徐玉巧，王金華，熊智，范方宇

(西南林業(yè)大學 生命科學學院，云南 昆明，650224)

益生菌為一類活的微生物，當足夠的益生菌被攝取并根植于宿主時，具有一定保健功能[1]。益生菌可平衡腸道菌群，進而調(diào)節(jié)宿主的免疫反應、代謝過程和神經(jīng)內(nèi)分泌等[2-3]，對疾病的防治具有重要功能。益生菌類活菌制劑也被廣泛應用于乳制食品[4-5]，但益生菌貯藏期間易受濕度、溫度、氧氣等影響，益生菌存活率低，產(chǎn)品貨架期短[6]，益生菌保護問題亟待解決。微膠囊技術(shù)可將益生菌包埋于合成或天然高分子成膜性材料中，有效降低外界不良環(huán)境因素的影響，提高穩(wěn)定性，延長貨架期[7-8]。益生菌微膠囊制備的主要技術(shù)有：擠壓法、相分離法、噴霧干燥法、靜電結(jié)合等[9-11]。復凝聚法屬于相分離法的一種，反應條件溫和、效率高，可大規(guī)模生產(chǎn)[12-14]。賀紅軍等[15]采用復凝聚法制備了包埋率為93.5%的嗜酸乳桿菌微膠囊，濕囊在-4和30 ℃下貯藏30 d后，仍保持82%和80%的存活率；DA SILVA等[16]使用復凝聚法制備嗜酸乳桿菌微膠囊，包埋率高達97.72%，經(jīng)真空冷凍干燥后微膠囊儲藏60 d后仍保持9.59 log CFU/g。復凝聚法作為一種高效的益生菌微膠囊制備方法，制備條件對包埋率的影響及濕囊的干燥方式尤為重要。

本研究以鼠李糖乳桿菌為模式益生菌，制備了鼠李糖乳桿菌微膠囊，全面的探究復凝聚法制備工藝條件；并對比噴霧干燥和真空冷凍干燥微膠囊性質(zhì)，以期提高鼠李糖乳桿菌等益生菌的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

鼠李糖乳桿菌(ATCC 53013)(凍干粉)，美國菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

B型明膠(gelatin, GE)、阿拉伯膠(gum Arabic, GA)，國藥集團化學試劑有限公司；冰醋酸、Na2H(PO4)3、KH2(PO4)3，廣東光華科技股份有限公司；NaOH，成都金山化學試劑有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)，泰興市東勝食品科技有限公司；NaCl，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

B-290小型噴霧干燥儀，瑞士Büchi實驗室儀器公司；LKSC-B實驗室電動攪拌器，金壇市大地實驗儀器廠；PHS-25 pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；THZ-82氣浴恒溫搖床，上海力辰儀器科技有限公司；FD5-3真空冷凍干燥機，美國SIM公司；3K15離心機，德國Sigma公司；SK2009光學顯微鏡，深圳賽克數(shù)碼科技有限公司；S-3000N掃描電子顯微鏡，日本HITACHI公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠李糖乳桿菌的制備

將鼠李糖乳桿菌凍干粉活化2次后用甘油保藏法保存。制微膠囊時，先將冷凍保藏的鼠李糖乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落置于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，最后以0.1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，在對數(shù)期離心收集菌體，無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)洗滌2次，重懸于無菌PBS得濃縮菌液(菌濃度約1010CFU/mL)。

1.3.2 鼠李糖乳桿菌的微膠囊化工藝

基于朱曉麗等[17]的研究改進復凝聚法制備鼠李糖乳桿菌微膠囊。

(1)GE和GA(質(zhì)量比1∶1)混合溶液為200 mL。

(2)TG酶添加量為25 U/g GE[18]。

1.3.3 復凝聚法制備鼠李糖乳桿菌微膠囊單因素試驗

單因素試驗以包埋率為指標，考察pH、壁材濃度、轉(zhuǎn)速和菌添加量對復凝聚法微膠囊的影響。其中，初始條件為pH 3.50，壁材濃度1.5%，轉(zhuǎn)速200 r/min，菌添加量109CFU(試驗中保持其他因素水平不變，僅改變相應因素水平)。

1.3.4 鼠李糖乳桿菌微膠囊制備工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以pH、壁材濃度、轉(zhuǎn)速和鼠李糖乳桿菌添加量為影響因素，包埋率為指標設(shè)計L9(34)正交試驗，因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 鼠李糖乳桿菌微膠囊包埋率的測定

取1 mL濕囊于9 mL PBS中，37 ℃恒溫振蕩至完全溶解，用稀釋梯度法涂布平板計數(shù)。微膠囊包埋率按公式(1)計算：

(1)

式中：N0，包埋前的原始活菌數(shù)；N，溶解后微膠囊中包埋的活菌數(shù)。

1.3.6 鼠李糖乳桿菌微膠囊濕囊粒徑的測量

玻璃棒蘸取少量微膠囊涂于載玻片，蓋上蓋玻片。采用賽克顯微鏡自帶圖像采集系統(tǒng)拍照并使用自帶軟件S-EYE測量單個微膠囊的粒徑，統(tǒng)計100個以上微膠囊的粒徑，計算其平均粒徑。

1.3.7 鼠李糖乳桿菌微膠囊的干燥

真空冷凍干燥：將上述復凝聚法最優(yōu)工藝制備的濕微膠囊置于玻璃平皿中，在-20 ℃下預凍8 h，將其放入真空冷凍干燥機進行真空冷凍干燥(-60 ℃，48 h)。

噴霧干燥：將濕膠囊和一定體積的無菌水配成懸浮液進行噴霧干燥，參數(shù)為進風溫度170 ℃，進料流量9 mL/min，進料濃度30%，出料溫度約為80 ℃。在噴霧干燥期間，所有實驗中參數(shù)保持恒定。

1.3.8 微膠囊掃描電子顯微鏡觀察及含水率的測定

掃描電鏡觀察：取少量微膠囊粉末黏于導電雙面膠表面，多余的粉末用吸耳球吹去，噴金處理90 s，將樣品通過掃描電子顯微鏡獲取圖像，加速電壓為15 kV。

含水率測定：參考GB5009. 3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法[19]。

1.3.9 鼠李糖乳桿菌微膠囊貯藏性的測定

不同水分活度微膠囊的貯藏性：將鼠李糖乳桿菌微膠囊在常溫下分別置于盛有飽和氯化鋰、飽和氯化鎂、飽和硝酸鎂以及飽和氯化鈉溶液的干燥器中，使其分別處于水分活度(water activity，aw)為 0.11、0.33、0.53、0.75[20]環(huán)境中保存4周，每隔1周計算活菌數(shù)。

不同溫度微膠囊的貯藏性：將鼠李糖乳桿菌微膠囊分別置于25 ℃(常溫)、4 ℃(冷藏)、-18 ℃(冷凍)條件下保存4周，每隔1周計算活菌數(shù)。

活菌數(shù)測定：每次取0.1 g微膠囊干粉置于10 mL 無菌PBS中，37 ℃恒溫振蕩至完全溶解，用稀釋梯度法涂布平板計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對鼠李糖乳桿菌微膠囊的影響

利用GE兩性電解質(zhì)的特點，2種高分子電解質(zhì)GE和GA溶于水后，調(diào)節(jié)溶液pH可使GE帶上正電荷，與帶負電荷的GA結(jié)合產(chǎn)生凝聚相。因此復凝聚法制備微膠囊的必要條件是調(diào)節(jié)溶液pH至GE的等電點以下。由圖1可知，pH對復凝聚反應影響明顯。凝聚體系pH為3.25和4.25時，包埋率都低于10%；pH 3.25時包埋率近于0，且微膠囊過于黏連無法測量粒徑。此條件下溶液酸濃度過大，不利于鼠李糖乳桿菌生存，且復凝聚工藝時間長，長時間處于不良生存環(huán)境導致鼠李糖乳桿菌存活率近于0，并且pH 3.25體系中GE帶正電荷多，形成的微膠囊相互黏連，可能也是包埋率低的原因。當pH為3.75時，平均粒徑最大(65.31 μm)、包埋率最高(89.83%)。當復凝聚體系pH>3.75時，微膠囊平均粒徑隨pH增大而減小，包埋率也隨之降低。pH 4.25接近GE等電點，包埋率為6.87%，大多數(shù)的菌沒有被包埋。一方面是微膠囊粒徑太小(34.89 μm)；另一方面是所帶正電荷較少，可能由于乳酸菌的弱負電性很難跟GE和GA共同組成微膠囊。因此復凝聚法制備鼠李糖乳桿菌微膠囊的合適pH為3.50～4.00。

圖1 pH對微膠囊包埋率和粒徑的影響

2.2 壁材濃度對鼠李糖乳桿菌微膠囊的影響

由圖2可知，壁材濃度對微膠囊包埋率和粒徑有較大影響。隨壁材濃度增加，平均粒徑隨之減小，包埋率先升高后降低。當壁材濃度為0.5%時，包埋率為42.67%，此時粒徑最大69.78 μm。壁材濃度增大，復凝聚體系黏度逐漸增加，當壁材濃度為1.5%時，包埋率最高，為81.67%，此時平均粒徑為56.24 μm。大于1.5%時，微膠囊開始黏連，且形狀不規(guī)則；壁材濃度增至3.0%時，包埋率降至25%，無一圓整微膠囊，無法計算粒徑。BURGESS等[21]認為復凝聚體系的黏度越大，微膠囊的結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。當壁材濃度較低(<1%)時，形成的微膠囊粒徑大且壁薄，微膠囊不穩(wěn)定，芯材易溢出，包埋率低；當壁材濃度增大時，黏度增大，微膠囊結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，當大于2.0%時，微膠囊的形狀不規(guī)則，黏連在一起，機械分散困難，大量的壁材和芯材被凝滯在體系底部，包埋率迅速降低。因此適宜的壁材濃度為1.0%～2.0%。

圖2 壁材濃度對微膠囊包埋率和形態(tài)的影響

2.3 轉(zhuǎn)速對鼠李糖乳桿菌微膠囊的影響

電動攪拌器的轉(zhuǎn)速對復凝聚反應有一定的影響。由圖3可知，隨轉(zhuǎn)速增大，粒徑越?。磺肄D(zhuǎn)速越低，標準偏差越大，粒徑分布越不均勻。復凝聚法產(chǎn)生微膠囊的粒徑由分散時液滴的粒徑?jīng)Q定，而分散的液滴大小由攪拌速度(轉(zhuǎn)速)控制，因此機械分散好，形成的微膠囊泡沫少且大小均一，復凝聚體系穩(wěn)定[22]。當轉(zhuǎn)速較低(100 r/min)時，包埋率為57.00%，粒徑最大85.16 μm。此條件下GE與GA、壁材與芯材不能反應完全，復凝聚效果差，包埋率低。隨轉(zhuǎn)速增大，包埋率先升高后降低，粒徑隨之減少。轉(zhuǎn)速為200 r/min時，包埋率達到最大81.67%。當轉(zhuǎn)速為500 r/min時，包埋率降低至33.46%，原因可能為：一是此條件下的微膠囊體積太小，芯材裝載量小，導致包埋率低；二是轉(zhuǎn)速越大，導致復凝聚體系中泡沫增多從而凝聚物減少，降低包埋率。因此合適的轉(zhuǎn)速為100～300 r/min左右。

圖3 轉(zhuǎn)速對微膠囊包埋率和平均粒徑的影響

2.4 菌添加量對鼠李糖乳桿菌微膠囊的影響

菌添加量對微膠囊的形態(tài)和粒徑?jīng)]有太大的影響。由圖4可知，當菌添加量較低時(106、107CFU)，在壁材濃度和總量不變的條件下，芯材較少，微膠囊包埋效果好，包埋率穩(wěn)定在80%～90%，然而壁材利用率低，造成浪費。當菌添加量為1010CFU時，包埋率下降至38.52%，此時壁材的包埋能力達到極限，多余的芯材不能被包埋。綜合考慮，適宜的菌添加量為108～1010CFU。

圖4 菌添加量對微膠囊包埋率的影響

2.5 正交試驗結(jié)果

由表2可知，影響復凝聚法制備鼠李糖乳桿菌微膠囊的主次因素為A(pH)>D(菌添加量) >B(壁材濃度)>C(轉(zhuǎn)速)，最佳工藝條件組合為A2B2C2D1，即pH 3.75、壁材濃度1.5%、轉(zhuǎn)速200 r/min、菌添加量108CFU。

表中D1和D2的k值分別為63.353和62.983，相差較小，考慮到壁材利用率，菌添加量取D2，故最佳工藝條件為pH 3.75、壁材濃度1.5%、轉(zhuǎn)速200 r/min、菌添加量109CFU。進行驗證實驗，包埋率為(93.21±3.65)%，證實了最優(yōu)實驗的可行性。

2.6 噴霧干燥和真空冷凍干燥微膠囊形態(tài)及含水率

將在最優(yōu)條件下制備的濕微膠囊進行噴霧干燥和真空冷凍干燥。噴霧干燥微膠囊的掃描電鏡圖(圖5-a)中，微膠囊粒徑約15 μm，形狀不規(guī)則，表面褶皺且凹陷較深，這是由于濕微膠囊在噴霧干燥過程中，微膠囊迅速脫水從而產(chǎn)生凹陷及褶皺，但微膠囊囊壁完整無裂痕。噴霧干燥后的微膠囊外觀為白色，粉質(zhì)細膩，分散性較好，含水率3.48%。

圖5 噴霧干燥微膠囊(a)和真空冷凍干燥微膠囊(b)的微觀形態(tài)和和宏觀形態(tài)

如圖5-b所示，真空冷凍干燥微膠囊粒徑約25 μm，比噴霧干燥的粒徑大，這是因為噴霧干燥過程的高溫導致微膠囊脫水程度大，而真空冷凍干燥相對溫和；圖5-b中微膠囊有些連結(jié)，大部分微膠囊呈不規(guī)則形狀，但表面少有凹陷且光滑平整。真空冷凍干燥微膠囊呈絮狀連結(jié)在一起，顏色稍黃，含水率2.75%。ALBADRAN等[23]報道益生菌微膠囊含水量小于10%時，有利于提高貯藏穩(wěn)定性。2種方式干燥得到的微膠囊結(jié)構(gòu)完整、無芯材溢出，且含水率低，說明復凝聚法制備的微膠囊在噴霧干燥和真空冷凍干燥后可很好地保護芯材。

2.7 噴霧干燥和真空冷凍干燥微膠囊的儲藏穩(wěn)定性

第0周的活菌數(shù)為濕膠囊經(jīng)噴霧干燥和真空冷凍干燥后的活菌數(shù)(表3、表4)，由此可知，每克真空冷凍干燥微膠囊活菌數(shù)比噴霧干燥微膠囊高1.9個對數(shù)值。這可能是由于鼠李糖乳桿菌微膠囊在真空冷凍干燥時的條件相對溫和，而在噴霧干燥時脫水和升溫過程較快，使菌體在短時間內(nèi)受到脫水脅迫、熱脅迫、氧化脅迫等從而導致細胞膜等細胞結(jié)構(gòu)受損[24]，最終菌體死亡較多。在儲藏期間，2種微膠囊在不同水分活度條件下的活菌數(shù)有不同程度的降低，并從第1周起，隨水分活度升高，活菌數(shù)顯著降低(P<0.05)。

每克噴霧干燥微膠囊在較低aw(0.11)下，活菌數(shù)第2周開始顯著下降(P<0.05)，4周內(nèi)下降1.2個對數(shù)值，而真空冷凍干燥微膠囊第1周開始顯著下降(P<0.05)，4周內(nèi)下降3.0個對數(shù)值，說明噴霧干燥微膠囊在較低aw時能保存較好的活性。

表3 不同環(huán)境對噴霧干燥微膠囊儲藏穩(wěn)定性的影響

注：不同小寫字母表示同一列差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一行差異顯著(P<0.05)(下同)

表4 不同環(huán)境對真空冷凍干燥微膠囊儲藏穩(wěn)定性的影響

原因可能是噴霧干燥微膠囊表面結(jié)構(gòu)凹陷和皺縮且尺寸小，因而囊壁更厚，可減少氧的迫害(例如氧會加速細胞膜的脂質(zhì)氧化)，從而對菌體有較強的保護。高aw(0.75)噴霧干燥微膠囊在第3周失去活性，原因可能是噴霧干燥后存活菌體的受損程度比真空冷凍干燥的大，在高aw條件下，細胞膜在貯藏期間的被動滲透性較高[23]，導致噴霧干燥微膠囊在短時間內(nèi)全部失活。值得注意的是，第2周在aw為0.53的條件下，噴霧干燥微膠囊活菌數(shù)未下降，aw為0.75，第2周活菌數(shù)呈顯著增長(P<0.05)，這可能是鼠李糖乳桿菌在利用環(huán)境中的水分和養(yǎng)分(明膠為蛋白質(zhì)，提供氮源；阿拉伯膠為多糖，提供碳源)從而實現(xiàn)了少量的增殖。與之相比，真空冷凍干燥微膠囊在高aw條件下，活菌數(shù)同樣有所降低，但下降緩慢，在第4周時aw0.75下微膠囊中的鼠李糖乳桿菌全部失活，在aw0.53時仍能保持每克4.5個對數(shù)值的活性。

表3、表4中不同溫度條件下的噴霧干燥和真空冷凍干燥微膠囊都保持了較穩(wěn)定的活性。常溫下，噴霧干燥微膠囊第4周時每克下降了1.3個對數(shù)值，真空冷凍干燥微膠囊下降了1個對數(shù)值；4 ℃條件下2種微膠囊在第4周時都開始明顯下降(P<0.05)，噴霧干燥微膠囊在第4周時每克下降了1.3個對數(shù)值，真空冷凍干燥微膠囊下降了0.8個對數(shù)值；-18 ℃條件下4周內(nèi)的活菌數(shù)都沒有顯著差異(P>0.05)，此溫度下微膠囊儲藏性最穩(wěn)定。微膠囊在低溫低水活度環(huán)境下能較長時間地保護鼠李糖乳桿菌，而真空冷凍干燥微膠囊體現(xiàn)了更好的儲藏性。

3 結(jié)論

本研究通過復凝聚法制備了鼠李糖乳桿菌微膠囊，并研究了pH、壁材濃度、轉(zhuǎn)速和菌添加量對包埋率的影響，在此基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化了鼠李糖乳桿菌微膠囊的制備工藝，結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌微膠囊的復凝聚最佳工藝為：pH 3.75、壁材濃度1.5%、轉(zhuǎn)速200 r/min、菌添加量109CFU，此條件下的包埋率為93.21%。

考察復凝聚法制備的鼠李糖乳桿菌濕微膠囊干燥后的性質(zhì)，結(jié)果顯示每克真空冷凍干燥微膠囊的活菌數(shù)高于噴霧干燥微膠囊；儲藏性實驗表明干燥微膠囊在低溫低水活度環(huán)境下能較長時間地保護鼠李糖乳桿菌，真空冷凍干燥微膠囊更具優(yōu)勢。