葉冬青，鄭笑天，李 瑩，段長青,，劉延琳,

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，農業(yè)部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

揮發(fā)性硫化物（volatile sulfur compounds，VSCs）具有強揮發(fā)性、高活性和低閾值的特點。目前已報道的葡萄酒中存在的VSCs多達四十多種，從化合物的結構可分為硫醇、硫醚、多硫化物、硫酯和含硫雜環(huán)化合物五大類[1]。VSCs對葡萄酒風味的影響具有多樣性。硫化氫、甲硫醇、乙硫醇等極易揮發(fā)的硫醇類物質，被認為是形成還原味（臭雞蛋味）的主要來源物質，其對存在還原缺陷的葡萄酒起決定性的作用[2-4]。部分VSCs對葡萄酒香氣的影響取決于其濃度，如二甲硫醚（dimethylsulfide，DMS）是葡萄酒中被廣泛關注的硫醚類物質，低濃度時常帶來蘆筍、玉米和糖蜜的氣味[5]；而高濃度時，DMS則可破壞葡萄酒的香氣，如在一些被描述為具有“綠橄欖”氣味的葡萄酒中，DMS質量濃度一般高于 100 μg/L[6]，另外如果葡萄酒陳釀過程中存在較高質量濃度的DMS，則還容易出現金屬或者溫桲等異味[2]。

葡萄酒釀造過程中的各個階段都會產生VSCs[7-9]，相比于發(fā)酵階段存在的CO2排放或倒罐等通氣方式可以適當去除硫化氫引起的早期感官缺陷，陳釀過程中VSCs會形成更穩(wěn)定的含巰基、酯類[10]或非游離態(tài)含硫化合物[11]，從而使通氣[3]或硫酸銅處理[12]失效，且曝氣處理可能造成其他香氣物質的損失[13]，因而關注陳釀過程中VSCs的影響因素具有重要現實意義。Nguyen等[14]在研究聚乙烯罐微氧陳釀的過程中發(fā)現DMS和硫酯類物質含量不受氧氣的影響。McCord[15]的研究表明在不銹鋼罐中陳釀的酒添加橡木制品能顯著降低DMS含量。Ferreira等[2]則對比了不同溶氧量、游離SO2、pH值及溫度等工藝條件對波特酒中VSCs的影響，發(fā)現溫度和溶氧是影響VSCs最大的因素。以上研究探討了不同陳釀條件下，葡萄酒中VSCs含量的變化，為深入研究不同釀造工藝條件對葡萄酒質量的影響積累了有效信息，然而由于葡萄酒基質較為復雜，VSCs陳釀過程中的變化機理仍然難以證實。

近年來，隨著我國葡萄酒市場規(guī)模不斷擴大、產業(yè)升級的需求，橡木桶被越來越多地運用到陳釀中。簡單而言，橡木桶產地即板材的來源，由于不同樹種結構和成分的不同，每一種橡木賦予葡萄酒的風味也不一樣。目前廣泛用使用的3 個橡木品種分別為：主要來源于法國等中歐地區(qū)的巖生櫟（Quercus petraea）和夏櫟（Quercus robur），俗稱法國橡木；來源于美洲的白櫟（Quercus alba），即美國橡木[5]。它們的主要區(qū)別在于含有的重要浸出物如總酚、鞣花單寧及橡木內酯等物質含量及氧通透率不同[16]。橡木桶的烘烤度指對板材進行烘烤以達到彎曲定型，同時改善木材風味的目的。烘烤的時間和溫度結合板材自身的化學組成決定了既定的橡木桶風格[17]。目前不同類型的橡木桶對葡萄酒中揮發(fā)性物質影響的研究多集中于橡木內酯、酚醛樹脂、呋喃等物質[18-19]。盡管普遍認為橡木桶的微氧環(huán)境可以抑制VSCs的形成[5]，然而目前尚鮮見橡木桶陳釀對VSCs影響的研究報道。

VSCs作為葡萄酒缺陷中還原味的主要貢獻者，對葡萄酒風味的影響已成為當今的研究熱點。雖然隨著近年來分析儀器及相關分子技術的快速升級，研究者在VSCs的產生途徑及基因調控等方面的研究均取得了較大進展，但仍缺乏橡木桶陳釀與葡萄酒中VSCs形成的相關性研究，特別是除硫化氫之外的其他VSCs，幾乎未被關注到。另外也鮮見針對我國葡萄酒中含硫風味物質的相關研究，導致缺乏對葡萄酒釀造各個過程中還原味缺陷形成原因的深入了解，而使企業(yè)生產的葡萄酒中經常出現硫異味的現象，制約我國葡萄酒行業(yè)的發(fā)展。

本實驗以我國新疆產區(qū)的赤霞珠原酒為材料，研究3 個產地（美國、匈牙利及法國）及兩種烘烤度（輕度和中度）的橡木桶陳釀對葡萄酒中VSCs的影響，獲得葡萄酒在不同橡木桶陳釀過程中VSCs的變化規(guī)律，以期為釀酒師的陳釀工藝提供參考，同時對預測葡萄酒潛在的還原味風險及制定瓶貯期的管理措施有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠原酒來自2012年新疆瑪納斯產區(qū)（44°18’ N，86°24’ E），按照酒廠傳統工藝完成了乙醇發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵。其基本理化指標如下：還原糖2.84 g/L（以葡萄糖計），可滴定酸5.94 g/L（以酒石酸計），pH 3.5，乙醇體積分數13.5%。

硫化物的標樣分別購自美國Sigma-Aldrich公司、瑞士Fluka公司及北京百靈威科技公司，各化合物的純度均大于98%。硫化物的相關名稱及縮寫見表1。

所有橡木桶均由煙臺戴普瑞斯公司提供。

表 1 葡萄酒陳釀過程中VSCs的變化范圍Table 1 Ranges of volatile sulfur compounds contents in wines during aging

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀結合H9261火焰光度檢測器（flame photometric detector，FPD） 美國Agilent Technologies公司；HP-INNOWAX毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國J&W Scientific公司；頂空固相微萃?。╤eadspace-solidphase micro-extraction，HS-SPME）（裝置包括操作平臺、磁力攪拌器、SPME進樣手柄、SPME萃取纖維） 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒的陳釀

原酒分別灌入6 種類型的橡木桶進行陳釀（通過恒溫恒濕空調機控制酒窖的溫度為14～16 ℃，相對濕度70%～80%）。225 L全新橡木桶來自3 個產地： 1）美國密蘇里Missouri（USA），橡木品種為白櫟，樹齡150～200 a；2）匈牙利（HU），橡木品種為夏櫟，樹齡150～200 a；3）法國中部（FR），橡木品種為巖生櫟，樹齡約160 a。每個產地橡木桶均有2 種烘烤度，分別為中度烘烤（MT，175 ℃烘烤15 min）和輕度烘烤（LT，150 ℃烘烤15 min）。所有橡木桶紋理均為細紋理，即橡木板材紋理間的平均間距為1～3 mm。分別以MT_USA、LT_USA、MT_HU、LT_HU、MT_FR及LT_FR表示這6 種類型的橡木桶。以100 L不銹鋼貯酒罐（SST）作為對照組，每種處理設置2 個重復，陳釀時長1 a。陳釀過程中每2 個月添酒以補充因揮發(fā)而造成的不滿桶現象，并監(jiān)測游離SO2的質量濃度，并補充至 30 mg/L。原酒入桶后每3 個月取樣1 次，每桶（罐）取兩瓶330 mL樣品于-20 ℃凍存待分析。

1.3.2 VSCs的測定

陳釀樣品中16 種VSCs的測定采用本實驗開發(fā)的SPME-GC/FPD方法[20]。在15 mL的棕色樣品瓶中加入5.00 mL樣品、1.25 g MgSO4·7H2O和磁力轉子后，迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的樣品瓶蓋擰緊后置于磁力攪拌加熱臺上，恒溫40 ℃，轉速500 r/min，平衡10 min后插入已活化的萃取纖維（50/30 μm×2 cm DVB/CAR/PDMS），頂空萃取50 min，然后將已吸附揮發(fā)性物質的萃取頭插入GC的進樣口，250 ℃熱解吸8 min。色譜分離升溫程序為：初溫40 ℃，保持5 min，然后以8 ℃/min 升溫至150 ℃，再以2℃/min升溫至180 ℃，最后以 15 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min。載氣為高純氮氣，采用不分流模式進樣。檢測器溫度為250 ℃；氫氣流速為50 mL/min；空氣流速為60 mL/min。根據標準品的保留時間進行VSCs的定性。定量采用外標法。

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010進行數據統計，Origin 8.5進行繪圖。使用SPSS 20.0進行單因素方差分析（ANOVA），Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。采用MetaboAnalyst 3.0進行聚類分析[21]。

2 結果與分析

2.1 橡木桶陳釀過程檢測物質篩選

如表1所示，在本實驗檢測的16 種目標物中，DMTh、DEDS、ME、PMTE、ETP、MTB及BT共7 種物質在所有的樣品中均未檢出，MTPA和MMTP在部分樣品中檢出但未達到定量限。另外7 種物質（DMS、MTA、ETA、MTE、2MTHF、EMTP、MTP）則存在于陳釀的各個階段，將重點論述這7 種物質在橡木桶陳釀過程中的變化。

2.2 DMS含量的變化

圖 1 不同處理酒樣陳釀過程中DMS的變化Fig. 1 Evolution of DMS content in wines during maturation in different oak barrels versus in stainless steel tanks

如圖1所示，隨著陳釀的進行，DMS逐漸累積。和原酒相比，在經過12 個月的陳釀后，所有酒樣中DMS的增幅在61%～112%之間，這與研究者的報道一致[2,22-23]。陳釀過程中，葡萄酒中非揮發(fā)性的前體物（如S-甲基甲硫氨酸）會通過化學作用逐漸轉化為DMS，所以隨著陳釀的進行，DMS會不斷累積[24]。

從整體上看，本實驗中DMS含量在不同橡木桶中的變化趨勢較為一致，而在不銹鋼罐中的波動范圍較大。方差分析結果表明不同處理之間，DMS含量在陳釀3 個月時的差異最明顯（P＜0.001），其中匈牙利橡木桶酒樣中DMS含量顯著低于其他產地的橡木桶及不銹鋼罐，然而這種差異并沒有在后續(xù)的陳釀中繼續(xù)維持。陳釀6 個月時，各處理之間的差異不顯著（P=0.06）。當陳釀進行了9 個月后，各個類型橡木桶陳釀中DMS含量均顯著低于不銹鋼罐的陳釀，說明橡木桶陳釀不利于DMS的積累。

盡管有研究認為，DMS在微氧陳釀[14-15]或者瓶貯時[27]并不受氧氣含量的影響，但是橡木桶中陳釀的葡萄酒除接觸通過微孔進來的氧氣之外，也和板材中的物質相互作用，可能會通過物理或者化學反應形成一些新的物質[18]， 而這些物質可能會抑制DMS前體向DMS的轉化，或者促進了DMS的裂解，相關機理仍需進一步研究。在McCord[15]的研究中，和無添加的赤霞珠葡萄酒的微氧陳釀相比，所有添加了橡木成分的葡萄酒中DMS含量均顯著降低，這與本實驗的結果較為一致。

2.3 硫醚醇（酮）類化合物含量的變化

MTP、2MTHF和MTE是葡萄酒中報道較多的硫醚醇（酮）類物質，它們的形成與發(fā)酵過程中微生物對甲硫氨酸的代謝密切相關[25]，通常會給葡萄酒帶來花椰菜、煮卷心菜、金屬或者法國豆等氣味。

圖 2 不同處理酒樣陳釀過程中MTP（A）、2MTHF（B）和 MTE（C）的變化Fig. 2 Evolution of MTA (A), 2MTHF (B) and MTE (C) content in wines during maturation in different oak barrels versus in stainless steel tanks

MTP作為葡萄酒中含量最豐富的VSCs，被認為是由酵母引起的葡萄酒還原缺陷的主要物質[28]，其在葡萄酒中的閾值為500 μg/L，某些具有硫異味的酒樣中，MTP質量濃度可高達5 mg/L[29]。如圖2A所示，本實驗所用原酒的MTP含量已超過其閾值，但是在陳釀過程中，MTP含量變化整體呈下降的趨勢，在9 個月達到最低值后略有回升。不同橡木桶陳釀葡萄酒中MTP的變化模式基本一致。在3 個月時，不銹鋼罐葡萄酒中MTP含量略有上升，且顯著高于橡木桶中（輕烘烤的法國桶除外）含量。在6 個月時，美國桶和匈牙利桶葡萄酒中的MTP含量顯著低于輕烘烤法國桶。9 個月時，只有不銹鋼罐葡萄酒中MTP含量顯著低于中烘烤匈牙利桶，其他處理之間差異不顯著；而陳釀12 個月時，所有橡木桶陳釀葡萄酒中MTP含量均顯著低于不銹鋼罐，且其在匈牙利和法國的橡木桶中含量最低，說明經過1 a的陳釀，橡木桶可以有效降低葡萄酒中MTP含量。

2MTHF在葡萄酒中的閾值為250 μg/L，經常被描述為具有金屬或者天然氣的氣味[26]。本實驗中，所有樣品中2MTHF含量均遠低于其閾值。隨著陳釀的進行，2MTHF含量逐漸降低，各橡木桶中的變化趨勢較為一致，而在不銹鋼罐陳釀中下降的幅度較小，且在各個時間點均顯著高于橡木桶陳釀中含量。不同陳釀時間下，各處理的差異顯著性分析如圖2B所示。在3 個月時，匈牙利橡木桶葡萄酒中2MTHF含量顯著低于其他橡木桶。值得注意的是在該時間點，各產地輕度烘烤處理的橡木桶中2MTHF含量都低于中度烘烤的橡木桶。然而這種差異在后續(xù)的陳釀中并沒有保持。在陳釀12 個月時，中度烘烤美國桶及輕度烘烤匈牙利桶葡萄酒中2MTHF含量要顯著低于其他處理。

從圖2C可知，隨著陳釀的進行，MTE先逐漸上升，在3 個月或6 個月時達到最大值，然后下降。在3 個月時，中度烘烤橡木桶陳釀的葡萄酒中MTE含量顯著低于輕度烘烤的橡木桶陳釀，3 個產地橡木桶的規(guī)律一致。而在6 個月時，匈牙利橡木桶陳釀酒表現為輕度低于中度的，但是另外2 個產地的處理依然保持。陳釀結束后，匈牙利桶葡萄酒中MTE含量相對更高。

2.4 硫酯類化合物含量的變化

如圖3A所示，MTA含量隨著陳釀的進行，整體呈下降的趨勢。陳釀3 個月時，匈牙利橡木桶中葡萄酒的MTA含量顯著低于其他處理，隨后有一定幅度的上升，而其他處理樣品中MTA含量在陳釀3 個月時最高。經過12 個月的陳釀，所有橡木桶陳釀酒中MTA含量均顯著低于不銹鋼罐陳釀酒。

如圖3B所示，ETA含量隨著陳釀的進行，整體呈上升的趨勢。陳釀12 個月時，輕烘烤法國橡木桶中葡萄酒的ETA質量濃度更低。

EMTP含量在陳釀的過程中表現為先上升后下降的趨勢（圖3C）。與MTA含量的變化較為相似，且在3 個月時，匈牙利橡木桶中陳釀酒的MTA含量顯著低于其他處理條件。陳釀12 個月后，除了不銹鋼罐陳釀酒中MTA含量顯著高于原酒（增幅達19.93%）外，其他橡木桶陳釀酒中MTA含量變化不大。

圖 3 不同處理酒樣陳釀過程中MTA（A）、ETA（B）和 EMTP（C）的變化Fig. 3 Evolution of MTA (A), ETA (B) and EMTP (C) contents in wines during maturation in different oak barrels versus in stainless steel tanks

MTA、ETA及EMTP均為硫酯類化合物，其中MTA和ETA可能是發(fā)酵過程中由硫醇與乙酰輔酶A反應生成的[25]。 在本實驗所有樣品中，以上3 種化合物的質量濃度均在10 μg/L之下，遠低于它們各自的閾值（在50～180 μg/L之間）[1]。雖然含量不高，但酯類物質會在陳釀過程中因化學平衡因素而發(fā)生水解，生成乙酸和相應的硫醇類化合物[23]。而一般情況下，硫醇的閾值較低，特別是甲硫醇和乙硫醇，其在葡萄酒中的閾值僅分別為0.3 μg/L和1.1 μg/L[30]。這也是有些葡萄酒在罐裝時并沒有不良風味，但是在開瓶時卻會出現異味的原因。因而關注硫酯類化合物在陳釀過程中的變化具有重要的現實意義。

2.5 影響陳釀過程中VSCs變化的因素

本實驗研究了赤霞珠葡萄酒中VSCs在6 種類型橡木桶及不銹鋼罐陳釀中含量的變化規(guī)律。對存在于所有樣品中的7 種VSCs進行多因素方差分析，考察陳釀時間、橡木桶產地及烘烤度3 個因素及其兩兩交互的影響，結果如表2所示。陳釀時間對7 種VSCs都有極顯著影響，說明在一定程度上可以通過控制桶貯時間調控VSCs含量。橡木桶產地對MTA、2MTHF、MTP和EMTP存在顯著性影響，烘烤度僅對MTE有顯著影響。

表 2 不同因素對陳釀過程中VSCs影響的方差分析Table 2 Multi-way ANOVA of the effect of different variables on VSCs during wine aging

圖 4 不同處理酒樣陳釀過程中VSCs的聚類分析Fig. 4 Hierarchical clustering of VSCs in wines during maturation in different oak barrels versus in stainless steel tanks

為更加直觀和清晰地反映不同橡木桶陳釀對葡萄酒中VSCs的影響，采用MetaboAnalysis 3.0進行層次聚類分析，結果如圖4所示。各類處理基本按照陳釀時間分成了兩大類，3～6 個月中大部分VSCs含量更高，而9～12 個月中大部分物質含量下降，說明陳釀時間是影響VSCs含量變化的最大因素。在化合物的聚類上，DMS和ETA聚為一類，其他化合物則聚在一起。從整體上看，來自匈牙利桶酒樣之間的距離更短，這些樣本中VSCs含量也更低，特別是在陳釀3 個月和6 個月時。因此，如果就VSCs方面考慮，在進行短期陳釀的葡萄酒中，可以使用匈牙利橡木桶。

3 結 論

本實驗研究了不同類型橡木桶（產地、烘烤度）陳釀工藝對葡萄酒中VSCs形成的影響，發(fā)現在葡萄酒的陳釀過程中，時間是影響VSCs含量的最顯著因素，所有檢測到的VSCs均受到影響。橡木桶產地對MTA和2MTHF有極顯著的影響；烘烤度僅對MTE有影響，最大的差異出現在陳釀3 個月時，中度烘烤橡木桶中葡萄酒的MTE含量顯著低于輕度烘烤。在短期（3～6 個月之內）的陳釀中，匈牙利橡木桶陳釀的葡萄酒中VSCs含量更低。不同VSCs在陳釀中的變化規(guī)律不同：DMS和ETA隨著陳釀的進行逐漸累積，在陳釀12 個月后，增幅分別達61%～112%和43%～82%，而其他VSCs均表現為下降或變化不大的趨勢。1 a的陳釀結束時，橡木桶陳釀酒中大部分VSCs（DMS、MTA、2MTHF、MTP、EMTP）含量都顯著低于不銹鋼罐，說明橡木桶的陳釀環(huán)境有利于VSCs的降低。本研究結果評估了不同類型橡木桶陳釀對葡萄酒潛在還原味的影響程度，為全面評價其在釀酒工業(yè)中的運用提供了理論基礎，同時也為企業(yè)決策者和釀酒師的工藝選擇提供參考。