王小平，黃永光 *，周文美

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

酒曲起源于中國，被譽為中國第五大發(fā)明，曲乃酒之骨，曲的種類決定了酒的香型和風(fēng)格，酒曲在白酒發(fā)酵過程中主要作為糖化發(fā)酵劑，提供微生物動力、酶動力和風(fēng)味前體物，對白酒品質(zhì)和風(fēng)味提升尤為重要，因此就有了“醅作肉，水作血，曲為骨”的說法。中國酒曲的分類繁多，根據(jù)大曲在曲房中能達到的最高培養(yǎng)溫度，一般將大曲分為高溫曲、中溫曲和低溫曲。

高溫大曲是醬香白酒的糖化發(fā)酵劑，曲中風(fēng)味前體物質(zhì)和特有的微生物體系形成了醬香型白酒的特有風(fēng)格：醬香突出、幽雅細膩、酒體醇厚、空杯留香持久。高溫大曲的制曲溫度最高可達60～70 ℃，使得大曲中霉菌和酵母數(shù)量減少，細菌數(shù)量相對增多。研究表明，細菌在高溫大曲中的作用主要是產(chǎn)香，是形成醬香型白酒典型香氣特性的主要菌群。因此，對醬香型大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及其功能性進行研究，有助于提高對醬香型大曲的制曲機理的認識，從而對制曲過程進行調(diào)控，對大曲的品質(zhì)以及醬香型白酒的品質(zhì)提升具有重要作用。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，對醬香型大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性及功能性的研究方法、研究結(jié)果進行歸納總結(jié)，以期對醬香型大曲中細菌的研究提供參考。

1 醬香型大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性

醬香型白酒釀造工藝獨特，整個生產(chǎn)周期需經(jīng)歷二次投料，八輪次發(fā)酵，七次蒸酒，長期陳釀，精心勾兌而成[1]。其高溫制曲是醬香大曲制作的一大特色，其制作特點是水分多和溫度高，從而使在整個大曲制作過程中，細菌數(shù)量總體增加。霉菌與酵母由于受制曲環(huán)境的影響，使得兩者在大曲中的含量減少。由此可見，細菌在醬香型大曲中的作用至關(guān)重要，研究醬香大曲細菌菌群多樣性對于后期解析產(chǎn)醬香的獨特風(fēng)味的作用機制提供理論基礎(chǔ)。而常用的研究方法主要包括：傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)與免培養(yǎng)分離技術(shù)。這兩種分離技術(shù)的目的旨在解析大曲中的微生物菌群結(jié)構(gòu)，都各有其獨特的特點，且具有互補的作用。

1.1 傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)研究醬香型大曲細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

1.1.1 傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)

傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)主要是將樣品中的微生物分離純化后，根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化特性或遺傳特性確定其種屬。在篩選過程中運用直接鏡檢法或平板培養(yǎng)菌落計數(shù)法對篩選出的目標(biāo)菌株進行統(tǒng)計分析，由于固態(tài)基質(zhì)對微生物細胞的吸附作用、固態(tài)基質(zhì)顆粒對鏡檢的干擾使得直接鏡檢計數(shù)不完全；此外，平板菌落計數(shù)由于培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的差異也會造成微生物計數(shù)差異。雖然該技術(shù)在研究白酒微生物的結(jié)構(gòu)多樣性及其數(shù)量變化中運用較為廣泛[2-3]，但是該方法耗時、耗力、分離不完全、易受人為因素的影響和環(huán)境條件的限制。研究表明，運用傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)僅能分離出1%～5%的微生物[4]。因此，該技術(shù)對單一樣品中某類微生物進行針對性的篩選運用得較多，若要對整個樣品中的微生物結(jié)構(gòu)多樣性進行分析，選用可培養(yǎng)分離技術(shù)不能達到此目的，還需借助新的技術(shù)方法和手段。

1.1.2 傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)研究醬香型大曲細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的現(xiàn)狀

近年研究發(fā)現(xiàn)，運用傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)從醬香大曲中分離得到的多數(shù)是芽孢桿菌（Bacillus）群，具體研究情況見表1。

表1 傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)研究細菌多樣性的現(xiàn)狀Table 1 Research status of bacterial diversity by traditional culture-dependent techniques

綜上所述，運用傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)對醬香型大曲細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)多數(shù)為耐高溫的芽孢桿菌屬、少數(shù)微球菌屬、葡萄球菌屬、費氏鏈霉菌屬等細菌類群。芽孢桿菌屬在醬香型大曲中的數(shù)量相對其他細菌屬較多，因為大多數(shù)芽孢桿菌能在高溫、高鹽、偏酸、高濕等貧瘠的環(huán)境中生長繁殖，代謝產(chǎn)生高溫蛋白酶、淀粉酶類，輔助霉菌降解大曲中的原料，并生成多種游離氨基酸，在發(fā)酵過程中形成一系列復(fù)雜反應(yīng)，產(chǎn)生獨特的醬香風(fēng)味。但是在制曲過程中可變因素很多，制曲環(huán)境、工藝參數(shù)等也會影響芽孢桿菌的種類，從而影響整個大曲中的細菌菌群。

1.2 免培養(yǎng)分離技術(shù)對醬香型大曲細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性研究

1.2.1 免培養(yǎng)分離技術(shù)

近年，免培養(yǎng)技術(shù)在研究濃香型、清香型白酒釀造過程中微生物結(jié)構(gòu)多樣性方面的運用最為普遍，而對醬香型大曲、環(huán)境、酒醅等微生物多樣性的研究也慢慢興起。目前，在研究白酒釀造過程中微生物多樣性所運用的分子生物學(xué)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、高通量測序技術(shù)、克隆文庫法、熒光原位雜交法、限制性酶切片段長度多態(tài)性法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性或溫度梯度凝膠電泳法（ploymerase chain reaction and denaturing/temperature gredient gel electrophoresis，PCR-DGGE/TGGE）等。為了擺脫傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)的束縛，免培養(yǎng)技術(shù)能夠更客觀的探索樣品中的微生物結(jié)構(gòu)且從遺傳特性上較客觀的分析樣品中的微生物群落，并能精確地揭示微生物種類和遺傳多樣性。本文基于近年運用免培養(yǎng)技術(shù)在醬香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究現(xiàn)狀，簡單的介紹了PCR-DGGE技術(shù)、高通量測序技術(shù)及16S rDNA克隆文庫技術(shù)的基本原理、特點及其技術(shù)手段。

（1）PCR-DGGE技術(shù)

DGGE在20世紀(jì)80年代初期由MYERS R M等[15-16]發(fā)明，主要用于檢測脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段中的點突變[15-16]。其基本原理基于一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳，在此基礎(chǔ)上，加入梯度變性劑，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開。

MUYZER G等[17]在1993年首次將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于解析各生態(tài)系統(tǒng)中的細菌或古細菌、真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性[18]。該技術(shù)直接從樣品中抽提宏基因組，不需要進行培養(yǎng)，且能檢測到難以培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物[19]；其次，該技術(shù)檢測快速、精確、直觀。但是此方法只能分析500個堿基對以下的DNA片段，只有系統(tǒng)中1%以上的微生物種群能被檢測出，系統(tǒng)中的弱勢菌群不能或者難以被檢測到，且在PCR引物設(shè)計擴增某些特定菌群時，微生物群落結(jié)構(gòu)組成會因為部分菌群序列間的同源性差異明顯使得群落組成結(jié)果被高估，同時，有些細菌具有多個拷貝的核糖體核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）操縱單元也會使得其群落組成被高估。

（2）高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)是在第一代測序技術(shù)（即Maxam-Gilbert和Sanger測序技術(shù)）的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的[20]，其與傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)相比能快速地進行序列分析，且分析的序列數(shù)量大、同時能檢測到一些弱勢菌群以及一些不可培養(yǎng)的微生物，使得檢測更為全面、精確度高、通量大。高通量測序技術(shù)流程包括樣品采集、核酸序列的提取及純化、文庫構(gòu)建、測序、原始序列信息比對注釋、數(shù)據(jù)處理等[20-24]。高通量測序技術(shù)的基本原理基于其測序平臺的不同而有所差異，目前，運用的測序平臺主要有Roche 454焦磷酸測序平臺、Illumina測序平臺、SOLiD測序平臺、Ion Torrent測序平臺和PacBio SMRT測序平臺[25]。其中Roche 454和Illumina測序平臺在研究白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性方面較為廣泛。

高通量測序所檢測到的原始序列需進行總體分析后再利用基因數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，進一步確定其微生物分類學(xué)地位。常用的分析方法有聚類分析、判別分析、排序分析、相關(guān)性分析和差異性分析等[26]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在研究白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性常用的數(shù)據(jù)分析方法有主成分分析（principal component analysis，PCA）、典型相關(guān)分析（canonical correlation analysis，CCA）及相對豐度熱圖。由于高通量測序所得到的測序數(shù)據(jù)量大從而限制研究者對其數(shù)據(jù)進行有效數(shù)據(jù)的篩選，其基因文庫的構(gòu)建及測序方法也會因為引物退火溫度不當(dāng)、模板DNA代表性不強等導(dǎo)致引入系統(tǒng)偏差和隨機性，從而使樣本中核酸分子含量與實際樣品含量有偏差。因此，對高通量測序技術(shù)所要達到的測序要求越來越高，即在降低成本的情況下達到對樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性更深入、更精確、更全面的分析與研究。

（3）16S rDNA克隆文庫技術(shù)

16S r DNA 克隆文庫技術(shù)是直接從分子水平上研究微生物的結(jié)構(gòu)，在解析復(fù)雜環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)中能更可靠、更直接的反應(yīng)細菌群落的構(gòu)成及多樣性。其基本原理是基于微生物群落16S rRNA基因片段的克隆表達構(gòu)建文庫，從而推測樣品中微生物的分類學(xué)地位，該技術(shù)成熟，便于操作。但是因為其操作步驟較為繁瑣，工作量較大，導(dǎo)致獲得的能夠反映微生物宏基因組的信息量較為局限，主要以優(yōu)勢菌群為主，從而出現(xiàn)物種豐度被高估以及微生物群落大小與多樣性的可能性被低估[27]。如若只解析樣品中微生物群落的優(yōu)勢菌群，選用此技術(shù)能夠很好地達到此目的。

1.2.2 免培養(yǎng)分離技術(shù)研究醬香型大曲細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的現(xiàn)狀

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)不斷發(fā)展，免培養(yǎng)分離技術(shù)被廣泛運用到菌種鑒定中。與傳統(tǒng)可培養(yǎng)相比，免培養(yǎng)分離技術(shù)能夠快速、精確地鑒定出微生物，同時能夠發(fā)現(xiàn)新的微生物種類。目前，運用免培養(yǎng)分離技術(shù)分析白酒釀造過程中的細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性多見于濃香型白酒，而對醬香型白酒釀造過程中細菌菌群的研究較少，多見于酒醅、堆積、窖池中微生物菌群的研究。黃蘊利等[28]運用高通量測序技術(shù)從醬香型白酒第二輪次酒堆積過程中共檢測到細菌屬138個；窖池發(fā)酵過程中共檢測到細菌屬262個。郭敏等[29]同樣運用高通量測序技術(shù)從醬香型白酒3輪次酒醅中檢測到特有細菌屬9個，而從7輪次酒醅中檢測到特有細菌屬8個。采用免培養(yǎng)分離技術(shù)對醬香型大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)研究的現(xiàn)狀見表2。

以上研究表明，從醬香型大曲中主要檢測到厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍藻門、梭桿菌門、擬桿菌門等的細菌屬，其中厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門在醬香大曲中占主導(dǎo)地位。其次，免培養(yǎng)分離技術(shù)還檢測到Uncultured Propionibacteriaceae bacterium、UnculturedWeissellasp.、UnculturedCyanobacterium等不可培養(yǎng)的細菌菌群以及棒狀桿菌屬、魏斯氏菌屬等稀有細菌屬。與傳統(tǒng)可培養(yǎng)相比，更能全面地分析醬香大曲細菌多樣性。但是在研究大曲中微生物的功能屬性時，還需借助可培養(yǎng)技術(shù)。兩種技術(shù)聯(lián)用互補對解析微生物的結(jié)構(gòu)與功能特性更全面。但是通過免培養(yǎng)分離技術(shù)檢測出的細菌類群多數(shù)只能確定其屬水平，無法確定到種。此外，檢測到的一些不可培養(yǎng)的微生物在白酒釀造中的生物學(xué)特性及功能特性還需深入探討。

表2 免培養(yǎng)分離技術(shù)研究醬香型白酒大曲細菌多樣性的現(xiàn)狀Table 2 Research status of bacterial diversity of Moutai-flavor Baijiu Daqu by culture-independent technique

2 醬香型大曲細菌菌群功能特性研究方法

好曲產(chǎn)好酒，曲自然離不開微生物的作用。而茅臺酒采用的就是典型的細菌曲，成品高溫曲中細菌數(shù)量達90%以上，且多數(shù)為嗜熱芽孢桿菌，因而醬香型白酒主體香味主要通過這些微生物代謝產(chǎn)生的醬香物質(zhì)或醬香前體物質(zhì)形成的[37-38]。因此，深入研究醬香型大曲中細菌的產(chǎn)酶特性、產(chǎn)香特性，對解析醬香型白酒獨特風(fēng)味的形成機制具有重要的指導(dǎo)意義。

2.1 醬香型大曲細菌產(chǎn)酶特性研究

醬香型大曲細菌產(chǎn)酶的研究主要體現(xiàn)在其產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖溶酶、糖化酶、脂肪酶和漆酶等特性。常用的研究方法主要是根據(jù)其具體的酶學(xué)特性而有所不同。比如α-淀粉酶的測定采用淀粉-碘液平板法、蛋白酶測定普遍采用酪蛋白平板法、纖溶酶活力測定采用血纖維蛋白平板法。但是此類方法只能初步確定其酶學(xué)特性，不能得知其產(chǎn)酶量。另一種方法是在上述方法的基礎(chǔ)上，采用特定酶的發(fā)酵培養(yǎng)基或?qū)⒛繕?biāo)菌株直接進行固、液發(fā)酵一段時間，再運用國標(biāo)測定酶的方法進行產(chǎn)酶特性研究，通常用酶活力單位表示。該方法能夠確定目標(biāo)菌株在某一特定條件下轉(zhuǎn)化底物所需的酶量。

在醬香型白酒發(fā)酵體系中，對產(chǎn)酶細菌的研究主要以芽孢桿菌為主。聶慧芳等[39]從醬香型大曲中分離出兩株具有中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力的枯草芽孢桿菌，具有較高的蛋白分解能力。王曉丹等[40]研究發(fā)現(xiàn)，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）、雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）能夠產(chǎn)酸性蛋白酶、糖化酶和脂肪酶。而關(guān)于醬香型大曲中芽孢桿菌屬釀造酶活力大小的研究現(xiàn)狀見表3。

表3 醬香型白酒大曲中芽孢桿菌屬釀造酶活力研究現(xiàn)狀Table 3 Research status of brewing enzyme activity of Bacillus in Moutai-flavor Baijiu Daqu

綜上所述，醬香型大曲細菌具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖溶酶、糖化酶、脂肪酶、漆酶等酶學(xué)特性，每種酶在醬香型白酒釀造過程中都扮演著不同的角色，且行使的作用各有差異。在白酒釀造過程中，漆酶能夠氧化愈創(chuàng)木酚以及在小分子介體化合物的作用下氧化酪氨酸，這些小分子介體化合物主要是醬香型白酒中的芳香族化合物，如丁香醛、丁香酸、香草醛、阿魏酸等小分子酚類衍生物[46-47]。林芬等[44]從醬香型白酒中篩選一株既產(chǎn)醬香又具有纖溶酶活性的細菌，通過抗凝血實驗和體外血栓溶解實驗表明，該菌株發(fā)酵上清液具有體外血栓溶解作用和抗凝血效果，該菌在白酒釀造、酶制劑、藥物、飼料、香料等產(chǎn)業(yè)中提供豐富的生物資源且具有很強的利用價值，其纖溶酶活性也為生產(chǎn)新型的溶血栓藥物提供了參考。具有中性蛋白酶活性的細菌能夠輔助霉菌中酸性蛋白酶對原料中蛋白質(zhì)的降解；另外醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中耐高溫α-淀粉酶在高溫條件下能分解糧食中的淀粉，提高糧食利用率；在制作麩皮浸出汁時，加入耐高溫α-淀粉酶，采用“中溫蒸煮”法，可以降低麩皮浸出汁的糖化醪黏度，提高其流動性，有利于菌株在濃醪中發(fā)酵產(chǎn)香。

目前對于醬香型大曲細菌釀造酶學(xué)的研究都局限于檢測其菌株是否具有產(chǎn)酶特性、優(yōu)化產(chǎn)酶條件、提升產(chǎn)酶能力等，而其產(chǎn)酶能力在整個釀造過程中對白酒風(fēng)味、酒質(zhì)影響機制的研究還不夠清楚。其次對于酶的提取量以及應(yīng)用的研究領(lǐng)域也較為局限，若將其制成酶制劑運用于其他領(lǐng)域可為醬香型白酒中功能微生物的研究提供一個新方向。

2.2 醬香型大曲細菌產(chǎn)香特性研究

細菌在醬香型白酒釀造過程中主要作用是產(chǎn)香，近年來研究都是直接從大曲中篩選出具有產(chǎn)醬香風(fēng)味的菌株，根據(jù)大曲獨特的環(huán)境，模擬固液發(fā)酵至一定時間再對其發(fā)酵基質(zhì)進行感官與風(fēng)味成分分析。常用的風(fēng)味物質(zhì)檢測技術(shù)有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀、氣相色譜-嗅聞（gaschromatographyolfactometry，GC-O）法等。常用的樣品前處理方法有頂空固相微萃?。╤ead space solid-phase microextraction，HS-SPME）、液液微萃取（liquid-liquid microextraction，LLME）、攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）等。各檢測技術(shù)以及樣品前處理方法的基本原理、特點見表4。

表4 常用風(fēng)味檢測技術(shù)及樣品前處理方法Table 4 Common detection techniques for flavor and sample pretreatment methods

近年，在對醬香型白酒大曲細菌產(chǎn)香功能的研究中發(fā)現(xiàn)，樣品前處理大多都采用頂空固相微萃取技術(shù)，因為該技術(shù)相對其他前處理技術(shù)操作簡單、快速，并能與GC-O或GC-MS聯(lián)用。隨著現(xiàn)代風(fēng)味檢測技術(shù)的發(fā)展，解析酒的風(fēng)味物質(zhì)和微生物二者之間的聯(lián)系也越來越明朗，為后期研究微生物在白酒釀造過程中的作用機制提供技術(shù)支撐。

醬香型白酒在釀造過程中，微生物通過降解原料中的大分子物質(zhì)，以供自身生長代謝。由于制曲溫度逐漸升高，微生物在整個制曲環(huán)境中代謝生成新的物質(zhì)，使得大曲中的成分較為復(fù)雜，而新生成的物質(zhì)部分具有香味，從而形成特有的白酒香味。其代謝特性研究現(xiàn)狀見表5。

從以上研究表明，醬香型白酒的主體香味成分仍然是研究的一大熱點，從醬香型大曲中篩選出的產(chǎn)醬香的細菌大多都產(chǎn)酸類、醇類、酯類、酮類和吡嗪類等物質(zhì)。而這些物質(zhì)大都呈現(xiàn)不同的風(fēng)味，其中酯類化合物、醇類化合物、芳香族類化合物及縮醛類化合物主要貢獻較強的水果香、甜香；酸類化合物和硫化物主要貢獻腐臭味；含氮化合物、內(nèi)酯類化合物主要貢獻焙烤香和杏仁香；呋喃類化合物則主要貢獻焦糖香。沈海月[54]通過比較不同貯存年份的醬香型白酒的風(fēng)味，研究發(fā)現(xiàn)貯存時間越長的酒其醬香風(fēng)味越強，主要是因為酯類、醇類化合物降低，即水果香、甜香減少有利于凸顯其醬香；同時含氮類和酚類化合物增加也有利于醬香增強。對于功能微生物純種發(fā)酵大多都只呈現(xiàn)一種風(fēng)味，雖然檢測出的風(fēng)味化合物有很多種，但是某些風(fēng)味物質(zhì)占比較大會掩蓋其他風(fēng)味物質(zhì)的風(fēng)味。目前，對功能微生物的研究大多都是微生物的純種發(fā)酵感官聞香以及發(fā)酵基質(zhì)成分檢測慢慢解析其產(chǎn)香機制。但都只找到與產(chǎn)醬香有關(guān)的物質(zhì)，如乙偶姻、3-羥基-2-丁酮、四甲基吡嗪等。對于微生物在醬香大曲中的相互作用以及各微生物的代謝特性、酶學(xué)特性與風(fēng)味物質(zhì)之間的聯(lián)系對產(chǎn)醬香的影響都有待深入研究。

表5 醬香型白酒大曲細菌代謝特性研究Table 5 Metabolic characteristics of bacteria in Moutai-flavor Baijiu Daqu

3 功能細菌的發(fā)酵生態(tài)調(diào)控應(yīng)用

如何提升酒質(zhì)與出酒率以及改善酒的風(fēng)味一直是企業(yè)所面臨的一大難題，而醬香型白酒釀造過程不是單一菌株作用結(jié)果，而是多種微生物相互作用，進而形成獨特的微生物區(qū)系。若僅從細菌的角度分析其功能與作用太過局限。相應(yīng)地，混合發(fā)酵能從其他角度分析細菌在白酒釀造中的作用。

楊濤等[55]從醬香型大曲中篩選出5株嗜熱芽孢桿菌和3株酵母運用于白酒生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)用嗜熱芽孢桿菌、酵母菌與糟醅復(fù)合醬香明顯。凌杰[56]研究了醬香型白酒釀造中地衣芽孢桿菌與釀酒酵母之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性環(huán)境會抑制地衣芽孢桿菌的生長，從而削減了地衣芽孢在醬香型白酒生產(chǎn)中的作用，但隨著制曲溫度的升高，地衣芽孢桿菌的作用越明顯，此研究只單純的分析釀酒酵母與地衣芽孢桿菌生長的關(guān)系，對釀酒酵母是如何抑制地衣芽孢桿菌的生長，其抑制機制還需深入探討。

現(xiàn)如今，對于從醬香型大曲中篩選出的功能微生物，大多都以混合發(fā)酵方式運用于白酒生產(chǎn)中，以提升白酒的風(fēng)味成分，增加白酒感官品質(zhì)。但是一些功能微生物所代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)對于人體是有益的（如四甲基吡嗪），將其深入研究，更能體現(xiàn)其生物學(xué)價值。

4 總結(jié)與展望

運用傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術(shù)對醬香型大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，醬香型大曲中多數(shù)為芽孢桿菌屬，少數(shù)為微球菌屬、葡萄球菌屬、費氏鏈霉菌屬等細菌類群；采用免培養(yǎng)分離技術(shù)對醬香型大曲細菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性研究發(fā)現(xiàn)，其中主要為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍藻門、梭桿菌門、擬桿菌門等的細菌屬。從細菌功能性研究中表明，細菌的功能性研究太過局限，大多都局限于其代謝風(fēng)味物質(zhì)和酶學(xué)特性對白酒釀造過程的影響，以及微生物共培養(yǎng)體系相互作用對白酒風(fēng)味的影響；其次，對于分離到的不可培養(yǎng)的微生物菌群的生理生態(tài)特性及其功能特性的研究需要深入解析。而醬香大曲中的微生物能夠保證其產(chǎn)生獨特的醬香風(fēng)味，這主要源于其代謝的特征風(fēng)味物質(zhì)以及其酶學(xué)特性，如若將這些能夠代謝產(chǎn)風(fēng)味的菌株運用于食品調(diào)味的生產(chǎn)以及煙葉發(fā)酵增香等領(lǐng)域，也為之后白酒中產(chǎn)香細菌提供新的研究方向。