賴盈盈，周鮮嬌

（嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048）

葛根（Puerarin）屬豆科植物野葛的塊根，是國家衛(wèi)生部認定的兼具藥用與食用的植物[1]，主要成分為淀粉，含有必需氨基酸和微量元素，還含有葛根素、異黃酮和大豆苷元等多種益生元素，可改善心血管循環(huán)，降低血糖和增強機體免疫力等[2-6]，因而各種葛根功能產品（葛根面條、葛根蛋糕、葛根豆腐、葛根口服液和葛根酸奶）應運而生[7]。酸奶營養(yǎng)豐富，益生菌含量多，易被人體吸收，能有效調節(jié)人體腸道微生物菌群[8-10]。單純的原味酸奶具有口感單一和益生功能少等特點，因而添加了糧食和果蔬等含糖量低、脂肪含量低、熱量低的多口感多益生功能型酸奶必將成為國內外酸奶市場消費的主導[11-13]。在葛根酸奶制作方面，張雁等[14]制作葛根酸奶采用新鮮葛根為材料，經一系列操作后過濾得葛根汁，不僅操作繁瑣，過濾過程中也會導致葛根營養(yǎng)物質流失，利用率降低；冷桂華等[15]制作葛根酸奶時除了護色劑以及穩(wěn)定劑外，還用多種酶對新鮮葛根進行處理，不僅操作過程繁瑣，還添加了過多的物質，本實驗采用葛根粉為原料，在制作過程中直接加入，不需要過多步驟，簡單易操作。

本實驗以易獲得的葛根粉作為原材料，通過單因素試驗及響應面法探索葛根酸奶的制作工藝，并檢測其理化和微生物指標以及抗氧化性。旨在為葛根酸奶的市場化供應提供科學的理論依據，并且為家庭自制葛根酸奶提供科學的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根粉：購于江西撫州農家；德運全脂奶粉和白砂糖：市售；川秀乳酸菌酸奶發(fā)酵粉（保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）∶嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（1∶1）：市售。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、30%過氧化氫、七水合硫酸亞鐵、無水乙醇、水楊酸（均為分析純）：南寧西隴化工有限公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基：北京奧博星制造生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、HHS-21-4W型電熱恒溫水浴鍋、YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD型潔凈工作臺：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SQP型電子分析天平：賽多利斯科學有限公司；BCD-402WDBA型海爾冰箱：青島海爾股份有限公司；V-1800型可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；WYT糖度計：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；LL550型離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根酸奶制作工藝流程及操作要點

操作要點：葛根粉加少量冷水溶解，加入熱水，煮沸至透明成糊狀；全脂奶粉與白砂糖加少量溫水溶解后，加入葛根液后充分攪拌；將葛根奶液于100 ℃殺菌并均質8 min，冷卻至室溫，得無菌葛根奶液；菌粉用少量無菌水溶解，待葛根奶液冷卻后加入；將接種后的無菌葛根奶液置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h至完全凝固，于4 ℃冰箱冷藏24 h進行后熟得到葛根酸奶。

1.3.2 單因素試驗設計

單因素設置5個變量：奶粉添加量4%、6%、8%、10%、12%、白砂糖添加量4%、6%、8%、10%、12%、葛根粉添加量1%、2%、3%、4%、5%、發(fā)酵溫度40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、發(fā)酵時間3 h、4 h、5 h、6 h、7 h，以感官評分為評價指標，選出最優(yōu)的工藝參數。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗設計

根據單因素試驗結果，通過Plackett-Burman（PB）試驗和最陡爬坡試驗確定葛根粉添加量、全脂奶粉添加量和發(fā)酵時間3個較為重要的影響因子為試驗因素，利用Design-ExpertV.10對響應面試驗進行設計。葛根酸奶感官評分為響應值進行響應面分析，得到葛根酸奶3個顯著因素交互作用的等高線圖和響應面，并根據對等高線及響應面的分析進行試驗優(yōu)化。Box-Behnken試驗設計因素與水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.4 酸奶品質分析

（1）感官評定

隨機選取10位同學組成評價小組對葛根酸奶進行感官評分，參照GB/T 19302—2016《食品安全國家標準發(fā)酵乳》[16]，從組織形態(tài)、口感、風味對葛根酸奶進行評分，滿分100分。以感官評分平均值為評價指標，評分標準如表2所示。

表2 葛根酸奶感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of Pueraria yogurt

（2）理化指標及微生物指標檢測

酸度：按照GB 5413.34—2010《食品安全國家標準乳和乳制品酸度的測定》[17]中的方法測定。

糖度：酸奶于離心機4 500 r/min離心10 min，取上清液，并用糖度計測量自制葛根酸奶與市售酸奶的糖度。

乳酸菌數：按照GB/T 4789.35—2016《食品安全國家標準乳酸菌檢驗》[18]中的方法測定。

大腸桿菌：按照GB/T 4789.3—2008《食品衛(wèi)生生物學檢驗大腸桿菌計數》[19]中的方法測定。

1.3.5 酸奶抗氧化性測定

（1）DPPH自由基清除率測定

酸奶于離心機4 500 r/min離心10 min，取上清液備用。參考張玉坤[20]的方法測定葛根酸奶對DPPH自由基的抗氧化性，以維生素C（vitamin C，VC）作為陽性對照。

（2）羥自由基清除率測定

酸奶于離心機4 500 r/min離心10 min，取上清液備用。參考王臨賓[21]的方法測定葛根酸奶對羥自由基的抗氧化性，以2 mg/L的VC作為陽性對照。

1.3.6 數據處理

采用Excel 2010進行單因素試驗的繪圖；運用Design-Expert 10.0.3進行PB試驗、響應面試驗設計、結果和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 葛根粉添加量的確定

葛根粉添加量對酸奶品質的影響見圖1。由圖1可知，葛根酸奶感官評分隨葛根粉的添加量在1%～5%范圍內的增加先上升后下降，原味酸奶風味偏淡，葛根粉添加量1%時葛根味道不明顯；添加4%時葛根獨特香味、凝乳好、具濃郁的酸奶風味，葛根粉添加量5%時酸奶較粗糙，過于黏稠。因此，添加4%的葛根粉時評分最佳。

圖1 葛根粉添加量對酸奶感官品質的影響Fig.1 Effect of Pueraria powder addition on yogurt sensory quality

2.1.2 奶粉添加量的確定

奶粉添加量對酸奶品質的影響見圖2，由圖2可知，葛根酸奶感官評分隨奶粉添加量在4%～12%范圍內的增加先上升后下降，奶粉添加量＜8%時，酸奶風味不濃郁，凝乳不均勻；奶粉添加量為8%時，酸奶味濃郁，具有葛根清香，粘稠適中，凝乳均勻，口感細膩，感官評分為86；奶粉添加量＞8%時，酸奶過于黏稠，口感粗糙。因此，添加8%奶粉時感官最佳。

圖2 奶粉添加量對酸奶感官品質的影響Fig.2 Effect of milk powder addition on yogurt sensory quality

2.1.3 白砂糖添加量的確定

圖3 白砂糖添加量對酸奶感官品質的影響Fig.3 Effect of sugar addition on yogurt sensory quality

白砂糖添加量對酸奶品質的影響見圖3。由圖3可知，葛根酸奶感官評分隨白砂糖添加量在4%～12%范圍內的增加先上升后下降。葛根粉添加量為6%時，酸奶黏稠度恰好，酸奶味濃郁且具有葛根清香，酸甜度適中；添加量低于6%，酸奶味道不濃郁，甜味不明顯；添加量增至8%時，酸奶過甜，稠厚感差。因此，6%的白砂糖添加量最為合適。

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對酸奶品質的影響見圖4。由圖4可知，葛根酸奶感官評分隨發(fā)酵溫度的增加先升高后降低。高于42 ℃時，酸奶口感潤滑度下降，部分產生少量乳清；溫度為42 ℃時，酸奶口感最佳；低于42 ℃時，葛根酸奶，凝乳不均勻，酸奶風味不濃郁。因此，最佳發(fā)酵溫度為42 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對酸奶感官品質的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on yogurt sensory quality

2.1.5 發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對酸奶品質的影響結果見圖5。由圖5可知，葛根酸奶感官評分隨發(fā)酵時間的增加先上升后下降，高于5 h時，酸奶過于黏稠，部分產生少量乳清；時間為5 h時，酸奶口感細膩，酸甜適中；發(fā)酵時間低于5 h時，酸奶過稀。因此，最佳發(fā)酵時間為5 h。

圖5 發(fā)酵時間對酸奶感官品質的影響Fig.5 Effect of fermentation time on yogurt sensory quality

2.2 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman試驗是指在較少的試驗次數下，從多因素試驗中篩選出影響比較顯著的因素[22]。表3為PB試驗設計以及感官評分結果，以感官評分（Y）為響應值得出的響應面結果如表4。對表4進行分析可以得出，模型P=0.039 3＜0.05，具顯著性，說明模型在統(tǒng)計學上有意義。5個因素中，對葛根酸奶品質的影響為奶粉添加量＞發(fā)酵時間＞葛根粉添加量＞發(fā)酵溫度＞白砂糖添加量。由系數估值可知，A、C、D、E為正效應，B為負效應。結合各因素P值以及正負效應，選擇葛根粉添加量、奶粉添加量和發(fā)酵時間這3個顯著性較強的因子進行最陡爬坡試驗。

表3 Plackett-Burman試驗設計Table 3 Design of Plackett-Burman tests

表4 Plackett-Burman試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of Plackett-Burman tests

2.3 最陡爬坡試驗

表5 最陡爬坡試驗結果Table 5 Results of the steepest climbing tests

由各因素的P值可得影響較大的因素為：奶粉添加量、發(fā)酵時間和葛根粉添加量；正負效應影響爬坡的方向和步長；由系數估值可得，葛根粉添加量和發(fā)酵時間為正效應，奶粉添加量為負效應。設置五個試驗進行感官評分。由表5可知，感官評分最高的是試驗號1，為88分。所以以葛根粉添加量4%、奶粉添加量8%、發(fā)酵時間5 h為最佳結果作為Box-Behnken試驗設計的中心點展開試驗。

2.4 響應面優(yōu)化試驗

在PB試驗和最陡爬坡試驗的基礎上，響應面試驗選取的三個因素為：葛根添加量（A）、奶粉添加量（B）以及發(fā)酵時間（E），以感官評分（Y）為響應值，利用Design-Expert.V.10軟件進行Box-Behnken試驗設計，響應面試驗分析結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 響應面試驗設計與結果Table 6 Design and results of response surface tests

表7 響應面試驗結果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface tests results

續(xù)表

通過對表6的試驗數據進行三元二次回歸擬合，得到響應面回歸模擬方程：Y=+89.00-2.12A+2.38B+1.25E+3.75AB+0.50AC-0.50BE-4.38A2-8.88B2-6.62E2。從表7可得，該模型的P=0.0003＜0.001，極顯著，則該模型具有統(tǒng)計學意義；失擬項P=0.0625＞0.05，不顯著；回歸方程決定系數R2=0.962 4，這都說明二次回歸模型擬合度良好；調整決定系數R2Adj=0.914 0，說明該模型能解釋91.40%響應值的變化，即試驗得出的葛根酸奶發(fā)酵方案可用；變異系數（coefficientofvariation，CV）%=2.67%，較低，表明該模型的精確度較高。

各因素的交互作用對酸奶感官評分的影響見圖6。如圖6所示，兩兩因素之間對酸奶品質影響的響應面圖和等高線圖均存在最大值。葛根粉添加量與奶粉添加量的交互作用較強，對葛根酸奶品質的影響顯著。葛根粉添加量和發(fā)酵時間、奶粉添加量和發(fā)酵時間兩兩因素的交互作用較弱，但存在最大響應值，等高線為圓形，對葛根酸奶品質的影響不顯著。

圖6 各因素交互作用對葛根酸奶感官評分的響應面圖和等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory score of Pueraria yoghurt

根據Design-Expert V.10對實驗的數據分析，依據得出的模型擬合結果，本實驗的最佳工藝參數為：葛根添加量3.801%，奶粉添加量8.179%，發(fā)酵時間5.084 h，感官評分預測值為89.37分?？紤]到操作的便利性，葛根酸奶發(fā)酵工藝參數修訂為：葛根粉添加量3.8%，奶粉添加量8.2%，發(fā)酵時間5 h。以最佳發(fā)酵參數進行驗證試驗，結果葛根酸奶感官評分的實際值均值為90分，與預測值89.37分相差不大，表明該二次回歸模型擬合度較好，也說明了通過響應面法可以優(yōu)化葛根酸奶的配方，其回歸方程也能夠有效地對葛根酸奶的配方進行分析與預測。

2.5 葛根酸奶品質檢測結果

2.5.1 感官評價

本實驗優(yōu)化得出的最佳方案制作的葛根酸奶呈乳白色，組織細膩，口感佳，酸奶味濃郁且具有葛根清香，酸甜適中，無乳清析出，不存在分層、氣泡，感官評分為90分。

2.5.2 理化與微生物指標

最優(yōu)發(fā)酵方案制得的葛根酸奶酸度為72°T；糖度為8.6%，符合現今社會追求的低糖食物風尚；乳酸菌數為1.3×108CFU/mL，大腸桿菌未檢出。以上理化及微生物指標檢測結果均符合相關國家標準。

2.6 葛根酸奶抗氧化性檢測結果

將葛根酸奶，2 mg/L VC以及原味酸奶對DPPH自由基、羥基自由基清除率進行測定，結果見圖7。由圖7可知，酸奶均具有抗氧化性，但葛根酸奶總體上抗氧化性能強于原味酸奶，但比2 mg/L的VC的抗氧化性能弱。

圖7 不同樣品對DPPH自由基（A）、羥自由基（B）的清除率Fig.7 Scavenging rate of different samples on DPPH (A) and hydroxyl radicals (B)

3 結論

本次實驗優(yōu)化的葛根酸奶組織細膩，口感佳，酸奶味濃郁且具有葛根清香，酸甜適中，無乳清析出，響應面優(yōu)化后，感官評分達到90，與預測值相近。葛根酸奶的酸度為72°T，糖度為8.6%，乳酸菌數為1.3×108CFU/mL，大腸桿菌未檢出。以上檢測結果均符合各項相對應的國家標準；葛根酸奶清除DPPH自由基以及羥自由基的能力高于自制原味酸奶，由此說明葛根酸奶是一種值得開發(fā)的益生乳品。