婁俊鑫 劉泓 沈少君 馮芷菡 何冬冬 吳樹松 陳煒 江桂花 常鵬飛 彭國華

摘 ?要：為了解除草劑、地膜及高溫火焰處理等農(nóng)藝措施對土壤真菌群落及功能的影響，利用高通量測序技術(shù)及FUNGuild功能預(yù)測方法分析了不同處理煙田土壤真菌群落組成和功能特性。研究共設(shè)置7個處理，分別為：對照（CK）、施除草劑+覆蓋地膜處理（T1）、單施除草劑處理（T2）、單覆蓋地膜處理（T3）、覆蓋地膜+中檔火焰處理（T4）、中檔火焰處理（T5）和高檔火焰處理（T6）。結(jié)果表明，供試土壤真菌群落主要由擔(dān)子菌門、子囊菌門和被孢霉門構(gòu)成，不同農(nóng)藝措施對土壤α多樣性指數(shù)無顯著影響，但對真菌屬豐度和真菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著。與對照相比，覆蓋地膜和中、高檔火焰處理的土壤中病理營養(yǎng)型真菌豐度顯著降低，烤煙患真菌病害的風(fēng)險下降;施除草劑的土壤中烤煙真菌病害的發(fā)病風(fēng)險下降，但由于土壤腐生真菌的減少，不利于土壤有機質(zhì)的分解。

關(guān)鍵詞：土壤;真菌群落;除草劑;地膜;高溫火焰

Effects of Different Agronomic Measures on the Structure and Function of?Soil Fungi Community in Tobacco Fields

LOU Junxin¹， LIU?Hong¹，?SHEN Shaojun^2*，?FENG Zhihan¹， HE Dongdong¹，?WU?Shusong²，

CHEN?Wei²，?JIANG?Guihua²， CHANG?Pengfei²， PENG?Guohua²

（1.College of Resources and Environment，?Fujian Agriculture and Forestry University，?Fuzhou 350000，?China; 2. Longyan Tobacco Company of Funjian Province， Longyan， Fujian 364000， China）

Abstract：In order to find out the effects of different agronomic measures such as herbicide，?mulch?and?megathermal flame?on soil fungal community and function， high-throughput sequencing and FUNGuild were used to analyze the soil fungal community structure and functional groups under different agronomic measures. There were seven treatments， including control （CK; no herbicide， no mulching film and no megathermal flame?treatment）， apply herbicide?+?mulching film?treatment （T1），?apply herbicide treatment （T2）， mulching film?treatment?（T3）， mulching film?+?mid-range firepower flame treatment?（T4）， mid-range firepower flame treatment （T5） and high-grade?firepower flame treatment （T6）. The results showed that the soil fungi community was mainly composed ofBasidiomycea，AscomyceteandMortierella.?No?significant effect on soil α diversity index?was observed， but there was?significant difference in fungal?genus?abundance and fungal community structure between different agronomic measures. Compared with the control， the abundance of pathotroph fungi was?significantly reduced in the soil of mulching film?treatment， mid-range firepower flame treatment and high-range firepower flame treatment， in which?the risk of fungal diseases in tobacco decreased.?As for the herbicide treatment，?the risk of fungal diseases?also?decreased， but the reduction of?saprotroph?may lead to?inhibited?decomposition of soil organic matter.

Keywords：soil; fungal community; herbicide; mulch; megathermal flame

真菌作為土壤微生物的重要成員，與土壤中的其他微生物一起推動陸地生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動^[1]。它們一方面作為土壤有機物的分解者，促進營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，供植物吸收利用，是有益菌;另一方面，它們作為病原菌入侵植物，使作物發(fā)生病害，造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。土壤中有機質(zhì)等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化均與土壤真菌群落的組成和豐度相關(guān)，同時土壤理化性質(zhì)和植株根系作用也會影響土壤中有機質(zhì)等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，同時土壤理化性質(zhì)和植株根系作用也會影響真菌的物種組成和數(shù)量。

雜草控制不當(dāng)可嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，所以化學(xué)除草劑在煙田的使用十分普遍。然而除草劑的泛濫使用不僅會破壞農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，藥物殘留可能還會導(dǎo)致煙苗產(chǎn)生畸形，影響其正常生長。為此，環(huán)境友好型雜草防除技術(shù)替代化學(xué)除草劑的運用研究備受矚目。物理除草技術(shù)中的火焰除草主要是利用可燃氣體作為燃料，通過人工操作控制，當(dāng)噴著火焰的除草機經(jīng)過煙田土壤畦面時，火焰高溫會使田間雜草細胞水分迅速蒸發(fā)，短時間后全部死亡，并對土壤起到高溫滅菌的作用。覆蓋地膜對雜草亦有一定的防除效果^[2]。然而這些農(nóng)藝措施的應(yīng)用對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響并不清楚。本文采用高通量測序技術(shù)結(jié)合FUNGuild分析，研究除草劑、地膜和火焰高溫處理等農(nóng)藝措施對煙田土壤真菌群落組成、多樣性及結(jié)構(gòu)的影響，為烤煙的科學(xué)栽培提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗設(shè)計

試驗于2018—2019年在福建省龍巖市武平縣萬安鄉(xiāng)進行，試驗田地勢平坦、光照良好、排灌方便、肥力中等，煙稻輪作。

土壤基本理化性質(zhì)：pH 5.0，堿解氮94.81 mg/kg，有效磷71.82 mg/kg，速效鉀93.23 mg/kg。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，處理設(shè)置如表1，每個處理3次重復(fù)，每重復(fù)1畦，面積67 m²。地膜采用黑色聚乙烯材料薄膜，于煙畦蓋膜前1～2?d施用除草劑及進行火焰高溫處理;煙田均用煙舒除草劑150 mL/667 m²（總有效成分40%，其中仲丁靈30%、異噁草松10%）兌水稀釋600～800倍施入土壤;火焰高溫處理采用自主研發(fā)的肩背式煙田高溫滅菌裝置^[3]，設(shè)有大、中、小3種調(diào)節(jié)檔位，該裝置的中檔火力壓強為6 kPa，高檔火力壓強為9 kPa，實施時以噴咀距離畦面3～4 cm為宜，噴射出的火焰與土壤畦面接觸1～2秒，勻速向前;養(yǎng)分施用及其他農(nóng)事操作均按照當(dāng)?shù)卦茻?7品種技術(shù)方案執(zhí)行。

在烤煙旺長期進行土壤樣品采集，每個小區(qū)隨機選取1株有代表性的煙株，采用抖根法獲取根際土壤，挑除石子和根等雜質(zhì)，充分混勻后，用四分法取樣并保存于50 mL離心管中，用冰盒運至實驗室用于土壤微生物總DNA的提取。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?土壤微生物總DNA的提取 ?使用Fast DNA Spin Kit for Soil DNA提取試劑盒（MP Bio-medicals， USA）提取樣品中的總DNA。選用引物ITS5- 1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）ITS2-2043R（5'-GCTGCGTTC-TTCATCGATGC- 3'）擴增真菌18S rRNA基因中的ITS1區(qū)段，PCR產(chǎn)物送至諾禾致源生物信息科技有限公司，利用 HiSep測序平臺進行高通量測序。

1.2.2 ?高通量測序數(shù)據(jù)分析 ?根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從Hiseq高通量測序原始序列中分出各樣品數(shù)據(jù)，對其進行拼接，對拼接后的序列進行質(zhì)控并修剪低質(zhì)量的序列。對數(shù)據(jù)進行OTU聚類分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析及功能預(yù)測統(tǒng)計分析。

1.2.3 ?數(shù)據(jù)處理和作圖 ?用Microsoft Excel 2010和SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和正態(tài)分布檢驗，滿足方差齊性采用Duncan法進行方差檢驗，不滿足方差齊性采用Dunnetts T3檢驗。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?不同農(nóng)藝措施對真菌豐度和多樣性的影響

Alpha（α）多樣性是一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部的多樣性。其中，Ace和Chaol為菌群分布豐度（Community richness）指數(shù)，值越大代表物種總數(shù)越多;Simpson和Shannon是菌群分布多樣性（Community diversity）指數(shù)，若群落的多樣性程度越高，Simpson和Shannon值就越大。Goods coverage指各樣品文庫的覆蓋率，其值越高，表明樣本中序列沒有被測出的概率越低。如表2所示，各處理的測序深度指數(shù)（Goods coverage指數(shù)）均高于99%，說明此次的測序數(shù)據(jù)能較真實地反映樣本中真菌的多樣性。與對照相比，各處理的Simpson、Shannon、Ace和Chaol等指數(shù)均無顯著差異，說明在烤煙旺長期，除草劑、地膜和火焰高溫處理等農(nóng)藝措施處理下的土壤真菌豐度和多樣性無顯著變化，它們對土壤真菌的豐度和多樣性影響不顯著。

2.2 ?不同農(nóng)藝措施對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

基于Weight Unifrac距離矩陣進行PCoA（主坐標(biāo)）分析（圖1）。其中，PC1代表能最大程度區(qū)分所有樣本的第一主坐標(biāo)軸，可以解釋樣本中所有差異的35.30%;PC2代表能最大區(qū)分所有樣本的第二主坐標(biāo)軸，可以解釋樣本中所有差異的29.38%;這兩軸形成的第一個平面展示了樣本間65%左右的差異。樣本聚類中樣本點之間距離越近，表明群落構(gòu)成越相似，彼此間差異越小。除T1的3個子樣本較為離散之外，各樣本的子樣本之間表現(xiàn)出明顯的組間聚集，表明同一樣本之間的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高。其中，T2和T6距離較近，T4和T5距離較近，說明T2和T6、T4和T5的真菌群落結(jié)構(gòu)差異性較小。CK和T1、T3之間的距離較遠，說明它們的真菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大。PCoA分析表明，地膜、除草劑和火焰處理等農(nóng)藝措施在一定程度上均會改變土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，且土壤真菌群落構(gòu)成的組間差異明顯大于組內(nèi)差異。

2.3 ?不同處理對真菌門水平群落組成的影響

根據(jù)物種注釋結(jié)果，生成土壤真菌在門水平上的物種相對豐度柱狀堆積圖（圖2）。如圖所示，不同處理的土壤真菌TOP10的菌門分別為：擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、隱菌門（Rozellomycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）、新麗鞭毛菌門（Neocallimastigomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）和芽枝霉門（Blastocladiomycota）。其中優(yōu)勢菌門（相對豐度大于10%）為Basidiomycota、Ascomycota和Mortierellomycota，三者相對豐度之和占到了各組總測序豐度的65.84%～82.57%，與CK相比，T1、T4以及T5均顯著降低了Basidiomycota的相對豐度;T3、T4和T5均使Ascomycota的相對豐度顯著升高;Mortierellomycota的豐度在各處理間差異均未達顯著水平。

2.4 ?不同處理對真菌屬水平群落組成的影響

如圖3所示，根際真菌在屬水平上優(yōu)勢菌屬（相對豐度大于1%）分別為田頭菇屬（Agrocybe）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、糞傘屬（Bolbitius）、被孢霉屬（Mortierella）、Saitozyma、鐮刀菌屬（Fusarium）和Papiliotrema，共占根際真菌群落的31.5%～56.1%。在優(yōu)勢屬中，和CK相比，T2處理顯著降低了Agrocybe、Penicillium和Fusarium的相對豐度;T3處理使Trichocladium、Penicillium和Aspergillus的相對豐度顯著升高，使Bolbitius、Mortierella和Fusarium的相對豐度顯著降低;T5處理顯著降低了Agrocybe、Bolbitius、Saitozyma、Fusarium和Papiliotrema的相對豐度，顯著提高了Trichocladium和Mortierella的相對豐度;T1處理顯著降低了

Agrocybe、Bolbitius和Fusarium的相對豐度;T4處理顯著降低了Agrocybe、Bolbitius和Fusarium的相對豐度，顯著提高了Trichocladium和Penicillium的相對豐度。此外，T5和T6處理對比可知，與中檔火力的火焰處理相比，高檔火力顯著降低了Trichocladium、Penicillium和Mortierella的相對豐度，顯著提高了Bolbitius的相對豐度。

2.5 ?不同農(nóng)藝措施對土壤真菌營養(yǎng)型及功能群的影響

根據(jù)FUNGuild對不同農(nóng)藝措施處理的土壤真菌群落的營養(yǎng)型（Trophic mode）和功能群（Guild）進行鑒定分類，將檢測出的2547個OTU（可操作分類單位）按照營養(yǎng)方式劃分為三大類型，分別為共生營養(yǎng)型（symbiotroph）、腐生營養(yǎng)型（saprotroph）

和病理營養(yǎng)型（pathotroph），統(tǒng)計同時含多種復(fù)合營養(yǎng)型和功能群的真菌類群可知，本研究共有8種營養(yǎng)型（圖4），總共檢測出42種功能群，針對豐度較高的8種主要功能群進行分析（圖5）。

如圖4所示，煙草旺長期，土壤真菌以腐生營養(yǎng)型為主，其相對豐度占總量的30.88%～55.51%，且CK處理的腐生營養(yǎng)型真菌豐度顯著高于T2處理。對于共生營養(yǎng)型真菌而言，各處理中沒有觀察到CK和T1～T5處理間的顯著差異。和CK相比，T1、T3和T4處理中病理營養(yǎng)型真菌的相對豐度顯著降低，而T5處理的病理營養(yǎng)型真菌顯著升高。此外，T5和T6對比可知，與中檔火力的火焰處理相比，高檔火力火焰處理顯著降低了土壤中腐生營養(yǎng)型和病理營養(yǎng)型真菌的相對豐度。

鑒定土壤中的真菌功能群，并對三大營養(yǎng)型的優(yōu)勢功能群進行分析比較（圖5）。土壤中病理營養(yǎng)型真菌的主要功能群為動物病原菌（Animal Pathogen）和植物病原菌（Plant Pathogen）（圖5a）。和CK相比，T1～T5處理的土壤植物病原菌豐度均顯著下降;T1～T4處理的動物病原菌數(shù)量顯著降低，而T5處理的動物病原菌豐度明顯升高;此外，與中檔火力的火焰處理相比，高檔火力顯著降低了動物病原菌數(shù)量。對于腐生營養(yǎng)型真菌而言，優(yōu)勢功能群分別為土壤腐生真菌（Soil Saprotroph）、糞腐真菌（Dung Saprotroph）和未定義的土壤腐生菌（Undefined Saprotroph）（圖5b）。除T3外，各處理的土壤腐生真菌和糞腐生真菌數(shù)量均顯著低于CK處理;比較T5和T6的腐生營養(yǎng)型真菌的優(yōu)勢功能群可知，高檔火力的火焰處理和中檔火力的火焰處理的優(yōu)勢腐生菌數(shù)量差異均未達顯著水平。由圖5c可知，CK處理的內(nèi)生菌（Endophyte）和動物外生菌（Animal Endosymbiont）和各處理相比差異不顯著，但植物外生菌（Ectomycorrhizal）豐度顯著高于T1、T3、T4和T5處理。與中檔火力的火焰處理相比，高檔火力的火焰處理顯著提高了植物外生菌的數(shù)量。

此外，由于FUNGuild數(shù)據(jù)庫的局限性，未被鑒定分類的OTU也不能忽略，因為它們的相對豐度占總量的比例相對較高，達37.52%～60.82%。

3 ?討 ?論

3.1 ?除草劑對植煙土壤真菌群落及功能的影響

本研究結(jié)果表明，與對照處理相比，除草劑未顯著影響土壤真菌群落α多樣性，但顯著改變土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。姚斌等^[4]研究認為，除草劑施入土壤可能會使土壤微生物可利用的碳源種類發(fā)生改變，由于除草劑污染的土壤中真菌等微生物對碳源的利用能力不同，可能使微生物群落內(nèi)部種群的相互關(guān)系發(fā)生變化，原有的平衡遭受破壞，優(yōu)勢類群改變，從而造成群落差異。

煙田施用除草劑能顯著降低土壤中田頭菇屬、青霉菌屬和鐮刀菌屬的相對豐度。田頭菇屬和青霉菌屬真菌大多為腐生真菌，其中青霉屬真菌是導(dǎo)致煙葉霉變的重要組分之一^[5];鐮刀菌屬真菌是一種常見的煙草病原微生物，某些種可通過侵染煙草根系，傷害煙草的根系組織和維管束組織危害煙草，從而引發(fā)煙草根腐病^[6]。因此，可以認為，除草劑的施用可以降低烤煙根腐病的病害風(fēng)險，也可能會減少煙葉霉病的發(fā)生率。

FUNGuild分析顯示，施用除草劑的土壤中腐生營養(yǎng)型真菌數(shù)量顯著下降，其優(yōu)勢功能群土壤腐生真菌和糞腐生真菌數(shù)量和對照處理相比差異均達顯著水平;此外，土壤中病理營養(yǎng)型真菌的優(yōu)勢功能群植物病原菌和動物病原菌的數(shù)量也顯著減少。腐生真菌可以通過降解死亡的宿主細胞獲取養(yǎng)分，與有機物分解和養(yǎng)分循環(huán)密切相關(guān)^[7];還可以產(chǎn)生一系列水解酶和氧化酶，有助于碳水化合物的分解，增加土壤有機質(zhì)養(yǎng)分^[8]。因此，施用除草劑使土壤中腐生真菌豐度下降，可能導(dǎo)致土壤養(yǎng)分循環(huán)和有機質(zhì)分解速率減弱。

3.2 ?地膜對植煙土壤真菌群落及功能的影響

劉岳飛等^[9]研究指出地膜不同程度地提高土壤微生物碳、氮、磷等養(yǎng)分狀況。本研究發(fā)現(xiàn)，地膜未改變土壤真菌菌群α多樣性指數(shù);但會使真菌群落的β多樣性發(fā)生明顯變化。覆膜處理后，由于地膜具有提高地溫、涵養(yǎng)水分以及加速有機質(zhì)分解和提高養(yǎng)分利用率等作用，微生物生長環(huán)境得到一定改善，微生物種內(nèi)競爭和種間競爭、微生物和作物對養(yǎng)分和水分的競爭等減弱，使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定趨于一致化發(fā)展，從而使對照處理和覆膜處理土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異。

對土壤優(yōu)勢真菌屬豐度分析可知，覆膜處理后鐮刀菌屬相對豐度顯著降低可能使烤煙患根腐病的風(fēng)險下降。此外，F(xiàn)UNGuild分析顯示，覆膜處理顯著減少土壤中病理營養(yǎng)型真菌的數(shù)量，其優(yōu)勢功能群植物病原菌和動物病原菌的相對豐度均顯著降低。病理營養(yǎng)型真菌通過損害宿主細胞而獲取營養(yǎng)，土壤中病理營養(yǎng)型真菌對植物的生長具有一定負面影響^[10]。綜上所述，覆膜處理可以通過降低土壤中病理營養(yǎng)型真菌的數(shù)量而降低烤煙患真菌病害的風(fēng)險。

3.3 ?火焰高溫處理對植煙土壤真菌群落及功能的影響

與對照相比，中檔火力火焰處理能顯著降低田頭菇屬、糞傘屬、鐮刀菌屬的相對豐度，顯著提高青霉菌屬和被孢霉屬等的相對豐度。被孢霉屬真菌能分解有機物質(zhì)，促進植物根系吸收礦質(zhì)元素，此外它還具有潛在分泌抗菌素的能力，能抑制病原菌，如鐮刀菌屬^[11-12]。因此，可以認為中檔火力火焰處理能降低烤煙患根腐病的發(fā)病率，還有利于煙株根系對土壤礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收。

此外，由于高檔火力火焰處理病原菌數(shù)量顯著低于中檔火力火焰處理，其患真菌病害的可能性低于中檔火焰處理;但與中檔火力火焰處理相比，高檔火力火焰處理的土壤中與土壤礦質(zhì)養(yǎng)分吸收正相關(guān)的被孢霉屬以及與促進有機質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)正相關(guān)的腐生真菌和外生菌數(shù)量的減少可能會影響烤煙對有效養(yǎng)分的吸收利用。

4 ?結(jié) ?論

試驗結(jié)果表明，不同農(nóng)藝措施土壤真菌優(yōu)勢屬的相對豐度差異顯著。除草劑、地膜和火焰處理等農(nóng)藝措施不影響土壤真菌的α多樣性指數(shù)，但顯著影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性。與對照相比，覆蓋地膜和中、高檔火焰處理的土壤中病理營養(yǎng)型真菌豐度顯著降低，烤煙患真菌病害的風(fēng)險下降。此外，與中檔火力火焰處理相比，高檔火力火焰處理在一定程度上降低土壤有效養(yǎng)分循環(huán)和有機質(zhì)分解，且增加用氣量;施除草劑的土壤中烤煙真菌病害的發(fā)病風(fēng)險下降，但由于土壤腐生真菌的減少，不利于土壤有機質(zhì)的分解。綜上所述，中檔火焰除草方式及覆膜處理對土壤真菌群落及功能無顯著不利影響，且能降低煙草真菌病害。

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