王艷玲 丁虹 何巍 朱蘭省 劉愛群 許小婷

牙科種植術(shù)治療后，在術(shù)后早期或是在中晚期愈合過程中，炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱和持續(xù)時間直接影響周圍組織的愈合效果[1]。術(shù)后齦溝液中炎癥因子、趨化因子、粘附分子的含量反映出牙周局部的炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱程度，而持續(xù)的炎癥反應(yīng)則是導(dǎo)致骨質(zhì)吸收和種植體不穩(wěn)的病理基礎(chǔ)[2]。同熔附金屬全冠對種植體周圍織中炎癥因子和黏附分子表達(dá)的影響抑制種植體術(shù)后感染和炎癥反應(yīng)成為種植體術(shù)后的關(guān)鍵治療措施。雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)軸突髓鞘細(xì)胞，不但可以保護(hù)神經(jīng)軸突，而且可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，吞噬細(xì)胞碎片，調(diào)節(jié)損傷處的炎癥反應(yīng)，具有十分重要的細(xì)胞移植潛能[34]。本研究以成年比格犬為動物模型，研究雪旺細(xì)胞移植對種植體植入術(shù)后周圍軟組織炎癥反應(yīng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 倫理學(xué)聲明

本研究所以實(shí)驗操作由河南省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有實(shí)驗步驟遵循ARRIVE 指南(http://www.nc3rs.org.uk/ARRIVE)和美國國立衛(wèi)生院動物實(shí)驗指南(NIH Publications no. 85-23, revised 1996)。

1.2 雪旺細(xì)胞的提取和培養(yǎng)

無菌條件下，肌肉注射1 ml/kg濃度為30 g/L的戊巴比妥鈉溶液，全麻下，在犬的大腿內(nèi)側(cè)做縱形切口至皮下，并分離肌層至暴露坐骨神經(jīng)，游離并切取長約4 cm左右的神經(jīng)束，并做好標(biāo)記；將所取神經(jīng)束立即置入4℃的生理鹽水中清洗，顯微鏡下剝離粘連組織，將神經(jīng)纖維剪成碎塊；使用膠原酶液(0.03%)和胰蛋白酶液(0.25%)混合均勻(比例1∶2)在37 ℃水浴中消化神經(jīng)組織碎塊，約20 min后加入血清培養(yǎng)基以終止其消化； 3 min后進(jìn)行離心(1 000 r/min)約5 min，去上清； 加入DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)反復(fù)吹打細(xì)胞及組織塊至均勻；植于培養(yǎng)皿(均含多聚賴氨酸)中加入適量培養(yǎng)基, 置入37 ℃培養(yǎng)箱(5%CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)； 24 h后加入阿糖胞苷(5 μmol/L)，再次培養(yǎng)24 h后，更換新鮮DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，0.1%的青霉素及鏈霉素、20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子)繼續(xù)培養(yǎng)并傳代備用。

雪旺細(xì)胞培養(yǎng)基于傳代第二次前收集， 1 000 r/min離心10 min后清除細(xì)胞碎片，收取上層上清培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)神經(jīng)元。

1.3 動物造模

自體坐骨神經(jīng)切除術(shù)同期拔出兩側(cè)下頜后牙，術(shù)后給予常規(guī)抗感染治療，常規(guī)半流質(zhì)飲食1 周。 2 月后待牙槽骨狀態(tài)平穩(wěn)時，用經(jīng)噴砂處理的Straumann種植體(瑞士)12 顆， 規(guī)格：3.3 mm(直徑)×10 mm(高)，RN(Regular Neck，常規(guī)頸)，SP(Standard Plus，美學(xué)種植體)。全麻下，同期分別在6 只實(shí)驗犬的下頜骨左、右兩側(cè)各植入種植體兩顆，共計12 顆種植體，并在每只實(shí)驗犬的右側(cè)下頜骨的種植窩內(nèi)均勻濃度為1×105/ml的預(yù)先從自身坐骨神經(jīng)中提取并經(jīng)過純化、培養(yǎng)且具有生物活性的雪旺細(xì)胞0.2 ml，左側(cè)種植體則作為對照組，常規(guī)種植體植入，加入0.2 ml PBS最為對照。術(shù)后抗感染治療，常規(guī)半流質(zhì)飼養(yǎng)。

1.4 雪旺細(xì)胞鑒定

比格犬自體坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)和純化后，鋪于培養(yǎng)板中進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色鑒定從而判斷所提取雪旺細(xì)胞純度是否符合移植條件，培養(yǎng)板中雪旺細(xì)胞經(jīng)過無菌PBS液反復(fù)洗滌細(xì)胞3 次，低溫40 g/L多聚甲醛，置于0～4 ℃冰箱中固定約10 min，無菌PBS液再次洗滌細(xì)胞3 次；加入1% Triton-100溶液后放入37 ℃恒溫箱中20 min，PBS液再次洗滌細(xì)胞3 次，于培養(yǎng)板中加入血清封閉液，放入37 ℃恒溫箱封閉5 min，PBS液洗滌細(xì)胞1 次后；加入S100抗體(1 ∶ 200,兔抗犬)，在4 ℃冰箱中孵育一抗24 h；PBS液洗滌細(xì)胞3 次，加入熒光二抗(Alexa FluorTM594標(biāo)記，羊抗兔)，常溫避光孵育二抗30 min后加入PBS液洗滌3 次；熒光顯微鏡下觀察，熒光顯微鏡下觀察，胞漿呈紅色熒光者即為雪旺細(xì)胞。

1.5 齦溝液收集

在雪旺細(xì)胞移植后1 月，收集左右兩側(cè)種植體周圍的齦溝液。將濾紙裁剪成1 mm×10 mm長方形，收集每只種植體與牙周組織間隙前后左右4 個采集位置的齦溝液，每條濾紙放置時間20 s，充分吸收齦溝液后稱重并使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素1-β(IL-1β)和白介素-6(IL-6) 3 種炎癥因子的蛋白表達(dá)量。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測炎癥因子

將收集到比格犬種植體齦溝液的濾紙條加入500 μl平衡鹽溶液，充分混勻溶解吸附于濾紙條的齦溝液， 1 000 r/min離心后取樣本進(jìn)行蛋白定量，使用ELISA試劑盒(Elabscience?，武漢伊萊瑞特)檢測TNF-α、IL-1β和IL-6 3 種炎癥因子的蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗方法按照商家說明書嚴(yán)格操作。

1.7 神經(jīng)元培養(yǎng)

取出生1～2 d Wistar大鼠2 只，冷鹽水條件下使用體式顯微鏡分離大腦組織，完整剝離腦膜后在冷DMEM/HG條件下剪碎大腦組織，而后使用木瓜蛋白酶和膠原酶消化大腦組織(37 ℃/30 min)，消化完全后1 000 r/min, 離心5 min，使用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1.5×105個細(xì)胞/ml密度鋪于24 孔培養(yǎng)板中。4 h后更換培養(yǎng)基。24 h后加入雪旺細(xì)胞培養(yǎng)基上清，對照組加入生理鹽水。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后使用細(xì)胞免疫熒光觀察神經(jīng)元軸突長度。

1.8 免疫組織化學(xué)染色

麻醉滿意后，切取種植體周圍牙齦(3 mm×3 mm)，進(jìn)行NF-200(ABCAM，美國)免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下比較2 組間NF-200陽性神經(jīng)纖維表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 雪旺細(xì)胞鑒定及種植體雪旺細(xì)胞共移植

比格犬自體坐骨神經(jīng)切除后提取雪旺細(xì)胞，所提取雪旺細(xì)胞經(jīng)過體外傳代、純化后進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光S-100染色鑒定。所培養(yǎng)比格犬自體坐骨雪旺細(xì)胞，為梭狀，細(xì)胞胞體透亮，細(xì)胞群呈螺旋形排列，免疫細(xì)胞熒光S-100染色呈現(xiàn)紅色熒光，純度較高(圖1A)，可以達(dá)到細(xì)胞移植標(biāo)準(zhǔn)并且進(jìn)行細(xì)胞移植種植體共移植(圖1B)。

A： 雪旺細(xì)胞(S-100)免疫熒光染色(×100)；B： 種植體植入

2.2 雪旺細(xì)胞移植促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長

對照組按照1∶1加入新鮮雪旺細(xì)胞培養(yǎng)基，雪旺細(xì)胞培養(yǎng)基組加入雪旺細(xì)胞后收取的培養(yǎng)基。培養(yǎng)3 d后NF-200細(xì)胞免疫熒光檢測神經(jīng)元軸突長度。結(jié)果顯示雪旺細(xì)胞培養(yǎng)基組神經(jīng)元軸突長度顯著優(yōu)于對照組(t=4.72，P<0.05)(圖2)。

A：對照組； B： 雪旺細(xì)胞培養(yǎng)基組； C: 神經(jīng)元軸突長度

2.3 齦溝液炎癥因子與營養(yǎng)因子表達(dá)

在比格犬下頜后牙拔出2 月后行種植體植入術(shù)，在植入種植體同時在右側(cè)2 顆種植體移植部位移植雪旺細(xì)胞，對照側(cè)加入相同體積的PBS鹽溶液，在雪旺細(xì)胞移植后1 月檢測左右兩側(cè)種植體齦溝液中TNF-α、IL-1β和IL-6 3 種炎癥因子及BDNF和NGF表達(dá)含量。與對照組相比，雪旺細(xì)胞移植組TNF-α、IL-1β和IL-6 3 種炎癥因子蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)(圖3A)，BDNF和NGF的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(圖3B)。

圖3 齦溝液中炎癥因子及營養(yǎng)因子表達(dá)量

2.4 雪旺細(xì)胞移植后促生牙齦神經(jīng)纖維生長

在比格犬下頜后牙拔出2 月后行種植體植入術(shù)，在植入種植體同時在右側(cè)2 顆種植體移植部位移植雪旺細(xì)胞，對照側(cè)加入相同體積的PBS鹽溶液，1 月后使用NF-200免疫組織化學(xué)檢測左右兩側(cè)種植體周圍牙齦組織神經(jīng)纖維數(shù)量。與對照組相比，雪旺細(xì)胞移植組表達(dá)更多NF-200陽性神經(jīng)纖維(圖4)。

圖4 牙齦神經(jīng)纖維NF-200免疫組織化學(xué)染色 (×100)

3 討 論

種植體周圍炎癥可累及牙周軟組織以及牙周硬組織，使種植體周圍組織退化而最終導(dǎo)致種植體不穩(wěn)及脫落。炎癥因子的大量產(chǎn)生引起種植體周圍局部炎癥反應(yīng)加重，種植體周圍炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致種植體周圍軟組織退變、牙槽骨骨質(zhì)吸收、破壞的主要因素之一[5]。TNF-α、IL-1β和IL-6是最常見的炎癥因子[6]。IL-6作為炎癥細(xì)胞趨化因子，可以趨化中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞進(jìn)入種植體周圍軟組織， 浸潤到種植體周圍的炎癥細(xì)胞繼續(xù)分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，進(jìn)一步趨化炎癥細(xì)胞浸潤和釋放大量炎癥因子而加重局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥瀑布反應(yīng)，齦溝液中的炎癥因子表達(dá)含量和牙周袋深度及附著能力喪失直接相關(guān)，隨著牙周軟組織退化，牙槽骨組織也發(fā)生破壞，最終導(dǎo)致種植體的不穩(wěn)、甚至是脫落[7]。TNF-α不但可以作為評價局部炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的指示因子，而且其可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟和分化，同時抑制成骨細(xì)胞的形成和分化，最終導(dǎo)致種植體周圍牙槽骨骨質(zhì)流失[8-9]。IL-1β可以激活破骨細(xì)胞，增加局部牙槽骨骨質(zhì)流失[10]。同時IL-1β也可以作為臨床監(jiān)測種植體周圍骨質(zhì)吸收程度的重要評價指標(biāo)[11]。抑制上述3 種炎癥因子的表達(dá)對于減輕種植體周圍炎癥反應(yīng)具有十分重要的作用，從而可以減輕種植體周圍軟、硬組織的退化和吸收，減少種植體的不穩(wěn)和脫落。

當(dāng)牙齒拔除后，牙周膜組織完整性遭到損傷，其內(nèi)部的神經(jīng)纖維破壞，致使骨感知能力下降。雪旺細(xì)胞作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細(xì)胞，起源于胚胎時期的神經(jīng)嵴，具有形成周圍神經(jīng)軸突髓鞘、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF和NGF)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用[12-14]，在組織工程研究中也起著舉足輕重的作用，被稱作人工神經(jīng)再生的種子細(xì)胞?，F(xiàn)今，被證實(shí)的主要作用有：激活巨噬細(xì)胞清除壞死崩解物；調(diào)節(jié)損傷局部的炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷；迅速增殖、分泌營養(yǎng)因子、形成髓鞘，引導(dǎo)軸突再生與生長，為神經(jīng)再生提供環(huán)境等[14-16]。NGF是促進(jìn)神經(jīng)元生長的重要神經(jīng)營養(yǎng)因子，除在神經(jīng)系統(tǒng)中作用外，也可以調(diào)節(jié)種植體植入后成骨細(xì)胞活化、分化、礦化及周圍神經(jīng)、血管形成，從而促進(jìn)種植體骨結(jié)合[17]。改善種植體周圍微環(huán)境對于減少種植體周圍軟組織退變和骨質(zhì)吸收具有十分重要的作用。雪旺細(xì)胞體現(xiàn)出良好的調(diào)節(jié)種植體周圍炎癥的功能，同時其促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長的作用可以改善骨感知，促進(jìn)種植體骨結(jié)合。

本研究結(jié)果顯示比格犬自體坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞培養(yǎng)純化后純度高，達(dá)到進(jìn)行細(xì)胞移植治療的要求。在植入種植體1月后，雪旺細(xì)胞共移植組TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)水平相比對照組顯著下降(P<0.05)，雪旺細(xì)胞顯示出在調(diào)節(jié)種植體周圍炎癥反應(yīng)中的良好作用，對于減輕種植體軟、硬組織退化及吸收具有治療潛能，同時具有應(yīng)用于臨床中的巨大潛力，但是仍然需要進(jìn)一步研究證實(shí)在人體的治療效果，為雪旺細(xì)胞移植調(diào)節(jié)種植體周圍炎癥鋪平道路。