崔夢君，張振東，萬舒曼，葛東穎，郭壯

(湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽，441053)

豆瓣醬是我國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，色澤鮮艷，香氣濃郁，深受廣大消費者的喜愛[1]。它的生產(chǎn)主要經(jīng)過制曲、蠶豆發(fā)酵、辣椒發(fā)酵和混合發(fā)酵等過程[2]。發(fā)酵時，原料中的糖類和蛋白質(zhì)等會被分解產(chǎn)生酸、醇和酯等物質(zhì)，從而賦予豆瓣醬特殊的風(fēng)味[3]。研究顯示，豆瓣醬中近40%的微生物為細菌[4]，細菌對與食品的發(fā)酵有著重要的作用[5]，因此對于豆瓣醬樣品細菌的研究就顯得尤為重要。目前，對于豆瓣醬的研究主要集中在菌株的分離鑒定[6]和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化[7]，而對于豆瓣醬中細菌多樣性和品質(zhì)的研究相對較少。

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，以Illumina MiSeq為代表的第二代測序技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確對發(fā)酵食品中的微生物進行解析[8-9]。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于白酒[10]和酸菜[11]等食品中微生物的解析；電子舌技術(shù)可以實現(xiàn)同時對食品中基本味和回味的相對強度進行測定，已廣泛應(yīng)用于酸奶[12]和啤酒[13]等發(fā)酵食品的滋味品質(zhì)評價；電子鼻技術(shù)可以對食品中特定的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行定性和定量分析，被廣泛應(yīng)用于醬油[14]和蝦醬[15]等發(fā)酵食品中。

本研究從湖北省荊州市荊州區(qū)的農(nóng)戶家中采集了13 個豆瓣醬，采用Illumina MiSeq測序平臺對農(nóng)家豆瓣醬中細菌多樣性進行分析，同時采用電子舌和電子鼻技術(shù)對相關(guān)評價指標(biāo)進行測定，并將細菌多樣性和豆瓣醬品質(zhì)指標(biāo)進行了相關(guān)性分析，最終對豆瓣醬中細菌的基因功能進行了預(yù)測，以期對后續(xù)農(nóng)家豆瓣醬品質(zhì)和食用安全性的提升提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)家豆瓣醬：采集至湖北省荊州市荊州區(qū)。

dNTPs Mix、FastPfuFly DNA Polymerase、5×TransStartTMFastPfuBuffer，北京全式金生物技術(shù)有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；陰陽離子溶液、參比溶液和味覺標(biāo)準(zhǔn)溶液，日本Insent公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；SA 402B電子舌，日本Insent公司；PEN3電子鼻，德國Airsense公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

于2018年10月上旬從湖北省荊州市荊州區(qū)郢城鎮(zhèn)和李埠鎮(zhèn)(E112°07′～112°22′，N30°32′～30°36′)農(nóng)戶家中采集豆瓣醬樣品13 份。其制作時間約在70～80 d左右。

1.3.2 樣品微生物宏基因組DNA提取

取2.0 g豆瓣醬，按DNA基因組提取試劑盒說明書中進行DNA提取，并對其進行檢驗，將檢驗合格后的DNA樣品置于-20 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細菌16S rRNA V4-V5區(qū)PCR擴增及測序

正反向引物分別為338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，參照郭壯的PCR擴增參數(shù)進行擴增[16]。將擴增后的DNA產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。測序主要流程如下：(1)文庫制備，對DNA進行片段化處理，并向兩端添加特定的接頭來構(gòu)建測序文庫。接頭含有的互補序列使DNA片段結(jié)合到流動槽上，進行再擴增和片段純化。(2)測序，將文庫上樣到流動槽后置于測序儀中，擴增DNA片段簇。邊合成邊測序過程中，核苷酸通過天然的互補性與DNA模板鏈結(jié)合。每個核苷酸均含有熒光標(biāo)記和可逆終止子，熒光信號可指示出加入的核苷酸種類，而終止子被切割后，下一個堿基繼續(xù)結(jié)合，讀取正向DNA鏈后，序列會脫落，隨后重復(fù)該過程，讀取反向鏈，最終完成測序過程。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

使用QIIME(v1.70)平臺對質(zhì)控后的有效序列進行細菌物種分析和多樣性評價[16]。使用GREENGENE數(shù)據(jù)庫對序列進行同源性比對，并對其分類學(xué)地位進行注釋，從而對豆瓣醬中細菌的基因功能進行PICRUSt預(yù)測[17]。

1.3.5 核酸登錄號

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，登錄號為mgp89184。

1.3.6 基于電子舌技術(shù)對農(nóng)家豆瓣醬滋味品質(zhì)的評價

參考王玉榮等方法并做適當(dāng)優(yōu)化[18]。樣品處理：取10 g豆瓣醬樣品和90 mL蒸餾水混勻后10 000 r/min離心15 min，取上清液抽濾后置于4 ℃冰箱中24 h，去除上層油層后待用。數(shù)據(jù)處理：每個樣品重復(fù)測定4 次，取后3 次數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)。

1.3.7 基于電子鼻技術(shù)對農(nóng)家豆瓣醬風(fēng)味品質(zhì)的評價

參考王玉榮等對鲊廣椒風(fēng)味測定方法并做適當(dāng)優(yōu)化[19]。樣品處理：取10 g豆瓣醬樣品于電子鼻樣品瓶中，60 ℃保溫15 min，室溫靜置10 min后插入電子鼻測試電極進行測定，平行測定3 次。數(shù)據(jù)處理：響應(yīng)曲線在60 s后達到穩(wěn)定，選取63、64和65 s的響應(yīng)值，并計算其平均值為測試值。

1.3.8 多元統(tǒng)計學(xué)分析

采用相關(guān)性分析法對平均相對含量大于0.5%的細菌屬與品質(zhì)評價指標(biāo)之間的相關(guān)性進行研究，選取相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.5，且矯正后P<0.5的評價指標(biāo)，采用Cytoscape軟件(v3.5.1)進行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖繪制；使用Pearson相關(guān)性分析法對豆瓣醬樣品中優(yōu)勢細菌屬和COGs功能類別之間的相關(guān)性進行計算，并使用熱圖對結(jié)果進行可視化。使用R軟件(v3.3.2)進行相關(guān)性計算和作圖；使用Origin 8.5軟件(OriginLab Corp，MA，USA)進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對農(nóng)家豆瓣醬樣品中細菌多樣性進行了解析。16S rRNA測序結(jié)果及各分類學(xué)地位數(shù)量信息如表1所示。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量

由表1可知，高通量測序共產(chǎn)生了733 177 條高質(zhì)量的16S rRNA序列，平均每個樣品56 398 條。按照100%和97%相似度對序列進行劃分且去除嵌合體后共得到了33 036 個OTU。DBJ8樣品的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均最大，分別為3 233和8.33。由此可見，DBJ8樣品細菌多樣性豐度和多樣性均最大。

2.2 農(nóng)家豆瓣醬中細菌微生物的構(gòu)成分析

在門水平上，樣品中的細菌隸屬于23 個門，其中硬壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的平均相對含量分別為61.92%、21.18%和11.98%。在屬水平上，共發(fā)現(xiàn)530 個細菌屬，優(yōu)勢細菌屬(相對含量大于1.0%的細菌屬)相對含量比較分析如圖1所示。

由圖1可知，農(nóng)家豆瓣醬中相對含量大于1.0%的細菌屬共有12 個，其中隸屬于硬壁菌門的有芽孢桿菌屬(Bacillus，20.69%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，20.50%)、片球菌屬(Pediococcus，7.09%)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus，6.30%)和四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus，1.17%)；隸屬于放線菌門的有棒狀桿菌(Corynebacterium，7.42%)、短桿菌屬(Brevibacterium，1.71%)和短狀桿菌屬(Brachybacterium，1.19%)，而隸屬于變形菌門(Proteobacteria)的有腸桿菌屬(Enterobacter，3.64%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella，2.68%)、雷氏菌屬(Ralstonia，1.47%)、和沙門氏菌屬(Salmonella，1.03%)。由此可知，納入本研究的農(nóng)家豆瓣醬中的細菌主要是由隸屬于硬壁菌門的優(yōu)勢細菌屬構(gòu)成，其平均含量累計為55.65%。值得一提的是，芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和乳酸桿菌屬在13 個樣本中均存在，其累計平均含量為47.49%?；贠TU的UpSet圖如圖2所示。

由圖2可知，DBJ5與其他樣品的獨有OTU數(shù)量最多為631 個，其次是DBJ2和DBJ7分別為546和524，分別占其豆瓣醬樣品OTU總數(shù)的56.95%、37.07%和35.77%。同時，DBJ1和DBJ13中有102個相同OTU，DBJ2和DBJ5中有58個相同OTU。由此可見，雖然不同農(nóng)家豆瓣醬樣品中細菌屬的相對豐度存在著較大差異，但其細菌菌屬的種類卻有一定的相似趨勢，這也說明同一地區(qū)的豆瓣醬其菌群組成的相似性[20]。

圖1 農(nóng)家豆瓣醬中優(yōu)勢細菌屬相對含量的比較分析

圖2 基于OTU的UpSet圖

2.3 農(nóng)家豆瓣醬優(yōu)勢細菌屬及品質(zhì)的相關(guān)性分析

本研究首先使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對農(nóng)家豆瓣醬中細菌多樣性進行解析，再使用電子舌和電子鼻對其滋味和風(fēng)味品質(zhì)進行了評價，并構(gòu)建了優(yōu)勢細菌屬與品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖。農(nóng)家豆瓣醬樣品各滋味指標(biāo)相對強度的箱型圖如圖3所示。

圖3 農(nóng)家豆瓣醬滋味指標(biāo)相對強度值的箱形圖(n=13)

由圖3可知，農(nóng)家豆瓣醬在酸味上的差異最大，其次是豐度(鮮的回味)、鮮味和咸味；而在后味B(苦的回味)、苦味和后味A(澀的回味)上的差異相對較小。由此可知，酸味、鮮味和咸味可能是導(dǎo)致農(nóng)家豆瓣醬樣品滋味品質(zhì)差異的主要指標(biāo)。豆瓣醬風(fēng)味指標(biāo)強度如表2所示。

農(nóng)家豆瓣醬樣品的整體風(fēng)味品質(zhì)差異主要集中在W1C、W5S、W2S和W1S等風(fēng)味指標(biāo)上。由此可知，不同的農(nóng)家豆瓣醬其風(fēng)味品質(zhì)存在較大差異，且其風(fēng)味品質(zhì)的差異要大于滋味品質(zhì)。因豆瓣醬的滋味和風(fēng)味品質(zhì)均受發(fā)酵菌群的影響[21],本研究對樣本中優(yōu)勢細菌屬和感官指標(biāo)間的相關(guān)性進行分析。

表2 農(nóng)家豆瓣醬風(fēng)味指標(biāo)強度表(n=13)

由圖4可知，10 個品質(zhì)評價指標(biāo)與14 個優(yōu)勢菌屬之間存在顯著相關(guān)性(|r|>0.5,P<0.05)。值得注意的是，僅Weissella(魏斯氏菌屬)和Citrobacter(枸櫞酸桿菌屬)與風(fēng)味指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。鮮味、豐度、W1C、W3C和W5C均為豆瓣醬的優(yōu)良型指標(biāo)，而苦味、咸味、后味A和澀味則為缺陷型指標(biāo)，由此可見，優(yōu)勢細菌屬中魏斯氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)的增加，雷氏菌屬、鹽單胞菌屬(Halomonas)、棒狀桿菌(Corynebactenum)、短桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬的降低，且根瘤菌屬和草螺菌屬等維持在一定比例均有助于提高農(nóng)家豆瓣醬的產(chǎn)品品質(zhì)。

圖4 農(nóng)家豆瓣醬優(yōu)勢細菌屬和感官指標(biāo)相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 基于多元統(tǒng)計學(xué)分析農(nóng)家豆瓣醬細菌構(gòu)成

本研究就樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究?；贠TU水平進一步采用非加權(quán)的UniFrac距離主坐標(biāo)分析和UPGMA聚類分析對13 個豆瓣醬樣品的β多樣性進行了研究，結(jié)果如圖5所示。

圖5 基于分類操作單元的非加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析(A)和UPGMA聚類分析(B)

由圖5-A可知，13 個農(nóng)家豆瓣醬樣品呈現(xiàn)出明顯的分類趨勢，編號為DBJ1、DBJ3、DBJ9和DBJ13的豆瓣醬分為一類，編號為DBJ4、DBJ6、DBJ8、DBJ10、DBJ11和DBJ12的豆瓣醬樣品分為一類。由圖5-B可知，13 個農(nóng)家豆瓣醬樣品可分為2個聚類，其中聚類一由DBJ1、DBJ2、DBJ3、DBJ9和DBJ13構(gòu)成，聚類二由其他樣品構(gòu)成，兩者結(jié)果基本一致。由此說明，盡管納入本研究的農(nóng)家豆瓣醬樣品中均存在大量的核心細菌菌群，但在不同的樣品間其微生物群落結(jié)構(gòu)也存在較大的差異。以聚類分組為依據(jù)，對豆瓣醬樣品優(yōu)勢細菌屬、滋味指標(biāo)和風(fēng)味指標(biāo)進行Mann-Whiney檢驗發(fā)現(xiàn)，滋味和風(fēng)味指標(biāo)在兩者中均不存在顯著性差異，這可能是由于非加權(quán)UniFrac聚類分析未將菌群含量考慮在內(nèi)，但在優(yōu)勢細菌屬上面，芽孢桿菌屬、雷氏菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌和短狀桿菌屬均具有顯著性差異(P<0.05)，由此說明，樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異。

2.5 PICRUSt基因預(yù)測

本研究共計注釋到4195 COGs(蛋白質(zhì)直系同源簇)，這些COGs分別屬于23 個功能大類。以聚類分組為依據(jù)，對功能大類進行Mann-Whiney檢驗，其顯著差異功能大類相對豐度的箱型圖如圖6所示。

A-RNA的加工和修飾；B-染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)；C-能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換；G-碳水化合物的運輸和代謝；H-輔酶轉(zhuǎn)運和代謝；I-脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝；M-細胞壁/膜/包膜生物生成；N-細胞運動；Q-次生代謝產(chǎn)物的生物合成，轉(zhuǎn)運和分解代謝；S-功能未知；U-細胞內(nèi)運輸，分泌和囊泡運輸(下同)

由圖6可知，23 個功能大類中有10 個功能大類具有顯著性差異(P<0.05)，分別為A、B、C、G、H、I、M、N、Q和U。類別C、G、H、I、Q、U和M在所用樣品中占主導(dǎo)性地位。值得注意的是，聚類一中有更多的基因代表序列G和M，因此，聚類一中的細菌菌群對于碳水化合物的利用更加高效，細菌的生長也更加旺盛，更有利于豆瓣醬的發(fā)酵。COGs功能類群與優(yōu)勢細菌屬之間的秩相關(guān)熱圖如圖7所示。

由圖7可知，納入本研究的農(nóng)家豆瓣醬樣品中的優(yōu)勢細菌屬與COGs功能類群之間存在著明顯的相關(guān)關(guān)系。其中細胞壁/膜/包膜生物生成與芽孢桿菌屬呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，而與葡萄球菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬和短狀桿菌屬呈現(xiàn)顯著負相關(guān)；碳水化合物的運輸和代謝與克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、沙門氏菌屬和片球菌屬呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，而與短桿菌屬和短狀桿菌屬呈現(xiàn)顯著負相關(guān)。由此可見，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、片球菌屬和芽孢桿菌屬對豆瓣醬發(fā)酵過程具有促進作用。但結(jié)合圖4的結(jié)論可知，其相對豐度過高易對豆瓣醬滋味和風(fēng)味品質(zhì)造成影響。

圖7 COGs功能類群與優(yōu)勢細菌屬之間的秩相關(guān)熱圖

3 結(jié)論

本研究以荊州地區(qū)的農(nóng)家豆瓣醬為研究對象，使用Illumina MiSeq高通量測序、電子舌和電子鼻技術(shù)相結(jié)合的方式對其細菌多樣性進行解析，同時探討細菌對豆瓣醬品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)硬壁菌門、變形菌門和放線菌門的累計平均相對含量高達95.08%，而芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、片球菌屬和乳酸桿菌屬為其優(yōu)勢細菌屬，相對含量占細菌總數(shù)的62%。納入本研究的農(nóng)家豆瓣醬中雷氏菌屬、鹽單胞菌屬、棒狀桿菌、短桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬的降低可以顯著改善豆瓣醬的品質(zhì)。此外，優(yōu)勢細菌屬在碳水化合物的運輸與代謝、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換、細胞壁/膜/包膜生物生成、輔酶轉(zhuǎn)運和代謝和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝等方面發(fā)揮著積極作用。