何運鋪 鄭玉倩 陳建歡 唐世杰 黃麗衡

唇腭裂是人類常見的先天性畸形之一，在中國其發(fā)生率在1/700。隨著地區(qū)、民族與性別的不同，其發(fā)生率存在差別[1]，在我國出生畸形的發(fā)病率中位于第二，唇裂的發(fā)病率約1.37‰，腭裂約0.29‰。

近十年以來，已報道了亞洲地區(qū)相關(guān)候選基因有23 個[2-7]，部分基因獲得了關(guān)聯(lián)性研究和連鎖性研究的證據(jù)，但是，這部分研究仍需要在其他地區(qū)或種族中進一步深入研究。v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B,MAFB)rs6102085在Beaty等[8]報道的全基因組關(guān)聯(lián)研究中更是達到基因組水平顯著性，Zhang等[9]報道了MAFBrs6102085在中國西部漢族人群未發(fā)現(xiàn)有關(guān)聯(lián)，Huang等[10]報道MAFBrs6102085位點多態(tài)性與中國人群發(fā)病有關(guān)。MAFBrs6102085位點與中國人群中的唇腭裂是否有關(guān)聯(lián)，在中國不同地區(qū)結(jié)果存在差異，在中國廣東潮汕地區(qū)漢族人群研究很少，尤其是其與NSCL/P亞型和性別的關(guān)聯(lián)在中國廣東潮汕地區(qū)漢族人群還未見明確報道。本實驗收集2008年6月～2010年9月在汕頭大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院整形外科住院的廣東潮汕地區(qū)唇腭裂患者430 例和450 例健康者，探討廣東潮汕地區(qū)漢族人群MAFBrs6102085位點與唇腭裂的關(guān)聯(lián)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

430 例病例中有46 例性別和亞型不詳，其余384 例樣本中男性256 例，女性128 例，年齡3 月～36 歲，唇裂73 例，唇裂合并腭裂255 例，腭裂56 例。對照組450 例(排除了綜合征性唇腭裂，其它遺傳病和家系中無唇腭裂患者，健康者間無血緣關(guān)系)，男性207 例，女性239 例，年齡20～60 歲(有4 例性別不詳)。性別或亞型不詳者，在相應(yīng)的性別、亞型或關(guān)聯(lián)分析中排除。研究樣本均來自廣東省粵東潮汕語系地區(qū)。抽取靜脈血5 ml，用2% EDTA抗凝劑抗凝。本實驗獲得了汕頭大學醫(yī)學倫理委員會的批準，患者和健康組家屬均簽署了研究知情同意書。

1.2 DNA提取

用DP-318-03 血樣DNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)，按說明書操作步驟，在靜脈血中提取血液基因中的DNA。100 μl的靜脈血可以提取出20～50 ng的DNA。

1.3 單核苷酸多態(tài)性基因型檢測

用于檢測MAFBrs6102085的TAQMAN 單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因型分型測定試劑 (TAQMAN?,APPLIED BIOSYSTEMS,ABI公司，USA) 檢測SNP序列見表1。SNP檢測均使用了熒光標記的5-核酸酶法，試劑有TAQMAN SNP基因型分型測定試劑及TAQMAN PCR 混合試劑。每一個反應(yīng)體系中都含有12 ng的基因組DNA，3 μl的TAQMAN 反應(yīng)混合試劑，0.15 μl的20×TAQMAN 多態(tài)性位點基因型檢測試劑，以及1.65 μl蒸餾水，總反應(yīng)體積為6.0 μl。REAL-TIME PCR在iQTM5 REAL-TIME PCR儀(ABI公司，USA)上進行，對目標序列進行擴增，REAL-TIME PCR擴增過程中，96 個孔的光學PCR板置于PCR儀上，用 IQTM5 OPTICAL SYSTEM SOFTWARE VERSION-1.0作基因型結(jié)果研究分析，此過程運用了等位基因識別的模式(具體操作步驟按說明書)。

表1 MAFB rs6102085位點的基因型檢測序列

1.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS 15.0統(tǒng)計學分析軟件、HAPLOVIEW 4.2遺傳統(tǒng)計學軟件進行分析。在健康組中用HAPLOVIEW 4.2分析SNP的哈迪-溫伯格平衡(HWE)。SNP的基因型頻率通過計數(shù)得出，等位基因頻率由基因型推算出。用SPSS 15統(tǒng)計學軟件進行卡方檢驗，對唇腭裂組和健康組的單核苷酸多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率進行對比，分別對亞型和性別分組進行對比，計算95%置信區(qū)間、優(yōu)勢比和P值。

2 結(jié) 果

2.1 HWE

健康組中SNP基因型頻率符合HWE(P>0.05)，提示所納入的健康組具有代表性(表2)。

表2 健康組的哈迪-溫伯格平衡

2.2 唇腭裂組和健康組等位基因與基因型對比

唇腭裂組中MAFBrs6102085的GG基因型頻率(P<0.000 1，OR=1.943)與健康組對比顯著增高，G等位基因頻率(P=1.22×10-6，OR=1.6)與健康組對比顯著增高，差異有顯著性統(tǒng)計學意義(表3～4)。

表3 唇腭裂組和健康組基因型

2.3 唇腭裂臨床亞型組和健康組等位基因與基因型對比

①唇裂合并腭裂組中MAFBrs6102085的GG基因型頻率(P<0.000 1，OR=2.154)和G等位基因頻率(P<0.000 1，OR=1.862)與健康組對比均顯著增高，差異有顯著性統(tǒng)計學意義；②單純唇裂和單純腭裂組與健康組對比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表5～6)。

表4 唇腭裂組和健康組等位基因

表5 唇腭裂組臨床亞型和健康組基因型

表6 唇腭裂組臨床亞型和健康組等位基因

2.4 男性唇腭裂組和健康組等位基因與基因型對比

rs6102085的G等位基因頻率(P<0.000 1，OR=1.716)和GG基因型頻率(P<0.000 1，OR=2.660)與健康組對比增高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(表7～8)。

表7 男性唇腭裂組和健康組基因型

2.5 女性唇腭裂組和健康組等位基因與基因型對比

rs6102085的G等位基因頻率(P=0.032)和GG基因型頻率(P=0.046)與健康組對比增高(P<0.05)有統(tǒng)計學意義(表9～10)。

表8 男性唇腭裂組和健康組等位基因

表9 女性唇腭裂組和健康組基因型

表10 女性唇腭裂組和健康組等位基因

3 討 論

利用病例-對照分析，本研究探討了中國廣東地區(qū)漢族MAFBrs6102085位點與先天性唇腭裂的關(guān)系并對不同臨床亞型進行了研究分析，結(jié)果表明該單核苷酸多態(tài)性與先天性唇腭裂存在顯著關(guān)聯(lián)，并且首次發(fā)現(xiàn)了在唇裂合并腭裂亞型中存在顯著關(guān)聯(lián)，而在單純唇裂和單純腭裂中未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)。同時我們還發(fā)現(xiàn)在男性病例中，MAFBrs6102085位點與先天性唇腭裂的關(guān)聯(lián)性更為明顯。

近年來國內(nèi)外學者對MAFB多態(tài)性進行大量的研究，發(fā)現(xiàn)MAFB有多個位點與唇腭裂有關(guān)。研究表明在中國西部地區(qū)、華東地區(qū)及東北人群中，均發(fā)現(xiàn)MAFB與唇腭裂有關(guān)聯(lián)[11-13]。但是到目前為止，在中國廣東潮汕地區(qū)漢族人群中MAFBrs6102085位點與唇腭裂的發(fā)生是否存在關(guān)系還沒有被明確報道過。Beatyt等[8]報道亞洲和歐洲一部分人群rs6102085與唇腭裂的發(fā)病有關(guān)聯(lián)(P= 1.11×10-14)，但其中未包括中國廣東人群。程紅球等[14]報道rs17820943多態(tài)性與南方漢族地區(qū)人群的非綜合征唇腭裂易感性有關(guān)聯(lián)，蘭菲菲等[15]報道MAFBrs13041247位點多態(tài)性與廣東地區(qū)唇腭裂發(fā)病相關(guān)，Huang等[10]報道rs6102085多態(tài)性與中國人群唇腭裂發(fā)病有關(guān)系，馬麗娟等[16]報道了MAFB基因(rs6072081、rs6065259、rs17820943、rs11696257)在寧夏回漢族人群與非綜合征性唇腭裂有關(guān)聯(lián)，馬麗娟等對這4個位點進行臨床亞型分析發(fā)現(xiàn)了寧夏回漢族人群與單純唇裂和唇腭裂組有關(guān)聯(lián)，與單純腭裂無關(guān)聯(lián)，但均未對非綜合征唇腭裂rs6102085位點多態(tài)性的臨床亞型及性別進行分析。廣東省潮汕人群的民族、地域、血緣、文化相同，人群混雜因素影響較小，本研究發(fā)現(xiàn)首次在中國廣東潮汕地區(qū)漢族人群報道了MAFBrs6102085多態(tài)性與唇腭裂有關(guān)聯(lián)，并對臨床亞型及性別進行分析。

本研究發(fā)現(xiàn)MAFBrs6102085與唇腭裂的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)， rs6102085的GG基因型頻率(P=1.27×10-5)與健康組對比顯著增高，G等位基因頻率(P=1.22×10-6)與健康組對比顯著增高，結(jié)果表明含有GG基因型的人群比不含有的人群風險性更高。在唇腭裂臨床亞型組，rs6102085的GG基因型(P=8.37×10-7)、G等位基因(P=0.000 1)與唇裂合并腭裂的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。rs6102085的G等位基因和GG基因型與單純腭裂和唇裂無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。這說明在不同亞型以及疾病嚴重程度上，該單核苷酸多態(tài)性存在不同程度的相關(guān)性。在男性組和女性組，rs6102085與男性有關(guān)聯(lián)(基因型P=1.15×10-4，等位基因P= 5.64×10-5)， 與女性無顯著關(guān)聯(lián)(基因型P=0.046，等位基因P=0.032)。盡管女性患者的樣本量可能較小，但其較小的OR值提示性別差異的存在。本研究通過病例對照研究，證實了MAFB基因rs6102085位點的突變和廣東省潮汕人群非綜合征性唇腭裂的發(fā)生有較強的關(guān)聯(lián)，此研究希望為潮汕人群唇腭裂的產(chǎn)前診斷和預防提供科學依據(jù)，為有唇腭裂患者的家庭提供有效的遺傳咨詢，從而降低唇腭裂的發(fā)生率。對于基因的連鎖不平衡，程度存在潛在不一樣，本研究不能完全評估基因中其它沒有被列入檢測的基因單核苷酸多態(tài)性對唇腭裂的發(fā)病風險。