石偉佳 劉芳

摘要：CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一個(gè)簡(jiǎn)單、有效的基因編輯技術(shù)，自2012年誕生以來已經(jīng)成為各個(gè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，被譽(yù)為21世紀(jì)目前為止生物技術(shù)領(lǐng)域的重大突破。本文討論了CRISPR/Cas9的進(jìn)展，根據(jù)其未來的發(fā)展?jié)摿C述了基因編輯技術(shù)在植物上的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯;檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)：S-3? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200229005

收稿日期：2019-12-10

1.1CRISPR/Cas9的發(fā)展歷程

CRISPR/Cas9是一種RNA介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可以保護(hù)細(xì)菌和古生菌免受病毒或質(zhì)粒的侵襲。早在1987年日本研究者在大腸埃希菌編碼的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了一些短的串聯(lián)重復(fù)序列和間隔序列，但其作用機(jī)制還不清楚[1]。隨著深入的研究，到2002年，這些特殊的序列被科學(xué)家正式命名為CRISPR。發(fā)現(xiàn)其可以與附近的Cas蛋白在功能上協(xié)同作用[2]。2005年，研究發(fā)現(xiàn)成簇間隔的短回文重復(fù)序列與免疫功能有關(guān)，是細(xì)菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種抵御外來DNA入侵的保護(hù)機(jī)制[3]。隨著研究的不斷深入，2008年，相關(guān)試驗(yàn)證明CRISPR作用在DNA的靶序列上，并證實(shí)了間隔序列可以轉(zhuǎn)錄加工成為成熟的crRNA [4]。2012年，Jinek等在新型基因編輯技術(shù)CRISPR的研究取得巨大進(jìn)步，其發(fā)現(xiàn)了Cas9蛋白，并表示Cas9是TypeⅡ型的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，由2種RNA指導(dǎo)核酸內(nèi)切酶對(duì)目標(biāo)DNA結(jié)合并進(jìn)行剪切[5]。2013年，利用CRISPR/Cas9切割人類細(xì)胞基因組的CC5基因，并表現(xiàn)出與人工嵌合RNA同樣的效果[6]。2016年，在微生物中發(fā)現(xiàn)2個(gè)新類型的CRISPR-Cas，將其命名為CRISPR/CasX和CRISPR/CasY[7]。2017年，我國(guó)科學(xué)家首次將基因編輯技術(shù)用于干細(xì)胞的遺傳增強(qiáng)[8]。到目前為止，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因治療、疾病模型構(gòu)建、核酸檢測(cè)、動(dòng)植物品種培育等領(lǐng)域，CRISPR-Cas9技術(shù)的廣泛應(yīng)用證明了這項(xiàng)發(fā)明的重要意義。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成與分類

CRISPR/Cas9是由crRNA，反式激活crRNA（trans-activatIngcrRNA， tracrRNA）和Cas蛋白3部分組成，3部分在DNA結(jié)構(gòu)上依次排列并形成tracrRNA，crRNA以及Cas9蛋白形成復(fù)合物，使其在特定的靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。Cas9蛋白含有HNH和RuvC功能域，HNH負(fù)責(zé)剪切與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，RucV負(fù)責(zé)剪切雙鏈DNA的另一條鏈（圖3）。由間隔序列相鄰基序（protospaceradjacent motIf，PAM）指導(dǎo)Cas9蛋白可以精準(zhǔn)的切割外源DNA。PAM位于結(jié)合區(qū)域的上游并與結(jié)合區(qū)域相鄰，通常是NGG（N為任意核苷酸，G為鳥嘌呤）3個(gè)堿基。在實(shí)際操作中，為了更加簡(jiǎn)單的操作，Jinek等通過接頭將crRNA和tracrRNA合并成為1條RNA鏈，從而形成單一指導(dǎo)RNA（single-guideRNA，sgRNA）。人工設(shè)計(jì)gRNA時(shí)，結(jié)合的區(qū)域也就是20nt，其位于gRNA的5'末端，作為指導(dǎo)序列靶序列互補(bǔ)配對(duì)。簡(jiǎn)單來說，改造后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需要在sgRNA指導(dǎo)下，就能完成Cas9蛋白對(duì)特定位點(diǎn)的剪切。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以分為3類，分別是TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ，TypeⅠ類型普遍存在于Cas3蛋白，Cas3是一種解旋酶/核酸酶，但是與DNA核酸酶和解旋酶活性不同。TypeⅡ類型是Cas9蛋白所必需的，其包含Ruvc結(jié)構(gòu)域和HNH結(jié)構(gòu)域，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)as9內(nèi)切酶活性至關(guān)重要。TypeⅢ類型需要大量的RAMP蛋白、Cas6和Cas9蛋白參與到crRNA對(duì)目標(biāo)DNA的切割。TypeⅢ類型不需要識(shí)別外源DNA序列上的PAM序列，但仍有降解外源DNA的能力，從而使其成為一個(gè)非特異性系統(tǒng)。

1.3CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理

CRISPR/Cas9可以產(chǎn)生與目標(biāo)序列互補(bǔ)的RNA序列，并通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式形成RNA-DNA結(jié)構(gòu)，之后，使Cas9核酸內(nèi)切酶對(duì)靶DNA剪切形成雙鏈斷裂的DNA（double strand break， DSB）。產(chǎn)生的DSB可以通過同源定向修復(fù)（homology-directed repair， HDR）途徑修復(fù)，也可以通過非同源末端鏈接（nonhomologous end-joining， NHEJ）途徑修復(fù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制可以總結(jié)為以下3步。

1.3.1第1步

外源DNA的入侵，外來的DNA首先被Cas蛋白識(shí)別，并隨后整合到CRISPR位點(diǎn)的2個(gè)相鄰的重復(fù)序列之間的間隔。

1.3.2第2步

CRISPR-RNA的產(chǎn)生，當(dāng)外源物質(zhì)再次入侵時(shí)，整合了外源DNA片段的CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄生成pre-crRNA和tracrRNA，pre-crRNA被核酸酶Ⅲ與tracrRNA切割形成成熟的cr-RNA[9]。

1.3.3第3步

CRISPR/Cas9系統(tǒng)剪接，pre-crRNA和crRNAs形成復(fù)合物，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性識(shí)別外來的DNA（或RNA），這種復(fù)合物降解外來DNA并維持噬菌體的免疫，此外，Cas9蛋白還可以與復(fù)合物形成結(jié)合，識(shí)別外來DNA序列上的PAM序列，行駛剪接功能（圖2）。

2CRISPR/Cas9在植物中的應(yīng)用

2.1基因敲除

CRISPR/Cas9導(dǎo)致特定基因下調(diào)或破壞目標(biāo)基因的表達(dá)，在很多植物中成功應(yīng)用。如在玉米上，美國(guó)杜邦公司利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除玉米中編碼淀粉合成酶的糯質(zhì)基因Wx1，從而培育出新的糯玉米品種[11]。在水稻上，CRISPR/Cas9誘導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)錄因子編碼基因OsERF922的靶向突變，從而增強(qiáng)其對(duì)稻瘟病真菌病原體的抗性[10]。利用水稻密碼子優(yōu)化Cas9基因，采用水稻U3啟動(dòng)子啟動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄，對(duì)水稻中的PDS基因定點(diǎn)突變，獲得了純合的基因敲除突變體[6]。在番茄上，用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除番茄slmapk3基因，相對(duì)于野生型植株，突變體表現(xiàn)出嚴(yán)重的葉片枯萎和彎曲，因此可以更深入地了解SlMAPK3基因介導(dǎo)的干旱調(diào)控機(jī)制[12]。

2.2同時(shí)編輯多個(gè)基因座

隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的在植物中不斷的應(yīng)用，其可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因同時(shí)編輯。該作用的發(fā)揮需要Cas9與多種不同的sgRNA融合來實(shí)現(xiàn)。如，嵌合導(dǎo)向RNA（cgRNA）可以靶向小麥中2種不同的基因肌醇加氧酶（inositol oxygenase， inox）和八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase， pds）基因[13] 。

2.3基因置換

利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)靶基因置換或敲入，將外源DNA整合到基因組中所需的位點(diǎn)。如，將潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hygromycin phosphotransferase，HPT）通過同源重組的方法成功整合到大豆的第4條染色體上[14]?；蛑脫Q可以通過Cas9-sgRNA載體共轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)，或者通過合成含有供體序列或與單一供體序列的Cas9-sgRNA的表達(dá)盒。

2.4產(chǎn)生無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物

轉(zhuǎn)基因可以將外源基因隨機(jī)的整合到染色體上，還可以通過水平基因轉(zhuǎn)移到同一物種的非轉(zhuǎn)基因植物或者其它物種的植物上。然而，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以避免這種現(xiàn)象發(fā)生，sgRNA與Cas9形成復(fù)合體，指導(dǎo)Cas9對(duì)特定序列進(jìn)行精確突變，其作用對(duì)象不是整條染色體。CRISPR/Cas9復(fù)合體會(huì)在細(xì)胞內(nèi)降解，不會(huì)遺傳給下一代。已經(jīng)在小麥中利用CRISPR/Cas9引入DNA或RNA，并通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化愈傷組織細(xì)胞的方法，可以得到無轉(zhuǎn)基因的、純合的T0代小麥突變體[15]。

3基因編輯與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的比較

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgentic Technology）是指從植物中分離得到或經(jīng)過修飾的目的基因?qū)氲街参矬w內(nèi)，使其在植物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)和遺傳。簡(jiǎn)單說，轉(zhuǎn)基因是將外源DNA隨機(jī)整合到染色體上，所以，轉(zhuǎn)基因技術(shù)無論是在過程中還是在最后得到的植株中都會(huì)涉及外源DNA的導(dǎo)入。利用CRISPR/Cas9在最后得到的植株中不存在外源DNA，是將DNA序列插入到染色體的特定位置上與傳統(tǒng)的育種方式得到的植株無法區(qū)分，所以，基因編輯技術(shù)相對(duì)更容易被接受且更安全。美國(guó)農(nóng)業(yè)部宣布，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的到的蘑菇和玉米不屬于轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的范圍[16];利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以精確目標(biāo)位點(diǎn)，使基因型與表型聯(lián)系起來，減少了篩選轉(zhuǎn)基因植株導(dǎo)致的DNA隨機(jī)插入的樣本數(shù)量，從而可以確切的判斷基因的功能，使研發(fā)時(shí)間和成本有所下降。總之，利用基因編輯得到植物中不含有轉(zhuǎn)基因成分，相比之下，更容易被人們接受。

4基因編輯植物檢測(cè)方法

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)剪切的DNA雙鏈，經(jīng)過細(xì)胞的自我修復(fù)，將DNA雙鏈連接起來，沒有涉及到外源基因的加入，獲得的植物中不帶任何標(biāo)記，與經(jīng)過基因突變的植物并無明顯區(qū)別。

目前對(duì)基因編輯植物檢測(cè)最常用的方法是PCR/RE。利用該方法需要滿足的條件是gRNA靶序列內(nèi)存在限制性酶切位點(diǎn)。經(jīng)基因編輯得到的陽性植株靶序列的酶切位點(diǎn)突變，而不能被內(nèi)切酶識(shí)別，而野生型植株中存在酶切位點(diǎn)可以被相應(yīng)的酶識(shí)別。該方法可以檢測(cè)單等位基因和雙等位基因突變，但是不能區(qū)分雙等位基因純合子或雜合突變體[17]。

還有一種檢測(cè)方法-Sanger測(cè)序法，該方法在檢測(cè)植物編輯中也較為常用。但是該方法只能確定靶序列是否發(fā)生突變，不能對(duì)突變類型進(jìn)一步確定。PCR-Sequencing最終也是利用Sanger法，該技術(shù)通過對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果的峰值進(jìn)行比較，確定基因組位點(diǎn)是否發(fā)生突變[18]，雖然這種方法確定突變位點(diǎn)較為精確，但是此方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，只適用于對(duì)少量的靶位點(diǎn)進(jìn)行分析，對(duì)于公司或者大批量檢測(cè)基因編輯來說效率不高。

CRISPR/Cas9作為第3代基因編輯系統(tǒng)，近幾年的迅速發(fā)展和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，其在基因編輯的精確性和高效性方面已經(jīng)不可替代，受到科研人員的重視和關(guān)注。利用基因編輯技術(shù)得到的植物新品種中不存在外源DNA，可以使植物的培育過程更加安全。開發(fā)出一個(gè)省時(shí)、省力、高效的方法來檢測(cè)基因編輯的植物，這也使科研人員所面臨更大的挑戰(zhàn)。

5展望

CRISPR/Cas9作為一種操作簡(jiǎn)單、有效、精確度高的基因編輯技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。盡管CRISPR/Cas9被成功用于植物基因組編輯，但也存在很多風(fēng)險(xiǎn)。如，最小化脫靶機(jī)制，并闡述這種機(jī)制，如何對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，以及開發(fā)出一種對(duì)植物基因組編輯檢測(cè)的有效方法。這需要對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行更加深入的研究，以促進(jìn)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在未來會(huì)創(chuàng)造更大的價(jià)值。

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