孔欣　張樹林　戴偉　張達(dá)娟　畢相東

摘要：通過室內(nèi)試驗(yàn)研究不同磷濃度條件下氮磷比對(duì)小球藻（Chlorella vulgaris）生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在低磷濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）和中磷濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，小球藻密度隨著氮磷比增大呈先升高后下降趨勢(shì)。磷濃度為0.8mg/L條件下，N∶P=40∶1時(shí)，小球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值;磷濃度為1mg/L條件下，N∶P=30∶1時(shí)，小球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值。以上研究結(jié)果表明，小球藻生長(zhǎng)既受氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度水平影響又受氮磷比值影響。

關(guān)鍵詞：小球藻;磷;氮磷比;生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200215003

收稿日期：2019-12-20

基金項(xiàng)目：天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：18JCZDJC97800）;天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：19JCYBJC30000）;天津現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-水產(chǎn)-水質(zhì)調(diào)控崗位（項(xiàng)目編號(hào)：ITTFR2017015）;天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“天津現(xiàn)代水產(chǎn)生態(tài)健康養(yǎng)殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)” （項(xiàng)目編號(hào)：TD13-5089）

作者簡(jiǎn)介：孔欣（1995-），女，碩士，研究方向：養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控;通訊作者張樹林（1963-），男，教授，研究方向：養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控。

營(yíng)養(yǎng)鹽是水體中浮游生物賴以生存的主要營(yíng)養(yǎng)來源，其組成和含量直接影響生物的代謝活動(dòng)及藻類的生長(zhǎng)情況[1]。其中，氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽被認(rèn)為是藻類生長(zhǎng)過程中最關(guān)鍵的2個(gè)限制因素。氮磷會(huì)直接影響藻類吸收和同化的效率，進(jìn)而影響藻類的生長(zhǎng)和胞內(nèi)物質(zhì)的積累[2]。另外，氮和磷的作用需要相互配合，不同藻類對(duì)氮磷的需求量也不同。一般在低氮磷濃度下，藻類生長(zhǎng)緩慢，隨著濃度增加，生長(zhǎng)速率逐漸增高[3]。李小梅等得出微藻在氮磷比等于16時(shí)生物量最大，在氮磷限制情況下生長(zhǎng)速率明顯降低，并影響藻細(xì)胞的最大光能轉(zhuǎn)化速率和實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率[4]。

小球藻是水體微藻中的重要資源，有生長(zhǎng)速度快、環(huán)境耐受力強(qiáng)等特點(diǎn)[5]。此外，其還可以吸收水體中大量的氮磷作為自身生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，既抑制了有害藻類，凈化水體環(huán)境，又為其他水生生物提供了餌料[6]。Wu等指出無論氮濃度或高或低，小球藻都可以適應(yīng)生長(zhǎng)，但缺少磷源的情況下卻難以存活，磷是小球藻的限制因子[7]。因此，本文通過配制不同磷濃度下不同氮磷比的培養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻，通過細(xì)胞密度變化及生長(zhǎng)速率變化探究不同磷濃度下氮磷比對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響，以期為小球藻大規(guī)模培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

試驗(yàn)用小球藻藻株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

[JP2]將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻藻液離心（5000r/min，5min）后獲得的沉淀用無菌水重復(fù)洗滌3次，然后加入到未添加尿素和 K2HPO4的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基中，初始藻液密度為2×106個(gè)/mL，再加入不同濃度的尿素和 K2HPO4，用尿素和 K2HPO4調(diào)節(jié)所需氮磷比。設(shè)置磷濃度為低濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）、中濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）和高濃度（0.8mg/L、1mg/L），氮磷質(zhì)量比分別為 2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、60∶1。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。試驗(yàn)為期10d，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lux，光暗比12h∶12h，每隔24h取藻液測(cè)定其在波長(zhǎng)680nm下的吸光度。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別測(cè)定不同濃度梯度下小球藻藻液在波長(zhǎng)680nm的吸光度，并用顯微鏡計(jì)數(shù)相應(yīng)吸光度下小球藻的細(xì)胞密度，擬合藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 藻細(xì)胞密度測(cè)定

利用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)680nm下測(cè)定小球藻吸光度值，經(jīng)過藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到小球藻藻細(xì)胞密度。

1.3.3 比增長(zhǎng)率的計(jì)算

參考易文利文獻(xiàn)[8]計(jì)算小球藻比增長(zhǎng)率，計(jì)算公式如下：

式中，Nt為第 t 天時(shí)的藻細(xì)胞密度;N0為某一時(shí)間間隔開始時(shí)的藻細(xì)胞密度;Δt為某一時(shí)間間隔。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，用SPSS18.0中one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，LSDS多重比較檢驗(yàn)各試驗(yàn)組間是否具有顯著差異（P <0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線

本試驗(yàn)測(cè)得的小球藻藻細(xì)胞密度和吸光度之間的關(guān)系如圖1所示。試驗(yàn)過程中測(cè)得藻液在波長(zhǎng)680nm下的吸光度，即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出藻細(xì)胞密度。

2.2 不同磷濃度下氮磷比對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

如圖2所示，低磷濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)低氮磷比試驗(yàn)組與高氮磷比試驗(yàn)組差異顯著（P<0.05）。中磷濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度呈升高趨勢(shì)。在前2d內(nèi)，不同氮磷比試驗(yàn)組小球藻細(xì)胞密度均無顯著差異（P>0.05）。從第3天開始，氮磷比為2∶1試驗(yàn)組小球藻細(xì)胞密度顯著低于其他試驗(yàn)組。培養(yǎng)至第5天后，氮磷比為60∶1試驗(yàn)組小球藻細(xì)胞密度開始顯著高于其余各試驗(yàn)組細(xì)胞密度（P<0.05）。

在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，小球藻密度隨著氮磷比增大呈先升高后下降趨勢(shì)。磷濃度為0.8mg/L條件下，N∶P=40∶1時(shí)小球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值（3.1×107個(gè)/mL），隨著氮磷比值繼續(xù)增大，小球藻密度顯著下降;磷濃度為1mg/L條件下，N∶P=30∶1時(shí)小球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值（3.4×107個(gè)/mL），隨著氮磷比值繼續(xù)增大，小球藻密度呈下降趨勢(shì)。磷含量為0.8mg/L時(shí)，高氮磷比組小球藻細(xì)胞密度顯著高于低氮磷比組（P<0.05）。

2.3 不同磷濃度下氮磷比對(duì)小球藻比增長(zhǎng)率的影響

如圖3所示，每種磷濃度下，不同氮磷比試驗(yàn)組間小球藻比生長(zhǎng)率均存在顯著差異（P<0.05）。低磷與中磷濃度下隨著氮磷比值升高，小球藻比生長(zhǎng)率呈升高趨勢(shì)，均在氮磷比為60∶1時(shí)達(dá)到最大值。但在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，隨著氮磷比值升高，小球藻比增長(zhǎng)率呈先升高后下降趨勢(shì)。在P=0.8mg/L，N∶P=40∶1時(shí)，小球藻比增長(zhǎng)率最高;P=1mg/L，N∶P=30∶1時(shí)，小球藻比增長(zhǎng)率最高。

3 討論

在浮游植物生長(zhǎng)過程中，營(yíng)養(yǎng)鹽的輸入起關(guān)鍵性作用[9]。一般來說，氮和磷是影響藻類生長(zhǎng)最重要的限制性因素，并且氮和磷的作用也是相互的[10]。本試驗(yàn)顯示，在磷濃度低于0.6mg/L時(shí)，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。孟順龍研究得出，小球藻藻細(xì)胞隨著氮磷的增加而增加，豐富的氮磷濃度可使小球藻快速生長(zhǎng)，在一定范圍內(nèi)，高氮磷組最適合生長(zhǎng)，與本試驗(yàn)結(jié)果相一致[11]。在高氮磷比水體中，浮游藻類會(huì)利用水體中的氮磷元素進(jìn)行大量繁殖，使水層的透光率大大降低，抑制其他有害藻類的正常生長(zhǎng)，對(duì)緩解水體富營(yíng)養(yǎng)化起著積極作用[12]。但藻類生長(zhǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏對(duì)其生長(zhǎng)量和脂肪產(chǎn)量也有顯著影響[13]。當(dāng)?shù)夭蛔銜r(shí)會(huì)影響藻類細(xì)胞內(nèi)的氨基酸合成;磷元素不足時(shí)影響藻類的光合轉(zhuǎn)化效率，削弱藻細(xì)胞的光合作用，使其生長(zhǎng)停滯不前[14]。許可等研究表明當(dāng)磷濃度小于0.4mg/L時(shí)，氮磷比越低，小球藻的生長(zhǎng)和光合作用越會(huì)受到抑制[15]。

在本研究選取的高磷濃度范圍內(nèi)，低氮磷比下小球藻生長(zhǎng)速率最低，并且隨著氮磷比升高，小球藻生長(zhǎng)速度呈先上升后下降趨勢(shì)。低氮磷比時(shí)由于培養(yǎng)基中磷充足，使得小球藻過量吸收，細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存更多的磷，為快速生長(zhǎng)提供了物質(zhì)條件[16]。但并不是氮磷比越高小球藻生長(zhǎng)就越好，過高的氮磷比反而會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng)。劉聰?shù)贸龅谞I(yíng)養(yǎng)物過高或過低都會(huì)顯著影響小球藻的生長(zhǎng)和色素的積累[17]。因此在培養(yǎng)小球藻時(shí)，選擇合適的氮磷比才可以促進(jìn)小球藻的快速生長(zhǎng)。

磷是合成DNA和RNA的重要物質(zhì)，也是影響小球藻生長(zhǎng)的主要因素。當(dāng)磷濃度過低時(shí)，導(dǎo)致藻細(xì)胞分裂速度減慢，吸收氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽受限制，使其不能快速生長(zhǎng)[18]。本試驗(yàn)中，在氮磷比相同的情況下，磷濃度越高，小球藻密度越大。馬彩虹等研究得出在高磷濃度下小球藻的生物量和比增長(zhǎng)速率高于低磷濃度水平[19]。低磷濃度下小球藻受到的抑制作用相對(duì)較大，削減其光合效率，被吸收的光能直接轉(zhuǎn)化成熱和熒光發(fā)射[20]。

4 結(jié)論

低磷水平和中磷水平下氮磷比值為2∶1～60∶1范圍內(nèi)，低氮磷比不利于小球藻生長(zhǎng)，高氮磷比有利于小球藻生長(zhǎng);高磷水平下，小球藻生長(zhǎng)在一定的氮磷比值范圍內(nèi)隨氮磷比升高而加快，但過高的氮磷比反而會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng)。因此，在高密度培養(yǎng)小球藻時(shí)，氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽是一個(gè)重要影響因素，適宜的氮磷濃度及氮磷比可以使小球藻快速增殖。

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（責(zé)任編輯 賈燦）