心肌梗死是心內科常見的臨床急癥，心肌細胞的再生能力有限，缺血壞死后導致后期心室重構，從而導致心功能不全或者心力衰竭發(fā)生。快速恢復血供，預防后期心室重構是目前心肌梗死治療的主要方法[1]，雖然近年來干細胞移植、基因編程等治療方法應用到心肌梗死的治療研究中，但是藥物治療仍然是保護心肌的常用方法[2]。臨床研究顯示曲美他嗪在冠狀動脈血運重建過程中可以發(fā)揮作用，促進心肌代謝及心肌能量的產生[3]；臨床和實驗研究均顯示曲美他嗪可以保護缺血心肌細胞，常用于心肌梗死的治療[4]。本研究通過構建心肌梗死大鼠模型，觀察曲美他嗪對模型大鼠心肌細胞凋亡、自噬以及心功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級成年雄性SD大鼠，由海南醫(yī)學院動物實驗中心提供，體質量190～220 g，清潔級適應性喂養(yǎng)3 d后，建立心肌梗死模型。

1.2 實驗造模 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，插管連接小動物呼吸機，心電圖機連接大鼠四肢，左側胸前區(qū)備皮消毒后胸骨左側第3肋和第4肋間切開皮膚，依次分離肌肉、組織，40只SD大鼠暴露心臟后用6-0號無創(chuàng)縫合線于肺動脈圓錐與左心耳之間距離主動脈根部 1 mm處結扎前降支，縫線下方心肌變白、運動減弱，心電圖Ⅱ導聯(lián)見ST段弓背向上，為造模成功，將40只造模成功SD大鼠隨機分為對照組和曲美他嗪組。另外20只SD大鼠作為假手術組，僅僅在前降支下穿線不做結扎。所有模型鼠恢復自主呼吸后拔管撤機。假手術組和對照組不做處理，曲美他嗪組給予10 mg/(kg·d)曲美他嗪灌胃，連續(xù)給藥28 d。

1.3 心功能檢測 手術前和術后第28天，使用彩超，頻率13 MHz，測定左心室收縮末期內徑(LVESD)、短軸縮短分數(FS) 和射血分數(EF)。

1.4 心肌細胞凋亡原位檢測 TUNEL 法檢測細胞凋亡，試劑盒購自美國Millipore公司，按照說明書操作。第28天試驗完成后斷頸處死所有動物，心肌梗死區(qū)取材，常規(guī)石蠟包埋、切片后使用TUNEL試劑盒染色，凋亡細胞染為棕色，200×顯微鏡下計數凋亡細胞，計算凋亡指數(PI)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.5 心肌細胞自噬蛋白的Western Blot檢測 第28天試驗完成后斷頸處死所有動物，心肌梗死區(qū)取材，液氮下研磨，提取細胞總蛋白，80 V SDS-PAGE凝膠電泳蛋白2 h后，100 V電轉蛋白至PVDF膜，加入LC3Ⅱ抗體(美國cell signal公司)孵育過夜后，加入二抗，2 h，化學發(fā)光法檢測目的蛋白的表達，膠片曝光顯示目的條帶，β-actin作為內對照。Bandscan軟件掃描后計算LC3Ⅱ蛋白的相對表達量，即相對灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理 所有數據輸入SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間均數比較進行方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗；計數資料應用χ2分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組術后存活率比較 假手術組大鼠無死亡，存活率為100.0%，對照組死亡9只，存活11只，存活率為55.0%，曲美他嗪組死亡4只，存活16只，存活率為80.0%。3組間死亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 3組術后心肌凋亡指數比較 假手術組、對照組和曲美他嗪組術后第28天缺血心肌細胞PI值分別為(0.76±0.23)%、(21.52±6.57)%和(12.38±2.15)%，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見圖1。

圖1 心肌細胞凋亡的TUNEL檢測

2.3 3組術后心肌自噬蛋白LC3Ⅱ表達的比較 經灰度掃描后，假手術組、對照組和曲美他嗪組心肌自噬蛋白LC3Ⅱ相對灰度值分別為0.17±0.03，0.46±0.12，0.68±0.15，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見圖2。

圖2 3組心肌自噬蛋白LC3Ⅱ的表達比較

2.4 3組大鼠心功能比較 3組手術前LVESD、FS 和EF比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，術后28 d，假手術組LVESD、FS和EF變化與術前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但對照組和曲美他嗪組LVESD較術前升高(P<0.05)，FS和EF減低(P<0.05)，且術后28 d曲美他嗪組LVESD低于對照組(P<0.05)，而FS和EF高于對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組LVESD、FS和EF指標比較(±s)

與假手術組比較，①P<0.05，②P<0.01；與對照組比較，③P<0.05；與本組手術前比較，④P<0.05。

3 討 論

心肌細胞屬于穩(wěn)定細胞，基本不能再生，缺血后心肌細胞凋亡是心肌細胞損傷或丟失的主要表現形式[4]，誘發(fā)了心室重構加劇以及后期的心功能不全[5]。孫靜等[6]應用Vinexin-β 基因敲除小鼠發(fā)現抑制心肌細胞凋亡后，可以減少梗死心肌面積以及保護心功能。

細胞自噬的誘導與調節(jié)是一個非常復雜的過程，自噬在心肌細胞能量代謝中占有重要地位，功能紊亂或受損細胞質成分在自噬溶酶體作用下分解為能量物質，雖然目前對心肌梗死中自噬功能作用仍存有爭議，但多數研究認為適當的自噬對心臟損傷的修復以及功能起到保護作用。心肌缺血時ATP水平降低，細胞能量感受器AMPK-mTORC1-ULK1 信號通路激活，激活位于內質網的beclin-1蛋白，導致了自噬[7]。自噬對心肌的相關保護機制為：自噬分解受損細胞器給細胞提供能量，可以緩解受損心肌細胞的能量危機；抑制受損的線粒體誘發(fā)的過量活性氧產生，促進功能紊亂線粒體的更新；清除過激反應蛋白維持細胞穩(wěn)態(tài)[8]。心肌梗死時常常表現為心肌細胞的自噬活動增強，就可以釋放出大量的能量物質，補充心肌缺血造成的能量危機[9]。自噬體膜型(LC3Ⅱ)是自噬標志物，LC3-Ⅱ增多說明自噬過程激活，班努·庫肯等[10]研究發(fā)現，心肌梗死大鼠模型自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達顯著增加，參與受損心肌的修復。

近期有研究顯示，心肌細胞凋亡和自噬可以通過一些通路聯(lián)系起來。Wang等[11]研究顯示當心肌細胞自噬減少時凋亡就會增加；Zhang等[12]在糖尿病性心肌病大鼠模型中也發(fā)現早期給予曲美他嗪可以降低心肌細胞凋亡，增加自噬。本研究探討了心肌細胞缺血時曲美他嗪對受損細胞凋亡和自噬的調節(jié)作用，為心肌梗死的治療提供新思路。LC3Ⅱ是一種自噬激活的標志性蛋白，其水平升高可以反映細胞自噬的增加，本研究觀察到曲美他嗪組LC3Ⅱ表達水平高于對照組，說明曲美他嗪加強了缺血心肌細胞自噬的激活，增強缺血心肌細胞的保護性自噬反應。譚淑娜等[13]在心力衰竭大鼠模型中也發(fā)現了曲美他嗪可以升高缺血心肌細胞的自噬應激反應，發(fā)揮心功能保護作用。本研究顯示曲美他嗪組對LVESD、FS和EF的改善作用優(yōu)于對照組，說明了曲美他嗪有利于心肌梗死大鼠心功能的修復。

綜上所述，曲美他嗪有助于大鼠心功能恢復，減少心肌細胞凋亡和增加心肌自噬。