,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院/食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122 2.蘇州工業(yè)園區(qū)新國(guó)大研究院,江蘇蘇州 215123)

炭疽病作為芒果最嚴(yán)重的,也是熱帶水果和蔬菜中最具破壞性的疾病之一,包括芒果、木瓜、香蕉、葡萄等的炭疽病,由真菌芒果膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz,C.gloeosporioides)引起[1]。在國(guó)內(nèi)外芒果產(chǎn)區(qū)、不同芒果品種間普遍發(fā)生。接近成熟或成熟果實(shí)感病,初期形成黑褐色圓形病斑,擴(kuò)大后呈圓形或不規(guī)則形,黑色,中間凹陷,在儲(chǔ)存,運(yùn)輸和銷售過(guò)程中會(huì)對(duì)果實(shí)造成損害[2]。

長(zhǎng)期以來(lái),芒果炭疽病的在我國(guó)的防治以化學(xué)藥劑為主,農(nóng)戶使用合成殺菌劑如苯菌靈,代森錳鋅等,或結(jié)合多菌靈,可以減少收獲后疾病的潛在感染[3]?？墒菤⒕鷦┰谒系臍埩粑飳?duì)人體健康和環(huán)境有害[4],甚至致癌[5]。所以一些國(guó)家限制使用化學(xué)殺菌劑來(lái)控制采后腐爛,在美國(guó)、以色列和南非等國(guó),有少量使用熱處理保鮮的報(bào)道[6],但是單一的熱處理會(huì)加速果實(shí)的后熟和果皮失水皺縮,在我國(guó)冷鏈系統(tǒng)尚不健全的情況下,難以應(yīng)用。因此,研究和開(kāi)發(fā)新型環(huán)保型防腐保鮮產(chǎn)品,對(duì)于生產(chǎn)安全食品具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[7]。近年研究表明,植物精油抑菌是一種有效控制采后果實(shí)病害的無(wú)毒或低毒方法,Gong等[8]發(fā)現(xiàn)丁香酚與β環(huán)糊精結(jié)合成可食用涂膜可以有效控制荔枝采后的霜疫病;將丁香酚或百里香酚加入氣調(diào)包裝中,制得的活性包裝用以儲(chǔ)存葡萄,葡萄的儲(chǔ)存保鮮期可達(dá)56 d[9];楊波[10]發(fā)現(xiàn)用β環(huán)糊精包埋丁香、肉桂精油制成的抗菌小袋能有效控制芒果果實(shí)硬度和VC含量的下降及總糖含量的變化,延緩果實(shí)后熟衰老進(jìn)程;Liu等[11]的研究表明,用2～4 mg/L濃度的麝香草酚對(duì)杏和李子進(jìn)行熏蒸處理可顯著降低爛果率,而且對(duì)水果組織不產(chǎn)生任何影響。植物精油表現(xiàn)出的優(yōu)良抑菌活性和廣譜性,將有助于人們找到更為理想的天然防腐劑,這也符合人們追求“綠色健康”理念的需要。

目前,部分學(xué)者對(duì)測(cè)試精油用于控制芒果果實(shí)中的膠孢炭疽菌的篩選有所研究,但針對(duì)精油對(duì)于芒果炭疽菌作用機(jī)理和將精油實(shí)際應(yīng)用于芒果保鮮的研究較為空缺。本研究的目的是通過(guò)測(cè)試和比較肉桂醛、丁香酚、己醛、香芹酮、香葉醇、檸檬醛在體外抑制芒果膠孢炭疽菌生長(zhǎng)的效果,以半數(shù)抑制濃度(EC50)和最小抑菌濃度(MIC)等為指標(biāo)篩選出抑菌效果出色的天然植物精油種類,并對(duì)腐敗菌接觸精油后細(xì)胞的形態(tài)學(xué),細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露,細(xì)胞外pH、電導(dǎo)率、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和麥角甾醇等進(jìn)行測(cè)定,探究肉桂醛的抑菌機(jī)理;根據(jù)失重率、腐敗率、可溶性固形物和可滴定酸含量等,綜合評(píng)價(jià)含肉桂醛的可食用成膜劑的抑菌保鮮效果,為開(kāi)發(fā)綠色農(nóng)藥尋找理論和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果膠孢炭疽菌(ACCC36431) 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分離,中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)保藏并提供;芒果 品種為臺(tái)芒1號(hào),于2019年3月采摘于海南三亞梅山;肉桂醛 中國(guó)雙香助劑廠;丁香酚、檸檬醛、己醛、香芹酮、香葉醇、碘化丙啶(Propidium Iodide,PI) 北京百靈威科技有限公司;PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、酵母浸膏 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;果蠟 東莞市博誠(chéng)化工有限公司;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;微生物丙二醛(MDA)ELISA試劑盒、微生物麥角固醇ELISA試劑盒 上海通蔚生物科技有限公司。

M5全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀 美國(guó)Molecular Devices公司;UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;Axio Vert.A1倒置式材料金相顯微鏡 德國(guó)Carl Zeiss股份公司;ST-40R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;IRH-150F生化培養(yǎng)箱 中國(guó)上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HYL-A全溫?fù)u瓶柜 中國(guó)太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DELTA 320 pH計(jì) 德國(guó)梅特勒-托利多有限公司;ST3100C電導(dǎo)率測(cè)試儀 中國(guó)奧豪斯儀器(常州)有限公司;GY-B型硬度計(jì) 中國(guó)徐州淮博儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同精油處理 對(duì)C.gloeosporioides菌絲生長(zhǎng)的MIC、抑制率和EC50的測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]測(cè)定不同精油對(duì)C.gloeosporioides菌絲生長(zhǎng)的抑制作用[13]。將C.gloeosporioides接種在改良PDA培養(yǎng)基上[14],于 26 ℃培養(yǎng)72 h,用打孔器將其打成直徑約為 5 mm 的菌餅,接種于含不同梯度濃度精油的培養(yǎng)基平板中間,精油使用等體積乙醇溶液溶解[15],每組設(shè)置3次重復(fù),設(shè)含等量乙醇的空白培養(yǎng)基平板做對(duì)照。分別于26 ℃下黑暗培養(yǎng),3 d之后開(kāi)始每天觀察記錄菌絲生長(zhǎng)情況。各精油做相同重復(fù)試驗(yàn)。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,取其平均值。取與原接種菌餅相比,菌絲恰不生長(zhǎng)的濃度為MIC。按以下公式計(jì)算不同精油對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率[16]。

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)

將菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成抑制率值(Y),藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)(X),求出回歸方程 Y=aX+b[17],計(jì)算出相關(guān)系數(shù)(R2)和EC50。

1.2.2 不同濃度肉桂醛處理C.gloeosporioides的生理生化指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1C.gloeosporioides菌液制備 在改進(jìn)PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)C.gloeosporioides孢子,26 ℃,125 r/min搖床培養(yǎng)72 h,真空過(guò)濾收集菌絲體,使用生理鹽水抽洗3次洗去培養(yǎng)基,在每100 mL生理鹽水中加入0.5 g菌絲體,搖蕩使其懸浮。

1.2.2.2 肉桂醛對(duì)C.gloeosporioides細(xì)胞膜完整性的影響 使用熒光染色對(duì)菌絲細(xì)胞膜完整性進(jìn)行評(píng)價(jià)[18]:在1.2.2.1所述菌液中分別加入濃度為CK、EC50、1MIC和2MIC的肉桂醛,于26 ℃,125 r/min搖床培養(yǎng)培養(yǎng)2 h后吸出3 mL菌絲和培養(yǎng)液,4 ℃,5400 r/min離心10 min,棄上層培養(yǎng)基收集菌絲,再用生理鹽水洗兩次去除殘余培養(yǎng)基,每次洗3 min,后用20 μL PBS緩沖液重懸,加入預(yù)先混合好的碘化丙啶(PI)染色試劑,30 ℃下染色5 min。4 ℃,5400 r/min條件下再次離心5 min并用生理鹽水沖洗一次,吸取一滴菌液滴加在干凈載玻片上,蓋上蓋玻片于熒光顯微鏡下觀察。

圖1 不同精油對(duì)C. gloeosporioides的抑制效果(6 d)Fig.1 Inhibitory effect of different essential oils on growth of C. gloeosporioides(6 d)

1.2.2.3 核酸釋放量的測(cè)定 在1.2.2.1所述的菌液中分別加入濃度為CK、EC50和MIC的肉桂醛,以等體積無(wú)水乙醇助溶,26 ℃,125 r/min培養(yǎng) 0.0、15.0、30.0、60.0、90.0 min后取樣,12000 r/min離心2 min[19],取上清液于260 nm處測(cè)定吸光度為核酸釋放量。

1.2.2.4 細(xì)胞外電導(dǎo)率和pH測(cè)定 在1.2.2.1所述菌液中分別加入濃度為CK、EC50和MIC的肉桂醛,以等體積無(wú)水乙醇助溶,26 ℃,125 r/min培養(yǎng) 0.0、15.0、30.0、60.0、90.0 min后取樣,使用pH計(jì)和電導(dǎo)率測(cè)定儀[19]測(cè)定細(xì)胞外pH和電導(dǎo)率。

1.2.2.5 麥角固醇和MDA的測(cè)定 在1.2.2.1所述的菌液中分別加入濃度為CK、EC50和MIC的肉桂醛,以等體積無(wú)水乙醇助溶,26 ℃,125 r/min培養(yǎng)0.0、15.0、30.0、60.0、90.0 min后取樣,12000 r/min離心2 min[19],嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明,采用ELISA法測(cè)定上清液中麥角固醇和MDA的含量。

1.2.3 肉桂醛與果蠟復(fù)合溶液涂膜對(duì)芒果保鮮效果的測(cè)定 在采購(gòu)的芒果中挑選成熟度一致的個(gè)體,通過(guò)浸入1%次氯酸鈉溶液(V/V)中2 min對(duì)新鮮水果進(jìn)行表面滅菌[20],然后用蒸餾水洗滌。風(fēng)干后用槍頭刺破芒果赤道處表皮,接種含C.gloeosporioides孢子為105個(gè)/mL的生理鹽水10 μL后再次風(fēng)干,在溶有0 MIC、1 MIC或10 MIC肉桂醛的果蠟中浸潤(rùn)后,取出風(fēng)干成膜,每袋3枚芒果,設(shè)置無(wú)果蠟處理的空白對(duì)照,每?jī)商鞙y(cè)定果實(shí)的可溶性固形物、可滴定酸、硬度、病情指數(shù)和腐敗率。

1.2.3.1 果實(shí)可溶性固形物測(cè)定 參照NY/T 2637-2014中對(duì)折射儀測(cè)定水果中可溶性固形物含量的方法[21],采用手持糖度計(jì)測(cè)定,數(shù)值表示為20 ℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

1.2.3.2 果實(shí)可滴定酸測(cè)定 參照GB/T 12456-2008中對(duì)水果總可滴定酸測(cè)定方法的描述[22],取20.0 g芒果果肉和10 mL蒸餾水置于組織搗碎機(jī)中搗碎,13000 r/min離心15 min取上清液30 mL,加入3滴酚酞,用0.1 mol/L NaOH滴定至微紅,30 s不褪色,取3次平均值。

式中:A:消耗NaOH量(mL);C:稀釋總量100 mL;W:樣品重量20 g;D:測(cè)定取樣量30 mL;K:蘋果酸換算系數(shù)為0.067。

1.2.3.3 果實(shí)硬度的測(cè)定 參照NY/T 2009-2011中對(duì)水果硬度的測(cè)定要求[23],削去芒果果實(shí)赤道處的果皮,用GY-3硬度計(jì)測(cè)定其硬度,單位為0.1 MPa,每枚測(cè)定3 次取平均值。

1.2.3.4 人工接菌后果實(shí)病情指數(shù)和腐爛率統(tǒng)計(jì) 果實(shí)病情按果實(shí)表面的病斑大小分級(jí),其中0級(jí):表面無(wú)病斑;1級(jí):表面可見(jiàn)針頭大小的病斑;2級(jí):病斑面積不超過(guò)表面積的1/5;3級(jí):病斑面積占表面積的1/5～1/2;4級(jí):病斑面積超過(guò)表面積的1/2[24]。以沒(méi)有商品價(jià)值的2～4級(jí)果的百分率為果實(shí)腐爛率。

病情指數(shù)(%)=[∑(病級(jí)果數(shù)×該級(jí)代表數(shù)值)]/(調(diào)查總果數(shù)×最高級(jí)代表數(shù)值)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)試都設(shè)計(jì)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),所有參數(shù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析,使用SPSS(23版)統(tǒng)計(jì)軟件包分析平均值之間差異的顯著性。圖表由Origin Pro 8.0處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精油的抑菌效果測(cè)定

6種精油對(duì)C.gloeosporioides菌絲生長(zhǎng)的抑制效果結(jié)果如圖1所示,隨著濃度的增加,各精油的抑制效果均有所增加,且同一濃度的不同精油抑制效果明顯不同,說(shuō)明不同精油對(duì)C.gloeosporioides的抑制效果顯示較大差異。

測(cè)定其MIC,結(jié)果如表1所示。從表1中可看出,6種精油對(duì)C.gloeosporioides的菌絲生長(zhǎng)都表現(xiàn)出了一定的抑制作用,其中以肉桂醛和丁香酚的效果最好,MIC均低至0.4 μL/mL;其次檸檬醛的MIC為0.8 μL/mL,也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制效果;香芹酮和香葉醇的抑制效果相較于前三者來(lái)言較差,MIC高達(dá)1.6 μL/mL;抑制效果最差的精油為己醛,在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的濃度梯度下未測(cè)得MIC。

表1 不同精油對(duì)C. gloeosporioides的MICTable 1 MIC of different essential oils against C. gloeosporioides

注:香葉醇濃度為6、3、1.5、0.75、0.375、0.1875 μL/mL,大于1.5 μL/mL的濃度為陰性,為作圖方便近似取1.6 μL/mL。

以MIC篩選出肉桂醛、丁香酚、檸檬醛、香芹酮對(duì)C.gloeosporioides抑制效果比較理想,因此,進(jìn)一步測(cè)定了第6 d時(shí)不同質(zhì)量濃度下上述幾種精油對(duì)C.gloeosporioides的抑菌活性,結(jié)果見(jiàn)圖2,并建立其毒力回歸方程,計(jì)算EC50,結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 不同精油對(duì)C. gloeosporioides的抑制率(6 d)Fig.2 Inhibition rate of different essential oils against C. gloeosporioides(6 d)

表2 不同精油對(duì)C.gloeosporioides的毒力回歸方程及EC50Table 2 Virulence regression equation and EC50 of different essential oils against C.gloeosporioides

由表2所展示的EC50可知,對(duì)C.gloeosporioides抑制效果最強(qiáng)的為香芹酮,肉桂醛、丁香酚、檸檬醛和香葉醇次之。毒力回歸方程斜率的大小往往說(shuō)明目標(biāo)菌對(duì)供試精油敏感性的分布,即在EC50值相似情況下,若斜率不同,即在高或低劑量時(shí),抑制率會(huì)出現(xiàn)較大差異的現(xiàn)象[25]。因此,雖然4種精油的EC50相差不大,但是肉桂醛所展示出了較高的濃度敏感性和較低的MIC,可以認(rèn)為肉桂醛是6種供試精油中效果最好、最安全且最有可能廣泛應(yīng)用的精油品種。本研究中肉桂醛的EC50和MIC分別為0.234和0.4 μL/mL。這些結(jié)果與柳鳳等[26]、何衍彪等[27]描述肉桂醛抗菌活性的研究結(jié)果一致[25]。同時(shí)結(jié)合GB 2760-2014[28]中對(duì)肉桂醛使用量的要求,說(shuō)明肉桂醛是一種有前景的植物源殺真菌劑。

2.2 肉桂醛的抗真菌機(jī)理

2.2.1 肉桂醛對(duì)C.gloeosporioides細(xì)胞膜完整性的影響 如圖3所示,圖片清楚顯示,不同處理方式在C.gloeosporioides菌絲之間造成了明顯差異。經(jīng)PI染色后,對(duì)照菌絲幾乎不發(fā)出紅色熒光,而經(jīng)2 MIC肉桂醛處理后的C.gloeosporioides菌絲則呈現(xiàn)高強(qiáng)度的紅色熒光,這說(shuō)明肉桂醛處理后的C.gloeosporioides菌絲細(xì)胞膜的通透性明顯提高,表現(xiàn)出細(xì)胞死亡現(xiàn)象,且表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。證明較高濃度的肉桂醛可以明顯造成菌絲細(xì)胞膜的通透性的變化,繼而實(shí)現(xiàn)PI對(duì)核酸的結(jié)合。我們的結(jié)果與先前肉桂醛對(duì)黃曲霉菌的抑制機(jī)理的報(bào)道結(jié)果類似[29]。由此我們推測(cè)肉桂醛抑制C.gloeosporioides的潛在作用機(jī)制可能是通過(guò)改變其細(xì)胞膜的通透性造成細(xì)胞的死亡。

圖3 芒果炭疽菌PI菌絲染色Fig.3 PI hyphae staining of C. Gloeosporioides

2.2.2 肉桂醛對(duì)核酸釋放量的影響 菌絲在接觸肉桂醛后,細(xì)胞內(nèi)核酸的釋放明顯增加。在處理15 min后,EC50組的OD260值為0.369,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),但顯著低于MIC組(P<0.05),這說(shuō)明隨著肉桂醛濃度的升高,膜的破壞作用越明顯。用肉桂醛MIC和EC50處理的C.gloeosporioides懸浮液的OD260值在暴露15 min后保持平滑的上升趨勢(shì),但在60 min后略有下降,推測(cè)是長(zhǎng)時(shí)間處理使細(xì)胞某些酶泄露使核酸降解。

圖4 不同濃度肉桂醛對(duì)C. gloeosporioides培養(yǎng)液中OD260值的影響Fig.4 Effects of different concentrations of cinnamaldehyde on the absorbance at 260 nm culture solution of C. gloeosporioides

2.2.3 肉桂醛對(duì)細(xì)胞外電導(dǎo)率的影響 如圖5所示電導(dǎo)率隨著接觸時(shí)間的增加而增加。在接觸30 min時(shí),EC50組的電導(dǎo)率為172.90 μS/cm,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),但顯著低于MIC組(P<0.05)。肉桂醛MIC和EC50處理的C.gloeosporioides懸浮液的電導(dǎo)率值在暴露15 min后保持平滑的上升趨勢(shì),并在60 min時(shí)達(dá)到頂峰,EC50和MIC組的電導(dǎo)率分別為189.80和193.27 μS/cm,但在60 min后略有下降,這與OD260的測(cè)定結(jié)果相似,推測(cè)是長(zhǎng)時(shí)間處理使細(xì)胞某些脂類物質(zhì)泄漏,與液體中的部分離子結(jié)合,造成電導(dǎo)率的下降。

圖5 不同濃度肉桂醛對(duì)C. gloeosporioides培養(yǎng)液中電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of cinnamaldehyde on the conductivity of culture solution of C. gloeosporioides

2.2.4 肉桂醛對(duì)細(xì)胞外pH的影響 加入肉桂醛后,細(xì)胞外pH急劇下降。這可能是由于肉桂醛較活潑,易在實(shí)驗(yàn)時(shí)被空氣氧化為肉桂酸,故而引起細(xì)胞外pH的明顯下降,顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。在15～30 min后,肉桂醛溶解和氧化已達(dá)到平衡,此后階段pH的上升,反映的是胞內(nèi)堿性物質(zhì)外漏導(dǎo)致的pH上升,所以肉桂醛處理菌絲體后,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)堿性物質(zhì)的外漏使得胞外pH呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì),雖然對(duì)照組的細(xì)胞外pH也呈現(xiàn)一定的上升情況,但MIC組的斜率明顯高于對(duì)照組。

圖6 不同濃度肉桂醛對(duì)C.gloeosporioides培養(yǎng)液中pH的影響Fig.6 Effects of different concentrations of cinnamaldehyde on the pH of culture solution of C.gloeosporioides

2.2.5 肉桂醛對(duì)麥角甾醇含量的影響 細(xì)胞膜的主要成分為脂質(zhì),細(xì)胞外脂質(zhì)含量的增高通常表明膜穩(wěn)定性降低,麥角甾醇作為真菌特有的主要甾醇成分,負(fù)責(zé)維持細(xì)胞的功能和完整性。由圖7可知,經(jīng)過(guò)肉桂醛處理后,培養(yǎng)液中的麥角甾醇含量明顯持續(xù)增加,在0～90 min持續(xù)增加,而未經(jīng)處理的細(xì)胞含量雖有小幅波動(dòng),但總體保持穩(wěn)定。在處理15 min后,EC50組(221.56 ng/L)和MIC(235.61 ng/L)培養(yǎng)液中的麥角甾醇含量顯著高于對(duì)照(170.94 ng/L)(P<0.05),隨著暴露時(shí)間的增加,差距一直顯著(P<0.05)。說(shuō)明細(xì)胞膜上的甾醇很可能被反應(yīng)而解離,由此造成細(xì)胞膜通透性的增強(qiáng);且麥角甾醇含量上升斜率隨時(shí)間有減小的趨勢(shì),說(shuō)明肉桂醛和某些破壞正常甾醇生物合成途徑的殺菌劑,例如抑霉唑、噻苯達(dá)唑、嘧霉胺等可能有同樣的作用途徑[19]。但是EC50組和MIC組的麥角甾醇含量沒(méi)有顯著差異(P>0.05),沒(méi)有表現(xiàn)出濃度依賴性,推測(cè)是因?yàn)镋C50和MIC的濃度差距不顯著導(dǎo)致。

圖7 不同濃度肉桂醛對(duì)C. gloeosporioides培養(yǎng)液中麥角甾醇含量的影響Fig.7 Effects of different concentrations of cinnamaldehyde on the ergosterol content of culture solution of C. gloeosporioides

2.2.6 肉桂醛對(duì)MDA含量的影響 MDA作為一種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物,其含量往往可以反映生物脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,間接反映出細(xì)胞膜損傷的程度。由圖8可知,經(jīng)過(guò)肉桂醛處理后,培養(yǎng)液中的MDA含量顯著增加(P<0.05),在0～90 min呈現(xiàn)一定的上升趨勢(shì),而在對(duì)照組中呈現(xiàn)總體保持穩(wěn)定和小幅下降趨勢(shì)。在處理15 min時(shí),EC50(4.29 nmol/L)組和MIC(4.34 nmol/L)培養(yǎng)液中的MDA含量顯著高于對(duì)照(3.07 nmol/L)(P<0.05),隨著暴露時(shí)間的增加,差異一直顯著(P<0.05)。表明在細(xì)胞膜上發(fā)生了脂質(zhì)的過(guò)氧化的反應(yīng)。結(jié)合先前發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中麥角甾醇含量的上升,說(shuō)明肉桂醛與細(xì)胞膜的作用機(jī)理可能是引發(fā)膜上脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)而導(dǎo)致膜損傷。但是EC50組和MIC組的MDA含量沒(méi)有顯著差異(P>0.05),沒(méi)有表現(xiàn)出濃度依賴性,與麥角甾醇情況類似,推測(cè)是因?yàn)镋C50和MIC的濃度差距不顯著導(dǎo)致。

圖8 不同濃度肉桂醛對(duì)C. gloeosporioides培養(yǎng)液中MDA含量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of cinnamaldehyde on the MDA content of culture solution of C. gloeosporioides

2.3 肉桂醛-果蠟復(fù)合涂膜對(duì)芒果果實(shí)保鮮效果的影響

2.3.1 對(duì)芒果可溶性固形物的影響 不同濃度肉桂醛-果蠟復(fù)合涂膜對(duì)芒果果實(shí)的可溶性固形物的影響如圖9所示,3個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組和空白對(duì)照組的可溶性固形物含量呈波動(dòng)下降趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)前期(0～6 d),4組芒果可溶性固形物含量均呈下降趨勢(shì);第6 d之后,CK和1 MIC組可溶性固形物含量有所上升,且差異不顯著(P>0.05)。可能是芒果貯藏期內(nèi)其果實(shí)的淀粉等多糖類物質(zhì)在代謝過(guò)程中轉(zhuǎn)化為可溶性低聚糖,原果膠轉(zhuǎn)化為可溶性果膠,從而使可溶性固形物含量升高;而在實(shí)驗(yàn)后期,1 MIC和10 MIC組可溶性固形物含量有所上升,差異同樣不顯著(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)CK、0 MIC、1 MIC和10 MIC組的可溶性固形物含量分別為11.7%、11.67%、12.93%和12.23%,且各組間均差異不顯著(P>0.05)。表明芒果貯藏過(guò)程中肉桂醛和果蠟處理的濃度對(duì)可溶性固形物含量影響不大,保持了芒果正常的甜度變化。

圖9 不同處理對(duì)芒果可溶性固形物含量的影響Fig.9 Total soluble solid content of mango inoculated with C. Gloeosporioides under different treatment

2.3.2 對(duì)芒果可滴定酸的影響 從圖10可知,芒果中可滴定酸隨時(shí)間先下降后輕微上升,其中10 MIC和1 MIC相較于0 MIC和對(duì)照組先開(kāi)始上升。在第4 d后,對(duì)照組可滴定酸含量和涂膜組實(shí)在保持較顯著差異(P<0.05)。在第10 d后,10 MIC組的可滴定酸含量還維持在0.2%以上的水平,且與其余實(shí)驗(yàn)組有顯著性差異(P<0.05)。

圖10 不同處理對(duì)芒果可滴定酸的影響Fig.10 Titratable acid content of mangoes under different treatment

2.3.3 對(duì)芒果硬度的影響 由圖11可知,芒果硬度隨貯藏時(shí)間的變化呈現(xiàn)先下降后上升,最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。對(duì)照組在貯藏第6 d時(shí),與其余實(shí)驗(yàn)組相比,硬度下降的程度達(dá)到了顯著差異水平(P<0.05),即0.609 kg/cm2;而實(shí)驗(yàn)組間在前6 d時(shí)硬度下降沒(méi)有顯著差異。從整個(gè)貯藏階段來(lái)看,3個(gè)涂膜組的硬度總體比對(duì)照組的要大,尤其是10 MIC組,其變化情況比其他組較平緩,并在12 d后,與其他實(shí)驗(yàn)組相比仍保持較高硬度(P<0.05)。結(jié)合上節(jié)對(duì)可滴定酸的測(cè)定,10 MIC處理組與對(duì)照組相比,可以保持芒果較高的硬度和酸度(P<0.05),同時(shí)實(shí)驗(yàn)組間表現(xiàn)出來(lái)一定的濃度依賴性。

圖11 不同處理對(duì)芒果硬度的影響Fig.11 Hardness of mangoes under different treatment

2.3.4 對(duì)芒果病情指數(shù)的影響 由病情指數(shù)評(píng)價(jià)芒果病變情況,由圖12可知,實(shí)驗(yàn)組一定程度上延緩了病情指數(shù)的上升,對(duì)照組和0 MIC組貯藏6 d病變指數(shù)為50,而添加肉桂醛的1 MIC和10 MIC均保持較低水平(P<0.05)。第6 d后,對(duì)照組的的病情指數(shù)保持平穩(wěn),而3組涂膜處理的芒果均產(chǎn)生明顯上升,在第12 d后,0 MIC和1 MIC組的病情指數(shù)達(dá)到66.7和50,10 MIC組也在第14 d達(dá)到66.7。

圖12 不同處理對(duì)芒果病情指數(shù)的影響Fig.12 Condition index of mangoes under different treatment

2.3.5 對(duì)芒果腐敗率的影響 由圖13可知,對(duì)比空白對(duì)照組,處理組的芒果有效延緩腐敗。在第4 d時(shí),空白組有33.3%的芒果發(fā)生腐敗,而涂膜處理的芒果仍保持較高的品質(zhì)(P<0.05);在第6 d時(shí),對(duì)照組芒果全部腐敗,而涂膜處理組仍保持較低腐敗率(P<0.05);第8 d后,0、1、10 MIC的腐敗情況出現(xiàn)肉桂醛濃度依賴現(xiàn)象,1 MIC組的腐敗率為66.67%,顯著低于10 MIC組(0%)且顯著高于0 MIC組(P<0.05)。最后所有實(shí)驗(yàn)組芒果在第14 d腐敗完全,失去可食用性,如圖14所示,且相比空白組在第6 d已經(jīng)失去可食用性,10 MIC處理組將果實(shí)貨架期顯著延長(zhǎng)一倍以上。

圖13 不同處理對(duì)腐敗率的影響Fig.13 Rate of corruption of mangoes under different treatment

圖14 不同處理對(duì)芒果腐敗的抑制情況Fig.14 Corruption inhibition of mangoes under different treatment

但是另外重要的一點(diǎn)是,由圖14可以看出,在前期(6 d左右)肉桂醛的確可以抑制C.gloeosporioides在芒果表面的生長(zhǎng)從而抑制腐敗,可是在貯藏后期,肉桂醛和果蠟處理組的芒果表面出現(xiàn)大量的黑斑,但是所接種的C.gloeosporioides并沒(méi)有生長(zhǎng),而空白組并沒(méi)有出現(xiàn)類似的黑斑。推測(cè)可能是由于涂層對(duì)于芒果表面呼吸和水分散失的阻礙,導(dǎo)致芒果內(nèi)部代謝的有毒物質(zhì)積累,造成芒果外部感官品質(zhì)的下降,阻礙了更長(zhǎng)貨架期的實(shí)現(xiàn)[30]。以上結(jié)果證明雖然肉桂醛對(duì)C.gloeosporioides的抑制效果明顯,但是具體的應(yīng)用方式還需更細(xì)致的實(shí)驗(yàn)確定。

3 結(jié)論

在供試的幾種精油中,肉桂醛對(duì)芒果膠孢炭疽菌表現(xiàn)出了最強(qiáng)烈的抗菌活性,EC50和MIC值分別為0.234和0.4 μL/mL,其抗菌活性可以歸因于造成細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)的氧化,導(dǎo)致膜完整性和膜滲透性的破壞,繼而引發(fā)細(xì)胞破裂和死亡。將肉桂醛與果蠟復(fù)合處理可以顯著降低芒果常溫貯藏時(shí)的腐敗率,同時(shí)對(duì)果實(shí)品質(zhì)影響較小,甚至可能誘導(dǎo)了芒果的某些防御反應(yīng),增強(qiáng)其抑菌防腐性能。肉桂醛作為植物的天然代謝產(chǎn)物,其具有對(duì)真菌的良好的抑制特性和對(duì)人體無(wú)毒或低毒的特點(diǎn),有著良好的應(yīng)用前景。