雷蕾，楊策，亢力，邢雁輝，武紅莉，王忠*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphy lococcus aureus，MRSA)是多藥耐藥性感染的最常見原因之一，具有顯著的發(fā)病率和病死率，已成為醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一[1]。隨著MRSA對所有種類的抗生素逐漸產(chǎn)生耐藥性，它變得越來越難以控制。因此，筆者們一直在尋找新的藥物來對抗MRSA。

中醫(yī)藥是我國醫(yī)學(xué)瑰寶，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展，越來越多的中藥化學(xué)成分被分離出來，為新藥開發(fā)提供了寶貴的資源。已經(jīng)有很多從天然產(chǎn)物中開發(fā)出新藥的例子，例如青蒿素的開發(fā)[2]和長春堿的開發(fā)[3]。然而，傳統(tǒng)生物測定篩選的成本高昂。近年來，分子對接方法已成為計算機(jī)輔助藥物研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)。它是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進(jìn)行藥物篩選的方法，可以有效地在進(jìn)行傳統(tǒng)生物學(xué)測定之前進(jìn)行虛擬篩選，從而降低新藥開發(fā)的成本，并提高命中率。

本研究收集了文獻(xiàn)中有抗菌或者抑菌報道的中藥以及中藥包含的化學(xué)成分，希望篩選出可能具有抗MRSA的化合物。因此，使用分子對接的方法對283味中藥中包含的6193個化學(xué)成分與常見MRSA抑制靶標(biāo)青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)進(jìn)行了分子對接，得到的研究結(jié)果希望能給新藥開發(fā)人員以有價值的參考。

1 資料與方法

1.1 平臺和軟件

本研究所有工作均在Microsoft Windows 2007操作系統(tǒng)中完成，采用Accelrys 公司的Discovery Studio 4.5(DS4.5)軟件。參數(shù)設(shè)置除特殊指明，均為默認(rèn)值。本研究使用的是CDOCKER程序，是基于CHARMm的柔性對接程序，采用soft-core potentials以及optional grid representation將配體分子與受體活性位點進(jìn)行對接。首先采用動力學(xué)的方法隨機(jī)搜索小分子構(gòu)象，隨后采用模擬退火的方法將各個構(gòu)象在受體活性位點區(qū)域進(jìn)行優(yōu)化，從而使對接結(jié)果更加準(zhǔn)確。分子的吸收、分布、代謝、排泄、毒性(ADMET)計算也是使用DS4.5完成的。

1.2 受體的準(zhǔn)備

PBP2a的3D結(jié)構(gòu)(PDB ID：3ZG0，2.60 ?)從Protein Data Bank網(wǎng)站下載(https：//www.rcsb.org/)。MRSA具有多重耐藥性，其產(chǎn)生機(jī)制是PBPs改變的結(jié)果，高度耐藥性是由于原有的PBP2與PBP3之間產(chǎn)生一種新的PBP2′(即PBP2a)，低、中度耐藥是PBPs的產(chǎn)量增多或與甲氧西林等親和力下降所致。

PBP2a晶體學(xué)研究給出了抑制劑與蛋白在變構(gòu)位點和活性位點相互作用的信息，變構(gòu)結(jié)合域位于距離dd-轉(zhuǎn)肽酶活性位點60 ?的位置。當(dāng)配體在變構(gòu)位點占用時，多殘留構(gòu)象變化在活性位點達(dá)到頂峰，從而允許抑制劑進(jìn)入[4]。3ZG0是蛋白與2個分子的ceftaroline(頭孢洛林)共結(jié)晶體，配體ceftaroline(ID：1W8)成功觸發(fā)了PBP2a構(gòu)象變化，使蛋白的活性部位可以與另一個ceftaroline分子(ID：AI8)結(jié)合。ceftaroline是FDA批準(zhǔn)的抗MRSAβ-內(nèi)酰胺抗生素。目前3ZG0已經(jīng)用于抗MRSA藥物的虛擬篩選[5-6]。

本研究受體的準(zhǔn)備和結(jié)合口袋的定義為刪除水分子、原配體分子及其非相關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，經(jīng)clean protein工具處理，再加CHARMm力場進(jìn)行能量優(yōu)化，定義蛋白為受體，以它的原配體位置為中心，選擇半徑0.50 nm 范圍的殘基為活性殘基，將其定義sphere球，此范圍內(nèi)的空腔為結(jié)合口袋，最后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 配體數(shù)據(jù)的組建

檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(SinoMed)、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)，萬方數(shù)據(jù)庫和維普數(shù)據(jù)庫。檢索詞有：“抑菌”“抗菌”“藥理作用”。時間限制為1949年1月—2017年12月。納入標(biāo)準(zhǔn)：采集對中藥或者中藥提取物的藥理作用進(jìn)行研究的文獻(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除文獻(xiàn)研究、綜述、非藥理實驗文獻(xiàn)、理論探討、臨床研究、單體成分藥理實驗報道以及重復(fù)報道的文獻(xiàn)。數(shù)據(jù)由人工摘錄的方式從文獻(xiàn)中收集與中藥、中藥提取物和藥理作用相關(guān)的信息。在本研究中，中藥提取物統(tǒng)一為中藥名稱，例如黃芩乙醇提取物規(guī)范統(tǒng)一為黃芩，梔子提取物統(tǒng)一為梔子。最后，根據(jù)計算系統(tǒng)生物學(xué)實驗室TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，檢索出化學(xué)成分。

因為中藥常水煎口服，在體內(nèi)需經(jīng)吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)以及排泄(excretion)過程，這個過程簡稱ADME。為了預(yù)測化合物ADME的性質(zhì)，本研究以口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)為條件篩選化合物。將化合物的mol2格式文件導(dǎo)入DS4.5中，首先依據(jù)Linpiski規(guī)則進(jìn)行篩選，然后使用small molecules-prepare ligand進(jìn)一步將配體產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，加氫，產(chǎn)生異構(gòu)體等。最后使用small molecules-minimize ligands，加CHARMm力場進(jìn)行能量最小化，保存為分子對接的配體分子集。

1.4 對接方法可信性驗證

含有原配體的蛋白晶體復(fù)合結(jié)構(gòu)，將原配體抽離，然后按設(shè)定的參數(shù)對接回其結(jié)合口袋，計算對接后最高打分的構(gòu)象與原配體結(jié)構(gòu)的均方根偏差值(RMSD)，一般RMSD≤0.20 nm[7]則認(rèn)為該對接方法可行，說明該套參數(shù)能較好地重現(xiàn)此配體與受體的結(jié)合模式。

1.5 配體分子與受體靶點對接參數(shù)

將上述配體和受體導(dǎo)入DS4.5，調(diào)用CDOCKER對接模塊，參數(shù)均為默認(rèn)值。

變構(gòu)位點結(jié)合口袋的位置是X=9.965 744，Y=52.253 615，Z=23.244 846，結(jié)合口袋的半徑為11.520 969 ?。

活性位點結(jié)合口袋的位置是X=-35.986 667，Y=44.388 051，Z=66.823 564，結(jié)合口袋的半徑為12.883 887 ?。

1.6 結(jié)果處理

對接完成后，以原配體的對接interaction energy為參考，值高于原配體的予以保留，得到潛在有活性的化合物。

2 結(jié)果

2.1 抑菌抗菌中藥統(tǒng)計

本研究共檢索出252篇文獻(xiàn)，一共出現(xiàn)283味中藥，其中頻次在前10位的見表1。

表1 文獻(xiàn)檢索頻次在前10位的抑菌抗菌中藥

2.2 化學(xué)成分統(tǒng)計

在283味中藥中包含了6193個化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%和類藥性DL≥0.18為條件篩選出化合物1137個。進(jìn)一步使用Linpiski規(guī)則篩選出907個化合物。Lipinski規(guī)則，即類藥五原則(rule of five)，其內(nèi)容如下：1個小分子藥物中要具備以下性質(zhì)：分子量<500；氫鍵給體數(shù)目<5；氫鍵受體數(shù)目<10；脂水分配系數(shù)<5；可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10個。

2.3 可行性驗證結(jié)果

選取3ZG0含有原配體的復(fù)合結(jié)構(gòu)晶體，將原配體抽離，再對接回其結(jié)合口袋，計算對接后構(gòu)象與原配體結(jié)構(gòu)的RMSD 值，<0.2 nm說明該對接方法、所選用的晶體結(jié)構(gòu)及參數(shù)的設(shè)定可行。

2.4 變構(gòu)部位分子對接

將原配體ceftaroline對接回變構(gòu)部位結(jié)合口袋，得到interaction energy為-54.89。完成對接后，能量低于它的化合物有66個，結(jié)合能最低的10個化合物見表2。

2.5 活性部位分子對接

將原配體ceftaroline對接回活性部位結(jié)合口袋，得到interaction energy為-68.65，能量低于它的化合物有6個，見表3。

2.6 作用模式分析

為了研究突變體結(jié)構(gòu)與活性化合物的結(jié)合親和力，進(jìn)行了作用模式的分析。變構(gòu)位點在整個對接過程中至關(guān)重要，必須先有1個分子與變構(gòu)位點結(jié)合，觸發(fā)PBP2a構(gòu)象變化，使蛋白的活性部位可以與另1個分子結(jié)合，從而達(dá)到抗MRSA的作用。實際上，PBP2a表現(xiàn)出耐藥性，是因為在PBP2a的變構(gòu)位點(146位和150位)上發(fā)生了2個氨基酸的變化，這2個氨基酸的變化對頭孢類藥物產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致了頭孢類藥物耐藥MRSA菌株的增加[4]。本研究發(fā)現(xiàn)了23個化合物與146位氨基酸殘基可以通過氫鍵和范德華力結(jié)合。而在3ZG0活性位點上，6個化合物除了范德華力和氫鍵外，還通過鹽橋、ππ相互作用等與周圍的蛋白質(zhì)殘基相結(jié)合。

本研究發(fā)現(xiàn)，不論是變構(gòu)部位還是活性部位，lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt都能以較為穩(wěn)定的構(gòu)象與3ZG0結(jié)合。syringaresinol diglucoside_qt是syringaresinol diglucoside的去糖基的代謝產(chǎn)物，可以認(rèn)為是腸道菌水解產(chǎn)物。也就是說，lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt就像一把鑰匙，1個分子可以先與變構(gòu)位點結(jié)合，觸發(fā)PBP2a構(gòu)象變化，使蛋白的活性部位可以與另1個分子結(jié)合，從而達(dá)到抗MRSA的作用。

表2 變構(gòu)部位結(jié)合能最低的10個化合物

續(xù)表2

表3 活性部位結(jié)合能低于原配體的化合物

續(xù)表3

3 討論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對目前所有廣譜抗生素都表現(xiàn)出耐藥性，對公眾構(gòu)成嚴(yán)重威脅。在中藥抗耐藥菌的研究中，田應(yīng)彪等[8]觀察了五倍子、黃連、黃柏等16種中藥水煎液對MRSA和MSSA體外抑菌作用，黃文玉等[9]發(fā)現(xiàn)了大蒜、馬齒莧、野菊花等27種清熱解毒中藥對葡萄球菌耐藥菌株的作用，謝大澤等[10]報道了黃連等中藥對淋菌耐藥菌株體外抗菌活性的研究工作。中藥逐漸在耐藥菌的研究中嶄露頭腳，因此本研究希望可以從具有抗菌抑菌作用的中藥中尋找到抗MRSA的候選物，進(jìn)而為新藥開發(fā)提供參考。

為了能夠盡可能地篩選出候選物，在進(jìn)行虛擬篩選之前，本研究就使用化合物的ADME的性質(zhì)和Lipinski規(guī)則進(jìn)行了初步篩選。這一方面可以減少分子對接的計算量，另一方面可以保證最后得到的化合物會有更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)代謝過程中會有更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物。摒除了那些不適合成為藥物的分子，縮小篩選的范圍，并降低藥物研發(fā)成本。

PBP2a蛋白結(jié)構(gòu)很特殊，它有一個變構(gòu)位點，一個活性位點。變構(gòu)位點就像一扇門，打開了它，活性位點才能有效結(jié)合藥物分子。本研究發(fā)現(xiàn)了66個可以與變構(gòu)位點良好結(jié)合的中藥化學(xué)成分，它們都可以作為鑰匙打開第一扇門。同時發(fā)現(xiàn)了6個可以與活性位點良好結(jié)合的成分。值得一提的是，不論是變構(gòu)部位還是活性部位，來自甘草和山豆根的lupiwighteone和來自女貞子的syringaresinol diglucoside_qt都能以較為穩(wěn)定的構(gòu)象與3ZG0結(jié)合。也就意味著lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt有可能像上市藥物ceftaroline一樣，以2個分子的形式與PBP2a蛋白相結(jié)合，從而達(dá)到抗MRSA的目的。