梅 杰 徐 瑞 王惠宇 潘佳棟 劉超英

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，美國(guó)腫瘤協(xié)會(huì)預(yù)測(cè)2018年全美會(huì)有超過(guò)60000例RCC新增病例和近15000例死亡病例[1]。根據(jù)組織學(xué)特點(diǎn)和分析特征，RCC被分成許多亞型。主要亞型包括腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(pRCC)、腎嫌色細(xì)胞癌(chRCC)、腎集合管細(xì)胞癌(cdRCC)和未分類(lèi)腎細(xì)胞癌[2, 3]。其中ccRCC是最常見(jiàn)的腎細(xì)胞癌亞型，約占70%～75%[2]。通常情況下RCC對(duì)傳統(tǒng)化療和放療療效不佳，最好的治療方法是早期外科切除[4]。然而，大量預(yù)后不良的ccRCC進(jìn)展期患者仍然缺乏有效的治療措施來(lái)控制腫瘤惡性進(jìn)展。因此，探索ccRCC潛在的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)ccRCC的治療具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的主要調(diào)控因子[5]。長(zhǎng)期以來(lái)，關(guān)鍵TFs的失調(diào)被認(rèn)為是多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵事件。MXD3是堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子MXD家族成員之一，與其輔因子MAX形成異二聚體，最初被認(rèn)為是MXD/MAX/MYC轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中MYC蛋白的功能拮抗劑[6～8]。MXD3在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，有報(bào)道稱MXD3在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并且對(duì)少數(shù)腫瘤具有臨床診斷和治療價(jià)值。MXD3在髓母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中均有高表達(dá)，在上述兩種腫瘤中均發(fā)揮致癌基因的作用[9, 10]。與之相反的是，在前列腺癌和神經(jīng)纖維瘤病中，MXD3表達(dá)降低[10]。然而，盡管MXD3的表達(dá)就作用機(jī)制在少數(shù)幾種腫瘤中已有探究，關(guān)于MXD3在ccRCC中表達(dá)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，MXD3對(duì)ccRCC的潛在作用還存在很大的探索空間。

本研究中，筆者從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和基因表達(dá)匯編數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO)下載ccRCC中MXD3表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床病理參數(shù)，分析MXD3表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性及對(duì)預(yù)后的影響。本研究首次揭示了MXD3在ccRCC中的差異表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響，有望成為ccRCC靶向治療的新靶點(diǎn)。

材料與方法

1.TCGA數(shù)據(jù)資料收集：利用UCSC Xena網(wǎng)站(https://xenabrowser.net/)下載腎透明細(xì)胞癌患者基因表達(dá)譜Level3數(shù)據(jù)和臨床隨訪資料。整理提取MXD3 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)以及相應(yīng)的臨床資料，其中MXD3表達(dá)譜數(shù)據(jù)已進(jìn)行l(wèi)g2(x+1)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化。通過(guò)篩選，共保留528例同時(shí)包含MXD3表達(dá)譜數(shù)據(jù)與對(duì)應(yīng)的臨床隨訪資料的病例信息，其中有72例腫瘤組織包含配對(duì)的正常組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。根據(jù)MXD3表達(dá)量，對(duì)數(shù)據(jù)集中的樣本按照MXD3的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量進(jìn)行由高到低排序，將數(shù)據(jù)兩等分，位于前50%的樣本為高表達(dá)組，位于后50%的樣本為低表達(dá)組。

2.GEO數(shù)據(jù)資料收集：登錄GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)數(shù)據(jù)庫(kù)，從數(shù)據(jù)集中下載ccRCC測(cè)序芯片集GSE40435，用于驗(yàn)證ccRCC中MXD3 (ID_REF: ILMN_1711904)的差異表達(dá)。GSE40435由Wozniak等[11]在GPL10558平臺(tái)上使用Illumina HumanHT-12 v4表達(dá)串珠芯片獲得的ccRCC測(cè)序芯片集，包含101個(gè)腫瘤組織和與其匹配的正常組織的基因表達(dá)譜。

3.生存分析：采用Kaplan-Meier法對(duì)保留的528例患者的MXD3 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)與匹配的生存資料進(jìn)行生存分析。使用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)可能影響腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的參數(shù)進(jìn)行單因素和多因素分析，模型參數(shù)采用Omnibus檢驗(yàn)法。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中MXD3表達(dá)量。采用ROC曲線評(píng)價(jià)腫瘤組織和癌旁正常組織中MXD3差異表達(dá)的診斷意義。采用χ2檢驗(yàn)比較MXD3表達(dá)量與臨床病理參數(shù)關(guān)聯(lián)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MXD3在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)：與癌旁組織比較，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ccRCC組織的MXD3表達(dá)均明顯上調(diào)(P=0.000，圖1A)。筆者進(jìn)而使用ROC曲線法評(píng)估MXD3的差異表達(dá)在診斷ccRCC中的潛在價(jià)值(AUC=0.897，P=0.000，圖1B)，敏感度為83.33%，特異性為91.67%。筆者進(jìn)一步利用GSE40435微陣列數(shù)據(jù)驗(yàn)證了MXD3在ccRCC中的差異表達(dá)(P=0.000，圖1C)，同時(shí)也證明MXD3在ccRCC組織中的過(guò)表達(dá)對(duì)鑒別ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價(jià)值(AUC=0.785，P=0.000，圖1D)。

2.MXD3表達(dá)與ccRCC臨床病理變量的關(guān)系：因GSE40435微陣列數(shù)據(jù)未包含完整的臨床病理參數(shù)，本研究只納入了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的528例患者進(jìn)行臨床病例參數(shù)和生存分析。按照MXD3表達(dá)量將患者分為MXD3高表達(dá)組和低表達(dá)組。MXD3表達(dá)在性別及年齡方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.465，P=0.296，表1)。在ccRCC的臨床分期方面，MXD3表達(dá)在較大及發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的腫瘤中的表達(dá)顯著增加(P均=0.001)。TNM分期較高者M(jìn)XD3表達(dá)也顯著增加(P=0.000)。然而，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者M(jìn)XD3表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.213)。此外，MXD3高表達(dá)與病理分級(jí)密切相關(guān)(P=0.001)，詳見(jiàn)表1。

圖1 MXD3在ccRCC組織及癌旁組織中的表達(dá)A.TCGA數(shù)據(jù)顯示ccRCC組織中MXD3的表達(dá)明顯上調(diào)；B.TCGA數(shù)據(jù)集中MXD3 mRNA差異表達(dá)對(duì)ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價(jià)值；C.GSE40435微陣列數(shù)據(jù)顯示ccRCC組織中MXD3的表達(dá)明顯上調(diào)；D.GSE40435微陣列數(shù)據(jù)集中MXD3 mRNA差異表達(dá)對(duì)ccRCC組織和癌旁組織具有良好的診斷價(jià)值

3.MXD3表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者生存的關(guān)系：與存活患者比較，死亡患者M(jìn)XD3的表達(dá)明顯增加(P=0.000，圖2A)。Kaplan-Meier法分析顯示，MXD3高表達(dá)與ccRCC患者總體生存期縮短顯著相關(guān)(P=0.000，圖2B)。

表1 MXD3 mRNA表達(dá)量與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

圖2 MXD3表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系A(chǔ).存活患者與死亡患者M(jìn)XD3表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B.MXD3高表達(dá)的患者OS明顯短于MXD3低表達(dá)的患者

4.腎透明細(xì)胞癌患者的單因素和多因素生存分析：在總生存率預(yù)后因素的單因素COX回歸模型中，初診年齡(P=0.000)、T分期(P=0.000)、N分期(P=0.001)、M分期(P=0.000)、TNM分期(P=0.000)、腫瘤分化程度(P=0.000)、MXD3表達(dá)(P=0.000)均與患者預(yù)后相關(guān)(表1)。多因素COX分析顯示MXD3是OS的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=2.249，95% CI: 1.350～3.488，P=0.000)。此外，年齡(P=0.008)和M分期(P=0.001)也是ccRCC患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)(表2)。

表2 腎透明細(xì)胞癌患者的單因素和多因素生存分析

討 論

MXD3是MXD家族成員之一，參與調(diào)控MXD/MAX/MYC轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)與MAX競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而阻斷依賴MYC基因轉(zhuǎn)錄的激活，被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子。已有多項(xiàng)研究證實(shí)了MXDs與MYC相互作用的可能機(jī)制，MXDs的低表達(dá)或失活可導(dǎo)致MXDs-MAX二聚體的減少，從而使MYC的功能形式——MYC- MAX二聚體的數(shù)量顯著增加[12]。MYC編碼細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，在包括細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、黏附、代謝、血管生成、分化和凋亡等真核細(xì)胞生物活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[13]。此外，大多數(shù)人類(lèi)惡性腫瘤中都被發(fā)現(xiàn)存在MYC的表達(dá)失調(diào)，充當(dāng)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的致癌基因[14]。

MXD3在少數(shù)幾種腫瘤中已被確定為一種新的致癌基因，包括髓母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及急性B淋巴細(xì)胞白血病[9,10,15]。一項(xiàng)基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的研究表明膠質(zhì)瘤過(guò)表達(dá)的MXD3受其轉(zhuǎn)錄組水平的可變剪接調(diào)控[16]。此外，以MXD3為靶點(diǎn)的靶向治療腫瘤的前景也十分可觀。MXD3 siRNA已被報(bào)道用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤和急性B淋巴細(xì)胞白血病的靶向治療，并對(duì)癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用[10,17]。目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道MXD3在ccRCC中表達(dá)及臨床意義，因此本研究為較早地關(guān)注MXD3在ccRCC中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

通過(guò)對(duì)TCGA中MXD3表達(dá)數(shù)據(jù)的分析，筆者發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，ccRCC組織中MXD3表達(dá)明顯上調(diào)。筆者采用ROC曲線評(píng)價(jià)MXD3對(duì)ccRCC的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示相對(duì)敏感度為83.33%，特異性為91.67%。GSE40435微陣列數(shù)據(jù)集的MXD3表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果，兩個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果均表明檢測(cè)MXD3 mRNA的差異表達(dá)是診斷ccRCC的有效方法。此外，MXD3表達(dá)量與ccRCC的TNM分期有關(guān)，在不同分化程度的腫瘤中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，MXD3表達(dá)可作為預(yù)測(cè)ccRCC進(jìn)展的可靠指標(biāo)。迄今為止，對(duì)于MXD3對(duì)人類(lèi)惡性腫瘤的預(yù)后價(jià)值還知之甚少。筆者發(fā)現(xiàn)MXD3高表達(dá)組患者的OS明顯低于低表達(dá)組。單因素和多因素COX回歸分析表明，MXD3表達(dá)可作為ccRCC的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

本研究初步分析MXD3表達(dá)及其與臨床病例參數(shù)的關(guān)系，表明MXD3表達(dá)的上調(diào)是ccRCC潛在的生物學(xué)標(biāo)志物和獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)，MXD3可能成為一個(gè)新的抗癌治療靶點(diǎn)，可能改善ccRCC患者的預(yù)后。雖然本研究已經(jīng)初步證明MXD3是一種新的ccRCC診斷和預(yù)后標(biāo)志物，但本研究也存在一些局限性。主要的缺點(diǎn)是TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)只提供了MXD3在mRNA水平上的表達(dá)，這或許不能完全代表MXD3在蛋白水平上的表達(dá)及活化程度。MXD3參與ccRCC發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。