,2,2,*

(1.華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東省功能食品活性物重點實驗室,華南農業(yè)大學,廣東廣州 510642)

茶葉是世界上三大無酒精飲料之一,富含茶多酚、生物堿、茶氨酸等多種功能活性物質[1]。茶多酚作為茶葉重要的功能物質組成,占茶葉干重的18%～36%,而其主要組分兒茶素(catechins)占到茶多酚總量的60%～80%[2]。茶葉中的兒茶素主要由表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)等單體組成,具有降血壓[3]、減肥[4]、預防糖尿病、心血管疾病及癌癥等多種功效[5]。目前,茶葉中兒茶素生物合成途徑已基本探明,其主要由類黃酮代謝途徑,在系列合成酶的催化下合成。其中,查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)被認為是該代謝途徑的首個限速酶,具有催化香豆酰-CoA和丙二酰-CoA轉變成查爾酮的功能,在兒茶素的合成中占有重要地位[6-7]。

酶是基因表達的產物,CHS基因由Reimold等[8]1983年首次從歐芹中獲得克隆,隨后相繼在金銀花、苦蕎、水仙等植物中分離得到。海棠花和矮牽牛中CHS基因表達分別與花色苷和花青素含量有關[9-10],而擬南芥[11]中研究發(fā)現(xiàn)CHS基因的表達水平與其類黃酮含量呈正相關,其表達的蛋白定位于內質網和液泡中。茶樹CHS基因的研究始于1994年Takeuchi等[12]的報道。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),茶樹不同生長時期[13]、不同品種[14],其體內的CHS基因表達量均存在差異。CHS基因轉錄水平與代謝物花青素[15]和兒茶素[16]積累具有正向調控的功能已得到證實,并有研究推測CHS基因在茶樹生長中發(fā)揮重要作用[17],其編碼的蛋白亞細胞定位于細胞質中[18]。CHS基因作為植物類黃酮物質合成居于通路上游的限速酶基因,其表達水平對植物表型及代謝產物積累影響備受關注。迄今為止,茶葉中涉及CHS基因與茶葉代謝物的研究雖較多,但對CHS基因的表達研究均停留在轉錄水平,其在茶樹體內的蛋白表達情況尚未揭示,尤其CHS基因在轉錄、翻譯兩層次的基因表達水平與茶葉兒茶素積累的關系還未見報道。

為揭示茶葉兒茶素積累與CHS基因表達特性的關系,本研究選取具有差異兒茶素代謝的英紅9號和南昆山毛葉茶為實驗對象,HPLC法測定兒茶素含量,克隆對應茶葉中的CHS基因,并對其體內表達蛋白進行亞細胞定位,經序列分析選取基因特異肽段人工合成,并用作抗原免疫兔子制備CHS基因特異抗體。結合qRT-PCR、Western雜交技術,分析茶葉中差異兒茶素代謝與兒茶素合成關鍵酶基因CHS從轉錄到翻譯水平的關系,進一步揭示了茶葉兒茶素合成代謝的分子機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

英紅9號品種和南昆山毛葉茶春季1芽2葉嫩稍 分別采于華南農業(yè)大學園藝學院和廣東省龍門縣南昆山鎮(zhèn);反轉錄試劑盒(編號:6210A)、pMD18-T載體、T4-DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶 寶日醫(yī)生物技術有限公司;質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒 天根生化科技有限公司;All-In-One DNA/RNA提取試劑盒(編號:B618203) 生工生物工程股份有限公司;KLH、Sulfolink Resin 美國Pierce公司;兒茶素標準品、福氏完全佐劑 Sigma公司;PCR引物合成、DNA測序 天一輝遠生物技術有限公司;其它化學試劑 均為國產分析純。

Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱、Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng) 美國Agilent公司;PCR儀 Eppendorf公司;電泳儀 北京百晶生物技術有限公司;凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad公司;StepOne型熒光定量PCR儀 美國ABI公司;激光共聚焦 美國PERKINELMER公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兒茶素含量測定 茶鮮葉兒茶素的提取參考GB/T 8313-2008兒茶素提取方法。稱取0.2 g均勻研磨的茶鮮葉于10 mL的離心管中,加入在70 ℃中預熱的75%甲醇溶液5 mL,用玻璃棒充分攪拌濕潤,立即移入70 ℃水浴中,浸提10 min,浸提后冷卻至室溫,轉入離心機在3500 r/min轉速下離心10 min,將上清液轉入10 mL的容量瓶中。殘渣再用5 mL的75%甲醇提一次,重復以上操作。合并提取液至10 mL容量瓶中,搖勻后過膜待用[19]。兒茶素測定采用Agilent 1200高效液相色譜儀,利用Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)進行分離,柱溫度40 ℃,流速為1.0 mL/min,檢測波長為280 nm,進樣量為10 μL。流動相A為0.05%三氟乙酸,B為100%乙腈,進行線性梯度洗脫(0～5 min,95%～92% A;5～25 min,92%～89.5% A;25～45 min,89.5%～78% A)。采用安捷倫化學工作站(B.04.02)對原始信號自動積分,采用外標法計算各組分含量。

1.2.2 目的基因擴增 茶鮮葉總RNA提取采用上海生工All-In-One DNA/RNA小量提取試劑盒進行。以提取的RNA為模板,按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。根據GenBank中已登錄茶樹CsCHS基因(KY615681)全長信息,設計特異引物對:5′-ATGGTCACCGTCGAGGACATC-3′ 和5′-TTATGTAGACAAGCTATGGAGCACCACAG-3′。PCR體系為:1 μL cDNA,3 μL 10×Taq Buffer,3 μL dNTPs(2.5 mmol/L),上下游引物各1 μL(10 μmol/L)和 0.5 μL(5 U/μL)La Taq 酶,加去離子水補足至30 μL。反應條件為:94 ℃預變性1 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,共32個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。目的條帶切膠回收后連接至pMD-18T,并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài),經鑒定的陽性菌落送交公司測序。

1.2.3 CHS蛋白亞細胞定位

1.2.3.1 亞細胞定位載體的構建 根據已克隆得到的CHS基因ORF序列,設計如下帶酶切位點的特異引物對:5′-GAGAACACGGGGGACTGGTACCCGGGGATCCATGGTCACTGTCGAGGATGTTTG-3′(BamHI),5′-ACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGTCGACAG TGCACAAACTGTGGAGC-3′(SalI),PCR擴增目的序列。將擴增產物與提取的pC1301-GFP質粒分別經BamHI和SalI雙酶切后,回收各目的片段,混合后用T4-DNA連接酶連接并轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)。陽性克隆經菌落PCR、酶切分析后進行測序鑒定,獲得pC1301-GFP/CHS融合表達載體[20]。

1.2.3.2 農桿菌介導轉化煙草葉片 將構建好的定位載體質粒pC1301-GFP/CHS,電擊轉化到農桿菌EHA105中,28 ℃培養(yǎng)至OD600為0.3,用等體積的Buffer(含10 mmol/L MES,200 μmol/L Acetosyringone和10 mmol/L MgCl2)懸浮,并室溫靜置4～6 h,并將農桿菌菌液由下表皮注射到4周大的本式煙草葉片中,經培養(yǎng)4～6 d,用激光共聚焦顯微鏡直接觀察葉片的熒光情況,以pC1301-GFP空載體作對照[21]。

1.2.4CHS基因轉錄水平測定 根據克隆所得CHS序列設計特異引物對:5′-RCTWGATGCTA GGCARGACA-3′和5′-TTGATTGTCGGCTTGATTACC-3′。根據GenBank中茶樹的GAPDH基因全長信息設計特異內參引物對:5′-TTGGCATCGTTG AGGGTCT-3′和5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′。以反轉錄cDNA為模板,反應體系為:cDNA 2 μL,SybrGreen qPCR Master Mix(2×)10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。反應條件為:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共計40個循環(huán)。使用2-ΔΔCT法計算CHS基因相對表達量,對照(MY)中CHS基因的相對表達量為1,每個實驗設3重復[22]。

1.2.5 CHS抗體制備與效價檢測

1.2.5.1 抗體制備 根據克隆的CHS基因預測編碼氨基酸序列,結合國際數(shù)據庫中茶葉同源基因的特異性比較,并考查CHS蛋白的二級結構、抗原性、親疏水性、表面觸及可能性,選取C-STYPDYYFRITNSEHK-NH2為CHS特異肽段并進行人工合成。取5 mg合成的多肽與KLH偶聯(lián)作為免疫抗原,另將2 mg多肽與BSA偶聯(lián)作為檢測抗原。用PBS將免疫抗原分別稀釋為1 mg/mL,取稀釋后的免疫抗原1 mL加入1 mL福氏完全佐劑,乳化后對大白兔頸背部皮下多點(至少8點)注射,2周免疫一次,免疫4次后采血檢測抗體效價。每抗原同時免疫兩只新西蘭大白兔。

1.2.5.2 抗體純化 將1 mL Sulfolink Resin 偶聯(lián)1 mg多肽制備抗原親和柱,親和柱用10倍柱體積PBS平衡。兔血清經0.45 μm濾膜過濾后,過抗原親和柱進行抗體吸附,待濾液流盡后加入PBS平衡并流盡溶液。往親和柱加入抗體洗脫液,收集流出的洗脫液并檢測280 nm處的吸光值,對吸光值大于1.0的組分合并,然后進行PBS透析獲得純化抗體用于后續(xù)檢測。

1.2.5.3 抗體效價檢測 采用間接ELISA方法,將200 μL純化抗原(1 μg/mL)加入酶標板中,置于4 ℃過夜,洗脫封閉后加入稀釋純化抗體100 μL,37 ℃放置1 h。洗滌后加入已稀釋二抗100 μL于37 ℃放置30 min。加入TMB于37 ℃放置15 min顯色,用酶標儀測定450 nm波長處吸光值,檢測獲得樣品效價[23]。

1.2.6 茶葉體內CHS基因翻譯水平測定

1.2.6.1 總蛋白提取 參考取1 g茶鮮葉,在含有水不溶性PVPP的液氮中充分研磨。加入10 mL預冷10% TCA/丙酮(含0.07%β-巰基乙醇,1 mmol/L PMSF),于-20 ℃沉淀3 h。隨后于4 ℃以12000×g離心15 min,棄上清。重復以上丙酮洗滌操作2～3次,收集沉淀于-80 ℃保存[24]。

1.2.6.2 Western blot分析 使用SDS聚丙烯酰胺凝膠(12%分離膠和5%濃縮膠)進行蛋白的分離,考馬斯亮藍R-250進行膠體染色。經濕法轉印技術將凝膠中蛋白轉到PVDF膜,用5%脫脂奶粉對膜進行封閉,4 ℃輕搖過夜。加入一抗(1∶5000稀釋)4 ℃孵育過夜,TBST清洗3次。加入二抗(1∶5000稀釋)26 ℃輕搖1 h,TBST清洗3次,然后加適量顯影液顯影。顯色帶經掃描儀掃描后,用ImageJ軟件進行灰度分析,計算CHS蛋白與內參Actin蛋白灰度值之比,獲得CHS蛋白相對表達量。

2 結果與分析

2.1 兩種茶葉中兒茶素含量分析

本研究首先采用HPLC法測定兩種茶葉中的兒茶素含量及組成,結果如圖1所示,兩種茶葉展現(xiàn)不同的兒茶素代謝特征。英紅9號(YH)中兒茶素總含量為181.51 mg/g,而南昆山毛葉茶(MY)中兒茶素總含量則為106.02 mg/g,YH中兒茶素含量遠高于MY并且前者為后者的1.71倍,差異極顯著(P<0.01)。在兒茶素組成上,YH以表型兒茶素為主,并占兒茶素總量的90.63%,其中ECG含量最高占到兒茶素總量的34.57%。MY中兒茶素組成則完全不同于YH,以非表型兒茶素為主,占兒茶素總量的70.48%,尤其GCG含量占總兒茶素的47.14%。兩種茶葉在兒茶素含量及組成上均存在較大差異,可能受到基因表達的調控作用,值得進一步探究。

圖1 兒茶素含量的測定Fig.1 Determination of catechin contents 注:C:兒茶素;GC:沒食子兒茶素;CG:兒茶素沒食子酸酯;GCG:沒食子兒茶素沒食子酸酯;EC:表兒茶素;ECG:表兒茶素沒食子酸酯;EGC:表沒食子兒茶素;EGCG:表沒食子兒茶素沒食子酸酯； **：差異極顯著,P<0.01。

圖3 CHS蛋白功能域分析Fig.3 Analysis of conserved domain in CHS protein注:▲為丙二酰-CoA結合位點,紅色方框為FAE1_CUT1_RppA結構域,綠色方框為ACP_syn_III_C結構域。

2.2 CHS基因克隆與序列分析

為探明英紅9號和南昆山毛葉茶兒茶素差異代謝的分子基礎,本研究進而對兒茶素合成代謝起關鍵作用的CHS基因開展深入研究。以提取的mRNA經逆轉錄得到的cDNA為模板,利用設計合成的CHS基因特異性引物從兩種茶葉中擴增靶序列,結果如圖2所示,PCR擴增出1100 bp的產物。將條帶回收后與pMD18-T載體連接并轉化大腸桿菌DH5α。將獲得的陽性克隆經PCR及測序鑒定后表明,MY和YH中所克隆的CHS基因均包含1170 bp的開放閱讀框,兩者核苷酸序列僅具有單個堿基的差異,但編碼389個相同的氨基酸序列,其相對分子量為42.57 kDa,等電點為5.97。與NCBI的GenBank數(shù)據庫比對分析發(fā)現(xiàn),所克隆的兩種茶葉中CHS基因與數(shù)據庫中已登錄的茶葉CHS基因(KY615681)氨基酸序列同源性均達100%。使用NCBI-CDS對基因的功能結構域分析表明,克隆CHS基因所編碼的蛋白包含8個丙二酰-CoA結合位點,這些活性位點使底物與CHS蛋白結合發(fā)生催化反應,參與類黃酮途徑,調控兒茶素的合成,并還含有FAE1_CUT1_RppA(pfam08392)和ACP_syn_III_C(pfam08541)等功能域(圖3),說明所克隆得到的CHS基因具有生物學功能。

圖2 CHS基因的PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification electrophoresis results of CHS gene注:M:DNA標記;1,2:MY-CHS;3,4:YH-CHS。

2.3 CHS基因表達蛋白的亞細胞定位

為探明CHS蛋白功能,本研究對CHS基因表達蛋白亞細胞定位開展分析。利用DNA重組技術將克隆的CHS基因組裝進重組表達載體pC1301-GFP,將得到的重組表達載體pC1301-GFP/CHS進行PCR和雙酶切鑒定,電泳結果分析均得到1100 bp左右的目的條帶(圖4),進一步測序結果表明載體構建成功,可用于后續(xù)實驗。利用 GFP 蛋白表達會發(fā)出綠色熒光這一便于觀察的特點,將構建的載體轉入農桿菌并注射煙草葉片下表面,培養(yǎng)后用激光共聚焦顯微鏡進行觀察,激發(fā)光波長為488 nm,發(fā)射光波長640 nm。觀察結果如圖5所示。轉pC1301-GFP空載體的煙草細胞內布滿了綠色熒光,而轉pC1301-GFP/CHS載體的煙草其細胞內綠色熒光主要分布在細胞質,細胞膜和細胞核中也有部分熒光信號,因此將CHS基因表達蛋白定位于細胞質、細胞膜和細胞核中。

圖4 重組載體PC1301-GFP/CHS鑒定Fig.4 Identification of recombinant vector PC1301-GFP/CHS注:a,M:DNA標記,1:PCR鑒定;b,M:DNA標記,1:雙酶切鑒定。

圖5 CHS在煙草中的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of CHS in tobacco cell注:a:明場;b:熒光場;c:葉綠體自發(fā)熒光;d:疊加場。

表1 抗體效價檢測Table 1 Detection of antibody titer

注:CHS抗體1和2為分別為免疫兩只兔子合成的抗體。

2.4 CHS基因轉錄水平分析

為比較具差異兒茶素代謝的YH和MY兩種茶葉中CHS基因表達情況,以提取mRNA反轉錄得到的cDNA為模板,選取GAPDH基因為內參,利用qRT-PCR對兩種茶葉中的CHS基因進行了轉錄水平測定。結果如圖6所示,CHS基因在YH中的相對表達量遠高于MY,前者是后者的3.9倍,表達差異極顯著(P<0.01),與兒茶素總量在兩材料中的差異一致,表明CHS基因能夠正向調控兒茶素的合成。

圖6 CHS基因熒光定量PCRFig.6 qRT-PCR analysis of CHS gene注:**表示差異極顯著,P<0.01。

2.5 CHS抗體制備與效價檢測

功能基因在生物代謝及其調控中發(fā)揮重要角色,闡釋功能基因的表達情況,尤其翻譯水平與代謝的關系,成為生物代謝相關研究的重要環(huán)節(jié)[25]。生物體內基因表達蛋白的分析除了研究費用高昂的蛋白質組學外,主要是通過發(fā)展特異抗體用于檢測基因翻譯水平。為準確分析比較兩茶葉體內CHS基因翻譯水平差異,根據分析選取基因特定肽段經人工合成及修飾后免疫兔子獲得多克隆抗體。相比原核表達蛋白制備的抗原,人工合成基因特定肽段制備抗原,其具有成分單一、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點[26]。并對純化抗體通過間接ELISA法檢測其效價,結果如表1所示。兩只兔子來源的CHS抗體,濃度為1 μg/mL時,效價均達1∶80000,表明制備的多克隆抗體效價高,達到預期效果?；贑HS抗體1的效價高于CHS抗體2,選取CHS抗體1用于后續(xù)實驗。

2.6 茶葉體內CHS基因翻譯水平分析

圖7 CHS蛋白Western-blot 分析Fig.7 Western-blot analysis of CHS protein 注:a,M:標準預染蛋白,1～4:南昆山毛葉茶,5～8:英紅9號;b,CHS蛋白與Actin蛋白灰度比值;**表示差異極顯著,P<0.01。

為比較兩種茶葉中CHS基因翻譯水平的差異,將茶葉提取總蛋白SDS-PAGE電泳分離、轉膜后,用制備的多克隆抗體按照Western-blot技術對CHS蛋白表達量進行測定分析(多克隆抗體為一抗,羊抗兔為二抗,Actin為內參)。結果顯示(圖7a),CHS僅在40 kDa左右有一特異性雜交條帶,內參在55 kDa左右有一特異性雜交條帶,均與實際分子量一致,表明制備的CHS多克隆抗體能特異檢測出茶葉中的靶蛋白。利用灰度分析計算CHS蛋白與Actin內參蛋白表達量比值即相對表達量,結果如圖7b所示,YH中CHS蛋白的相對表達量極顯著高于MY(P<0.01)并達到1.7倍。CHS基因翻譯水平與兒茶素總量在兩種茶葉中的差異一致,從翻譯水平進一步證明CHS基因正向調控兒茶素的合成。

3 結論

本研究通過RT-PCR從英紅9號和南昆山毛葉茶中成功克隆得到1170 bp的CHS基因序列,在此基礎上,根據其序列特點,選擇特定肽段進行人工合成,制備成基因特定抗原后免疫動物,獲得的多克隆抗體效價高,符合對靶蛋白精確定量的要求。研究表明,CHS基因在兩種茶葉間的轉錄水平差異與兒茶素含量差異相一致,進一步的Western-blot雜交發(fā)現(xiàn),CHS蛋白表達水平在高兒茶素茶葉體內的表達水平極顯著高于低兒茶素含量的茶葉(P<0.01)。相關性分析表明,茶葉體內的兒茶素含量與CHS基因表達,無論在轉錄水平還是翻譯水平均呈正相關,說明CHS基因正向調控兒茶素合成。亞細胞定位將CHS基因表達蛋白定位于細胞質、細胞膜和細胞核中。本研究所獲得的茶葉CHS基因相關的生物學信息,及其與兒茶素積累的關系,為今后研究兒茶素代謝分子機制奠定了一定的基礎。此外,本研究基于人工合成肽段發(fā)展茶葉CHS基因蛋白抗體所體現(xiàn)的簡潔性、可靠性和高效性,為茶葉功能基因研究,尤其是為部分難以體外表達蛋白的基因制備抗體,提供了研究思路及技術參考。