(hù)腸道細(xì)胞和粘膜有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明Se-DD98能夠抑制伊立替康所致的小鼠體重下降和免疫功能降低;降低小鼠腹瀉發(fā)生率和平均腹瀉等級(jí),緩解伊立替康所致的小鼠腹瀉。Se-DD98能夠減少腸道內(nèi)與β-D-葡糖醛酸糖苷酶相關(guān)的梭菌、大腸桿菌和擬桿菌含量,并且增加腸道內(nèi)雙歧桿菌含量,推測(cè)Se-DD98可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群緩解伊立替康所致腹瀉。Se-DD98也能夠減輕伊立替康導(dǎo)致的小鼠腸道粘膜、細(xì)胞和腺體的損傷,推測(cè)Se-DD98緩解腹瀉與保護(hù)腸道粘膜有關(guān),具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外,Se-DD98對(duì)正常小鼠免疫功能影響甚微,但能抑制伊立替康所致的機(jī)體免疫功能下降,具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。本研究為應(yīng)用Se-DD98輔助治療伊立替康等常用化療藥物引起的腹瀉等副作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。