(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

高血壓作為常見的心血管疾病之一,它具有患病率高、易引起并發(fā)癥等特點,是導(dǎo)致中風(fēng)、冠心病的罪魁禍?zhǔn)?是人類健康隱形的殺手[1-2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)[3]是作為一種獨特的用于治療該類疾病的藥物,得到了廣泛的關(guān)注和研究。因此,開發(fā)新的ACEI是降壓藥物的研究熱點。

隨著人們對于治療藥物安全性、有效性和適用性要求的逐步提高,研究人員轉(zhuǎn)而從人們?nèi)粘Ｉ羁山佑|到的、同時具有食用和藥用價值的中草藥、營養(yǎng)類成分等著手,來研究更高療效、更好耐受性的ACEI藥物。乳和乳制品是人類最好的食源蛋白質(zhì),不僅含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),還富含具有重要的生理功能生物活性肽類,其中,多種具有ACEI活性的乳蛋白多肽被發(fā)現(xiàn)[4]。中藥材是中華文明的寶貴資源庫,幾千年的經(jīng)驗積累,篩選出大量具有ACEI效應(yīng)的藥食同源藥材,這些材料具有安全性高、副作用小等顯著特點,有效開發(fā)利用意義重大[5]。目前,關(guān)于乳制品和中草藥配伍的研究不是很多,因此,研究這樣一款輔助降壓功效的牛奶具有重要的現(xiàn)實意義。

本試驗以脫脂乳和藥食同源中草藥為材料,以ACE為靶標(biāo),研究確定脫脂乳酶解處理的最佳工藝參數(shù),篩選出具有較高ACEI活性的藥食同源中草藥。在此基礎(chǔ)上,研究脫脂乳酶解液和中草藥浸提物的最佳配比,完成一款具有輔助降壓功效的功能性牛奶的實驗室研究,為商業(yè)開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂奶粉 新西蘭恒天然出品;胰蛋白酶(酶活力為≥2500.0 U/mg);ACE(0.1U/mL) 美國Sigma公司;馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-his-leu,HHL) 美國Sigma公司;馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純;15味試驗藥材(山楂、決明子、枸杞、桔梗、白芍、黃芪、銀杏葉、梔子、牡丹皮、玉竹、人參、佛手、桑葉、菊花、山藥) 合肥為民大藥房。

PE-Lambda紫外分光光度計 珀金埃爾默股份有限公司;高速冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司;STARTER2100 pH計 美國奧斯豪儀器有限公司;FLUKO弗魯克高剪切分散機 上海弗魯克流體機械制造有限公司;CX-100型粉碎機 上海市晟喜制藥機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂乳酶解工藝 將脫脂乳配制成具有一定底物濃度的溶液,調(diào)整溫度和pH至胰蛋白酶的最適反應(yīng)條件,加入胰蛋白酶,采用pH-stat法[6]使pH控制在pH±0.05之間,結(jié)束反應(yīng)后,沸水浴滅酶10 min并迅速冷卻,用1 mol/L HCl調(diào)pH至7.0,8000 r/min冷凍(4 ℃)離心30 min,上清液冷凍干燥后備用[6]。

1.2.2 酶解優(yōu)化的單因素實驗

1.2.2.1 底物質(zhì)量濃度對ACE抑制活性的影響 底物質(zhì)量濃度分別為3、4、5、6、7、8 g/100 mL,加酶量4%(酶與底物質(zhì)量分數(shù)比)、pH7.0、溫度40 ℃酶解3 h,測定ACE抑制率。

1.2.2.2 加酶量對ACE抑制活性的影響 加酶量分別為1%、2%、3%、4%、5%,底物濃度為6 g/100 mL、pH7.0、40 ℃條件下反應(yīng)3 h,測定ACE抑制率。

1.2.2.3 pH對ACE抑制活性的影響 pH分別為5、6、7、8、9,底物質(zhì)量濃度為6 g/mL、加酶量4%、溫度40 ℃酶解3 h,測定ACE抑制率。

1.2.2.4 酶解時間對ACE抑制活性的影響 酶解時間分別為2、4、6、8、10 h,底物質(zhì)量濃度為6 g/mL、加酶量4%、pH7.0、酶解溫度40 ℃,測定ACE抑制率。

1.2.2.5 酶解溫度對ACE抑制活性的影響 酶解溫度分別為15、25、35、45、55 ℃,底物質(zhì)量濃度為6 g/mL、加酶量4%、pH7.0、酶解3 h,測定ACE抑制率。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 利用單因素試驗的水平范圍,根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理[7],以ACE抑制率為響應(yīng)值,設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗(參見表1)。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken test design

1.2.4 ACE抑制率的測定 根據(jù)Nakamura等[8-9]方式測定ACE抑制率,所需藥品以及具體步驟見表2。

表2 ACE抑制活性體外檢測方法(μL)Table 2 In vitro determination of ACE inhibitory activity(μL)

按照表2將試劑按順序加到試管中混勻,于37 ℃水浴中反應(yīng)1h后加入1 mol/L HCl溶液100 μL終止反應(yīng);然后取1.2 mL乙酸乙酯于各試管旋渦萃取后進行離心(4000 r/min,10 min);然后吸取750 μL乙酸乙酯層移于已標(biāo)號的試管中,在沸水浴中揮發(fā)完全后加入去離子水3 mL,充分溶解在228 nm下測定其吸光值,計算公式如下:

式中:Ab:加入緩沖液的樣品光密度值;Aa:加入抑制劑的樣品光密度值;Ac:反應(yīng)前樣品滅酶的光密度值。

1.2.5 中草藥的篩選 結(jié)合中醫(yī)對高血壓病癥的治療以及目前中藥治療高血壓的研究資料[10],選擇山楂、決明子、枸杞等15味中草藥進行ACE抑制活性篩選試驗研究。

1.2.5.1 單一中草藥提取液的制備及ACE抑制活性測定 15種中藥材粉碎,過100目篩后浸提處理。采用超聲波輔助浸提法,去離子水為提取液,液料比為15∶1,50 ℃超聲輔助浸提60 min,過濾,得中藥提取液[11]。用pH=8.3的硼酸緩沖液配成濃度為20.0 mg/mL的溶液,采用紫外分光光度計法檢測提取液的ACE抑制活性,設(shè)3次重復(fù)[8-9]。

1.2.5.2 混合中草藥提取液的制備 按1.2.5.1方法制備中草藥提取液,將兩種ACE抑制活性較高的中草藥按4∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、0∶4比例進行混合得混合中草藥提取液。用pH=8.3的硼酸緩沖液配成濃度為20.0 mg/mL的溶液,采用紫外分光光度計法檢測提取液的ACE抑制活性,設(shè)3次重復(fù)[9-10]。

1.2.6 酶解液和中草藥提取液的配比研究 將酶解液和已確定的最佳中草藥按4∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、0∶4比例進行混合,測定ACE抑制活性,確定最佳配比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 7.0.0軟件對響應(yīng)面結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 底物質(zhì)量濃度對酶解液ACE抑制率的影響 由圖1可知,ACE抑制率隨著底物(脫脂乳)質(zhì)量濃度的增加,先升高,后降低,在6 g/100 mL時達到最大58.08%。反應(yīng)液中底物的濃度小,與酶結(jié)合的量就小,反應(yīng)效率低,抑制作用不明顯;但是增加底物量到達臨界值后全部的酶都被結(jié)合,抑制作用達到最大,之后抑制率開始下降。

圖1 底物質(zhì)量濃度對ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity

2.1.2 加酶量對酶解液ACE抑制率的影響 由圖2可知,ACE抑制率隨著加酶量的增加,先升高,后降低。當(dāng)加酶量為4%,ACE抑制率最高,最大為56.44%,加酶量繼續(xù)增加,ACE抑制率下降。分析原因可能是,當(dāng)反應(yīng)液中酶含量低,濃度小時,與其結(jié)合的底物也相應(yīng)較少,催化分解作用慢;但當(dāng)酶的濃度增大后,相應(yīng)結(jié)合更多的底物,出現(xiàn)過度酶解的現(xiàn)象,從而降低對 ACE的抑制性[12]。此外,實際生產(chǎn)中一般加入較低濃度的酶,節(jié)約成本。

圖2 加酶量對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on ACE inhibitory activity

2.1.3 pH對酶解液ACE抑制率的影響 由圖3可知,ACE抑制率隨著pH的增加,先升高,后降低。當(dāng)pH=7時,ACE抑制率最高為56.86%,分析原因可能是,當(dāng)pH過大或過小時,都會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),影響酶催化反應(yīng)的發(fā)生。

圖3 pH對ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on ACE inhibitory activity

2.1.4 酶解時間對酶解液ACE抑制率的影響 由圖4可知,2～6 h內(nèi),增加反應(yīng)時間,抑制作用也持續(xù)增大,但從6～10 h卻有所下降。酶催化反應(yīng)發(fā)生6 h后,抑制活性下降可能是由于ACE抑制肽同樣是由氨基酸按不同序列排列成的肽類成分,在酶的催化作用下,降解成其他的肽類片段或者游離性氨基酸,而失去抑制活性。據(jù)文獻Mullally等[13]報道發(fā)現(xiàn),ACE對底物的抑制作用也與酶催化時間有關(guān),隨著反應(yīng)時間延長,酶被分解,造成了抑制活性的降低。此結(jié)論與文獻報道一致。最終確定最適酶解時間為6 h。

圖4 酶解時間對ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on ACE inhibitory activity

圖5 酶解溫度對ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity

表3 Box-Behnken試驗結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental results

表4 響應(yīng)面試驗方差分析表Table 4 Analysis of variance table of the response surface methodology

注:***差異極顯著(P<0.001);**差異高度顯著(P<0.01);*差異顯著(P<0. 05)。2.1.5 酶解溫度對酶解液中ACE抑制率的影響 由圖5可知,ACE抑制率隨著溫度的升高,先增大,后減小。酶解溫度的升高加速酶解反應(yīng)的進程,在35 ℃左右達到最大值;當(dāng)溫度高于35 ℃時,蛋白酶的活性降低導(dǎo)致反應(yīng)減緩,ACE抑制率有所降低。因此選擇35 ℃為響應(yīng)面溫度因素的中心值。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化胰蛋白酶酶解脫脂乳工藝參數(shù)

2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 胰蛋白酶酶解脫脂乳獲得高ACE抑制率的活性肽的工藝參數(shù)響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果參見表3。通過Design Expert 7.0.0軟件對表3數(shù)據(jù)進行分析,結(jié)果見表4。

根據(jù)表4分析得到回歸方程:ACE抑制率(%)=54.87+0.81A+1.68B+1.53C+4.63D-3.02AC+1.51AD-2.23BC-2.43BD+3.61CD-4.18A2-3.5B2-1.89C2-4.12D2。

從表4分析可得出ACE抑制率回歸方程中的總回歸項是極顯著的(P<0.001),這表明ACE抑制率方程擬合度較好,試驗的可信度和準(zhǔn)確度很高;而失擬項不顯著則說明試驗的誤差小。

結(jié)果表明:實驗因素和響應(yīng)值的之間不是一次線性關(guān)系,各因素之間有較強的交互作用。通過模型優(yōu)化得出酶解脫脂乳的最優(yōu)條件為:底物質(zhì)量濃度7 g/100 mL、加酶量 5%、酶解溫度30.74 ℃、pH6.92,此條件下ACE抑制率為59.29%。

2.4.2 酶解工藝條件的驗證實驗 為檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性,采用上述優(yōu)化條件進行降血壓肽的制備,考慮到實際操作的方便,將參數(shù)修正為底物質(zhì)量濃度7 g/100 mL、加酶量5%、酶解溫度為31 ℃、pH為6.9,ACE抑制率為58.51%,相對誤差在1.31%左右。因此,響應(yīng)面法對優(yōu)化酶解條件參數(shù)具有指導(dǎo)意義。

2.5 最佳中草藥的選擇

2.5.1 單一中草藥的ACE抑制活性 不同中草藥對酶解液ACE抑制率之間的影響如圖6所示。

圖6 不同中藥的影響Fig.6 Effect of different Chinese medicine

由圖6可知,不同中藥的ACE抑制活性是有差異的,活性大小排序為:山楂>決明子>枸杞>桔梗>白芍>黃芪>銀杏葉>梔子>牡丹皮>玉竹>人參>佛手>桑葉>菊花>山藥;山楂和決明子的ACE抑制活性最高,分別為50.88%、45.34%。

山楂的主要成分是黃酮類成分,其對血壓的影響機制是通過擴張冠狀血脈,舒張血管,產(chǎn)生降壓作用[14]。陳佩瑤等[15]研究了決明子蛋白質(zhì)、低聚糖和蒽醌苷等,均有明顯的降壓作用,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義,與利血平組降壓作用相當(dāng)。給藥結(jié)束后10 d,決明子低聚糖給藥組的大鼠血壓明顯降低,決明子蒽醌苷降壓作用更明顯,而復(fù)方利血平和決明子蛋白質(zhì)的降壓作用不明顯。

2.5.2 混合中草藥的ACE抑制活性 山楂提取液和決明子提取液不同配比對ACE抑制活性的影響見圖7。

圖7 山楂和決明子的配比對ACE抑制率的影響Fig.7 Effect of proportion of hawthorn and semen cassiae on ACE inhibitory activity

由圖7可知,山楂提取液和決明子提取液配比不同時,ACE抑制活性也不同[16],當(dāng)山楂提取液和決明子提取液為2∶1時,ACE抑制率較高為52.52%。

2.6 酶解液和中草藥提取液的配比研究

酶解液和中草藥提取液(山楂∶決明子為2∶1)的配比對ACE抑制率的影響見圖8。

圖8 酶解液和中藥提取液的配比對ACE抑制率的影響Fig.8 Effect of proportion of enzymatic hydrolysate and extraction solution of Chinese traditional medicine on ACE inhibitory activity

由圖8可知,當(dāng)酶解液和中藥提取液配比不同時,ACE抑制活性也不同,當(dāng)酶解液:中藥提取液為1∶1時,ACE抑制率較高為59.09%。復(fù)方中藥配伍酶解液對ACE抑制活性具有明顯影響,其可能是通過多種靶點,多種途徑共同實現(xiàn)[17]。酶解液配合中草藥復(fù)方可以為尋找安全的降壓藥物提供參考,但兩者配伍用藥的共同作用機制,有待進一步研究。

3 結(jié)論

本實驗研究的胰蛋白酶酶解脫脂乳的最佳工藝參數(shù)為:底物質(zhì)量濃度7 g/100 mL、酶解時間6 h、加酶量 5%、酶解溫度31 ℃、pH6.9,所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高,為58.51%。同時,以ACE抑制率為指標(biāo),從15味藥食同源的中草藥中篩選出ACE抑制活性較高的山楂和決明子兩位中草藥。

實驗表明,山楂和決明子提取液復(fù)配時ACE抑制活性較高,且山楂和決明子提取液按2∶1復(fù)配時,ACE抑制活性較高,為52.52%。脫脂乳胰蛋白酶酶解液和山楂與決明子中藥提取液按1∶1復(fù)配時,ACE抑制率可達59.09%,ACE抑制活性稍有改善。

將具有調(diào)節(jié)血壓效應(yīng)的藥食同源中草藥配伍牛奶蛋白酶解液,對設(shè)計一款具有輔助調(diào)節(jié)血壓效應(yīng)的保健功能性乳制品提供參考價值,對研究食療保健和乳制品的功能性具有理論和實踐探討意義。