田 甜，周小明

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 分子生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

1987年，Ishino等[1]在克隆大腸桿菌堿性磷酸酶同工酶(alkaline phosphatase isozyme,iap)基因編碼序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)域附近存在間隔串聯(lián)重復(fù)的DNA片段，但當(dāng)時(shí)未能確定這些保守的重復(fù)序列的生物學(xué)功能。隨后的1989年，Mojica等[2]在研究地中海嗜鹽菌(Haloferaxmediterranei)限制性?xún)?nèi)切酶切割微生物基因-Psfl的鹽影響過(guò)程中，意外發(fā)現(xiàn)該基因的DNA片段里有一些呈回文式對(duì)稱(chēng)的，每段有30個(gè)堿基，且片段之間包含36個(gè)堿基的間隔序列隔開(kāi)的多拷貝重復(fù)序列的結(jié)構(gòu),而這個(gè)結(jié)構(gòu)與任何已知的微生物的重復(fù)序列家族都不相同。Mojica隨后用BLAST等生物信息工具，從一種大腸桿菌測(cè)序到的一個(gè)基因位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了其中一個(gè)spacer與一種P1噬菌體的序列相匹配,而這個(gè)噬菌體能感染多種大腸桿菌[3-5]。荷蘭烏得勒支大學(xué)的Jansen[6]同樣利用生物信息工具對(duì)一系列古細(xì)菌和細(xì)菌的重復(fù)序列進(jìn)行了分析，并首次將這個(gè)重復(fù)序列命名為CRISPR(clustered regularly interspaced palindromic repeats)，即成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)。他在這一研究過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)了一些與序列功能有關(guān)的核酸酶，統(tǒng)稱(chēng)為CRISPR-associated蛋白, 即Cas蛋白。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)CRISPR中的居間序列并非細(xì)菌自身染色體所擁有，而是和很多外源的細(xì)菌、病毒和質(zhì)粒等序列存在很大的相似性。基于這一事實(shí)，科學(xué)家推測(cè)并隨后證實(shí)CRISPR-Cas是細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)[7]。當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌通過(guò)一些特殊方式保留了噬菌體的部分DNA片段，并將其整合到CRISPR序列之中，對(duì)外源入侵者的序列信息產(chǎn)生了“記憶”，當(dāng)下次再次受到噬菌體感染時(shí)，就可以利用這些序列信息識(shí)別并破壞外源入侵者。

2012年，兩個(gè)獨(dú)立的小組分別重構(gòu)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)并實(shí)現(xiàn)了精確的體外DNA切割[8,9]。他們的試驗(yàn)證明：成熟的crRNA(CRISPRRNA)可以和反式編碼RNA(tracerRNA)通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以指導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)目標(biāo)雙鏈DNA進(jìn)行剪切。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明所有Cas9蛋白都具有保守的由兩個(gè)葉組成的結(jié)構(gòu)核心(圖1)[10]：核酸酶葉包含HNH和RuvC的內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域，這兩者通過(guò)橋螺旋相連，分別切割與crRNA序列互補(bǔ)的靶DNA鏈和非互補(bǔ)鏈。識(shí)別具有α-螺旋和拓?fù)洚悩?gòu)酶同源的結(jié)構(gòu)域，對(duì)于引導(dǎo)RNA(guide RNA)的重復(fù)：抗重復(fù)RNA雙鏈體以及tracrRNA的莖環(huán)1的結(jié)合是至關(guān)重要的。結(jié)果表明，crRNA：tracrRNA可以通過(guò)基因工程嵌合成單個(gè)指導(dǎo)RNA(sgRNA)。Cas9通過(guò)識(shí)別并定位原型間隔區(qū)相鄰基序(protospacer-adjacent motifs,PAM)來(lái)搜索靶標(biāo)，PAM位點(diǎn)是位于靶dsDNA的非互補(bǔ)鏈下游的短的保守序列(NGG)。識(shí)別PAM后啟動(dòng)dsDNA解旋，使crRNA鏈與靶標(biāo)鏈配對(duì)形成R-環(huán)狀復(fù)合體。值得注意的是，crRNA和靶DNA之間前8～10個(gè)堿基對(duì)互補(bǔ)對(duì)于靶識(shí)別和結(jié)合尤為重要，該區(qū)域中的錯(cuò)配會(huì)顯著降低Cas9-靶標(biāo)結(jié)合的親和力，而PAM-遠(yuǎn)端區(qū)域的錯(cuò)配通常不會(huì)影響結(jié)合。另外，對(duì)Cas9的結(jié)構(gòu)的研究揭示了HNH結(jié)構(gòu)域是可移動(dòng)的，當(dāng)Cas9與和crRNA具有完全互補(bǔ)性的靶結(jié)合時(shí)優(yōu)先采用催化構(gòu)象,同時(shí)HNH結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動(dòng)也可變構(gòu)調(diào)節(jié)RuvC結(jié)構(gòu)域，確保進(jìn)行兩條鏈的高保真切割[11,12]。

圖1 Cas9識(shí)別PAM依賴(lài)性靶DNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[10]Fig.1 Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease[10](a)指導(dǎo)核酸(sgRNA)和靶核酸的示意圖?？盏臋E圓表示在電子密度中未觀察到的核苷酸；(b)sgRNA-靶標(biāo)-DNA四向連接的正交圖；(c)Cas9-sgRNA-DNA復(fù)合體的前視圖和后視圖。RNA均為橙色，目標(biāo)DNA鏈為淺藍(lán)色，非目標(biāo)DNA鏈為黑色。非目標(biāo)鏈中的5′-NGG-3′PAM三核苷酸以黃色突出顯示(a)Schematic diagram of guide and target nucleic acids. Empty ovals denote nucleotides not observed in the electron density;(b)Orthogonal views of the sgRNA-target-DNA four-way junction;(c)Front and rear views of the Cas9-sgRNA-DNA complex. In all panels guide RNA is coloured orange, target DNA strand in light blue and non-target DNA strand in black. The 5′-NGG-3′ PAM trinucleotide in the non-target strand is highlighted in yellow

II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及后續(xù)開(kāi)發(fā)極大的革新了基礎(chǔ)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展。通過(guò)簡(jiǎn)單地設(shè)計(jì)與鄰近PAM的所需DNA靶向位點(diǎn)配對(duì)的sgRNA，可以輕松實(shí)現(xiàn)Cas9對(duì)目標(biāo)DNA的靶向。以SpCas9為例，在基因組中每8 bp就可以找到一個(gè)NGG，因此CRISPR-Cas9系統(tǒng)幾乎可以靶向任何感興趣的基因。而來(lái)自其他物種的Cas9可以識(shí)別不同的PAM位點(diǎn)，要求不同的互補(bǔ)堿基數(shù)目并包含多種序列組成，這進(jìn)一步擴(kuò)展了Cas9可靶向的基因組序列的范圍。因?yàn)槠涑绦蛐?、?jiǎn)易性、高度的特異性，學(xué)術(shù)界馬上認(rèn)識(shí)到CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域的巨大潛力，并于2013年首先實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的基因編輯。由于CRISPR/Cas9的可工程化，近年來(lái)，除了應(yīng)用于基因編輯之外，其在基因表達(dá)調(diào)控、染色體重組、基因成像、基因檢測(cè)等領(lǐng)域也得到了大量的應(yīng)用[13-15]。在本文中，我們聚焦于綜述CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因檢測(cè)中的應(yīng)用，并展望將來(lái)的研究方向。

1 基于Cas9蛋白剪切的基因檢測(cè)

第一個(gè)將Cas9應(yīng)用于基因檢測(cè)的案例利用了PAM依賴(lài)的特異性剪切的功能[16]。像前面述說(shuō)的，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)基因的識(shí)別首先依賴(lài)于對(duì)PAM位點(diǎn)的搜索和定位，所以PAM位點(diǎn)的存在是基因剪切的前提。如果缺失PAM位點(diǎn)，即使sgRNA與靶序列發(fā)生完全的互補(bǔ)也將不能使DNA雙鏈發(fā)生解鏈及后續(xù)的切割反應(yīng)。Cas9的這一特性曾被用來(lái)發(fā)展一種鑒別寨卡病毒譜系的新技術(shù)[16]。在該方法中，PAM位點(diǎn)僅存在于美洲譜系寨卡序列中，只有美洲型序列能被Cas9切割，這導(dǎo)致截短的RNA的擴(kuò)增，而非全長(zhǎng)的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不激活傳感器開(kāi)關(guān)。相反，非洲型序列不含有PAM位點(diǎn)，從而免受Cas9切割，這導(dǎo)致全長(zhǎng)RNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物激活RNA傳感器開(kāi)關(guān)。該方法可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)提供精確的基因型信息。

基于CRISPR/Cas9剪切的技術(shù)也被應(yīng)用于HPV病毒分型檢測(cè)。HPV16和18型是引起宮頸癌病變的兩種主要病毒亞型。通過(guò)設(shè)計(jì)可以特異性識(shí)別HPV16和18型的sgRNA，并對(duì)HPV DNA進(jìn)行切割，切割后的DNA鏈將不能進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用定量PCR方法來(lái)評(píng)價(jià)切割底物的濃度從而可以判別病毒序列[17]。CRISPR/Cas9剪切也促使發(fā)展了一種高信噪比的基因突變檢測(cè)方法。循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)已成為潛在的腫瘤特異性生物標(biāo)志物，可用于早期檢測(cè)各種癌癥。然而由于血漿中存在的極少量的ctDNA，有效的檢測(cè)手段必須依賴(lài)高效率的富集技術(shù)?；贑RISPR/Cas9剪切，一種名叫CUT-PCR的技術(shù)可以在存在大量野生型DNA片段的情況下，通過(guò)剪切野生型序列，高效富集和檢測(cè)極少量的腫瘤DNA片段[18]。該方法通過(guò)使用各種直系同源CRISPR內(nèi)切核酸酶如SpCas9和FnCpf1來(lái)計(jì)算，CUT-PCR方法將適用于COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的80%的已知癌癥相關(guān)替代突變。CUT-PCR被證明可以結(jié)合深度測(cè)序?qū)崿F(xiàn)更廣泛的癌基因檢測(cè)，具有高靈敏度(0.01%)和準(zhǔn)確度，優(yōu)于傳統(tǒng)的靶向深度測(cè)序。與此同時(shí)，CUT-PCR也被成功應(yīng)用于檢測(cè)結(jié)直腸癌患者中血液ctDNA的致癌突變序列，證明該技術(shù)可用于早期診斷各種類(lèi)型的癌癥。我們小組也應(yīng)用Cas9對(duì)單鏈DNA切割的功能，發(fā)展了Cas-EXPER技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單堿基水平的基因檢測(cè)和單堿基分辨的甲基化的檢測(cè)[19]。

下一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為一種優(yōu)勢(shì)的分子診斷方法，然而，高豐度的非靶序列對(duì)測(cè)序結(jié)果的深度和靈敏度會(huì)產(chǎn)生干擾。在測(cè)序之前去除不需要的高豐度的序列對(duì)改善測(cè)序數(shù)據(jù)具有廣泛意義。Gu等[20]介紹了一種通過(guò)雜交消耗高豐富多余序列(DASH)的方法巧妙的實(shí)現(xiàn)這一目的。在該方法中，測(cè)序文庫(kù)與重組Cas9蛋白、sgRNA文庫(kù)混合，其中sgRNA靶向不需要的序列并引導(dǎo)Cas9對(duì)其切割，從而防止它們消耗測(cè)序空間。該工作在對(duì)患者樣品中的病原體序列測(cè)序證明可以減少高達(dá)99%的HeLa細(xì)胞中的線粒體rRNA，并展示了DASH方法在癌癥檢測(cè)中的應(yīng)用。這種簡(jiǎn)單的方法可以適用于任何樣品類(lèi)型，并且無(wú)需額外成本即可提高測(cè)序產(chǎn)率。

該方法隨后被另一個(gè)獨(dú)立的課題組應(yīng)用于小RNA(smRNA)測(cè)序研究[21]。在smRNA測(cè)序中，高度豐富的分子如銜接子二聚體產(chǎn)物和組織特異性microRNA(miRNA)會(huì)抑制低表達(dá)序列的準(zhǔn)確定量。特別是銜接子二聚體連接產(chǎn)物，除非通過(guò)凝膠分離除去，否則非常難以去除。在該研究中，DASH被用于切除miRNA和銜接子二聚體，該方法被稱(chēng)為MAD-DASH。在MAD-DASH中，Cas9與靶向銜接子二聚體連接產(chǎn)物以及高度表達(dá)的組織特異性smRNA的sgRNA結(jié)合，用于體外切割。該過(guò)程顯著降低了銜接子二聚體和靶向的smRNA序列，并且具有低的脫靶效應(yīng)，大大改善了人血漿和組織衍生RNA的低表達(dá)miRNA的定量和讀取深度，并且不需要凝膠分離，大大提高了樣品通量。此外，該方法可完全根據(jù)其他smRNA-seq制備方法進(jìn)行定制。應(yīng)用類(lèi)似的原理，一種名為FLASH技術(shù)被用于富集低豐度的病原體抗菌素耐藥性序列[22]。FLASH技術(shù)使用一組Cas9的sgRNA，并設(shè)計(jì)用于將感興趣的序列切割成適合Illumina測(cè)序的大小片段。輸入基因組DNA或cDNA首先被磷酸酶處理阻斷，然后用于這組sgRNA混合的Cas9酶切消化(圖2)。因此，所得的切割產(chǎn)物能夠連接通用測(cè)序銜接子。通過(guò)擴(kuò)增，靶向序列得到富集并用于流式池測(cè)序。這種方法超越了其他基于CRISPR的診斷工具，因?yàn)樗蓪?shí)現(xiàn)高水平的多重應(yīng)用(高達(dá)數(shù)千個(gè)目標(biāo))。

圖2 FLASH方法概述[22]Fig.2 Overview of the FLASH method[22]首先用磷酸酶處理來(lái)封閉基因組DNA或cDNA，然后用基于靶向目標(biāo)基因的指導(dǎo)的Cas9/sgRNA復(fù)合物進(jìn)行消化。 隨后，連接測(cè)序適配器，擴(kuò)增和測(cè)序Genomic DNA or cDNA is first blocked with phosphatase treatment and then digested with Cas9 complexed to a set of guide RNAs targeting genes of interest. Ligation of sequencing adaptors, amplification and sequencing follows

2 失活的Cas9蛋白(dCas9)應(yīng)用于基因檢測(cè)

雖然野生型Cas9蛋白是核酸酶，但通過(guò)生物工程可以獲得核酸酶缺陷型的Cas9(dCas9)。dCas9是通過(guò)在Cas9的RuvC(D10A)和HNH核酸酶(H840A)結(jié)構(gòu)域中分別點(diǎn)突變而獲得。先前的工作已顯示該突變體Cas9在體外缺乏核酸酶活性，因此dCas9可以極大地?cái)U(kuò)展CRISPR技術(shù)的功能庫(kù)，包括最初期應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控和成像。近年來(lái)，將dCas9應(yīng)用于基因檢測(cè)也獲得了廣泛的興趣和關(guān)注。Lou等[23]基于dCas9發(fā)展了一種體外DNA檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用一對(duì)dCas9蛋白連接到半分裂的熒光素酶。當(dāng)該報(bào)告探針對(duì)與由sgRNA限定的～44 bp靶序列共定位后誘導(dǎo)生物發(fā)光。該系統(tǒng)以高特異性和靈敏度實(shí)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌DNA的檢測(cè)。隨后，Koo等[24]發(fā)展了一種結(jié)合dCas9和單微環(huán)諧振體生物傳感器的分子診斷技術(shù)，實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)檢測(cè)致病性DNA和RNA。通過(guò)使用這種CRISPR/dCas9介導(dǎo)的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了單分子靈敏度檢測(cè)蜱傳疾病中的恙蟲(chóng)病(檢測(cè)限=0.54 amol/L)和伴有血小板減少癥的嚴(yán)重發(fā)熱(LOD=0.63 amol/L)，這種檢測(cè)靈敏度比RT-PCR檢測(cè)靈敏度高100倍?；赿Cas9與靶基因結(jié)合，然后結(jié)合非特異性的SBGRI染料應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，獲得了10 CFU/mL的靈敏度[25]。另一項(xiàng)工作結(jié)合dCas9和離子濃度極化(ion concentration polarization，ICP)現(xiàn)象來(lái)選擇性預(yù)濃縮目標(biāo)DNA分子從而實(shí)現(xiàn)了DNA的直接檢測(cè)。該研究通過(guò)闡明納米結(jié)附近的兩種可區(qū)分的堆積和擴(kuò)散行為，并調(diào)節(jié)臨界遷移率來(lái)改變這些行為，在沒(méi)有PCR擴(kuò)增的情況下實(shí)現(xiàn)光學(xué)檢測(cè)C-C趨化因子受體5型序列[26]。這種基于ICP及dCas9介導(dǎo)的基因檢測(cè)方法將為疾病診斷提供快速和準(zhǔn)確的微/納米流體活檢平臺(tái)。固態(tài)納米孔是一種有前景的生物傳感平臺(tái)。在納米孔試驗(yàn)中，作者觀察到CRISPR-dCas9蛋白質(zhì)結(jié)合靶DNA后表現(xiàn)出明顯的電流阻斷信號(hào)，這種檢測(cè)方式可以方便地識(shí)別靶序列。即使在納米孔試驗(yàn)所需的高鹽條件(1 mol/L LiCl)下，發(fā)現(xiàn)dCas9蛋白仍然穩(wěn)定結(jié)合。這種基于納米孔的CRISPR-dCas9生物傳感方法在基于DNA分型的診斷中的應(yīng)用，例如快速的菌株鑒定，抗生素抗性檢測(cè)和基因組分型中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[27]。

大多數(shù)檢測(cè)核酸的方法仍然需要昂貴的儀器和試劑。近來(lái)，Hajian等[28]報(bào)道了一種稱(chēng)作為CRISPR-Chip的生物傳感器，該傳感器利用了dCas9的基因靶向能力，通過(guò)與特異性sgRNA復(fù)合并固定在晶體管上，產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記的核酸檢測(cè)裝置。該裝置輸出信號(hào)可以用簡(jiǎn)單的手持器件測(cè)量。CRISPR-Chip分析了從表達(dá)藍(lán)色熒光蛋白的HEK293T細(xì)胞系收集的DNA樣品，以及在具有肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的個(gè)體中的DNA臨床樣品。在含有靶基因的基因組DNA存在下，CRISPR-Chip在不需要核酸擴(kuò)增的前提下獲得了1.7 fmol/L的靈敏度，且檢測(cè)過(guò)程在15 min內(nèi)完成。

近來(lái)發(fā)展的一種CRISPR介導(dǎo)的基因組的特定兆堿基區(qū)域的分離技術(shù)也是基于dCas9的分離富集功能。該技術(shù)能夠?qū)蚪M的連續(xù)兆堿基區(qū)段進(jìn)行靶向分離。靶向分離純化后的DNA區(qū)段的直接測(cè)序可以具有>100倍的靶區(qū)域富集，因此理論上能夠探索任何物種中復(fù)雜基因組區(qū)域的DNA序列和結(jié)構(gòu)多樣性。該方法解決了準(zhǔn)確評(píng)估連續(xù)的megabase DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)變異所固有的技術(shù)和計(jì)算挑戰(zhàn)[29]。利用dCas9系統(tǒng)具備的單堿基特異性和通用性，近來(lái)發(fā)展的一種基于dCas9的等位基因富集方法能夠進(jìn)行有效的單靶標(biāo)和多重富集。該方法將dCas9蛋白與靶向目標(biāo)突變的sgRNA復(fù)合，并與含有低豐度突變鏈的cfDNA樣品一起孵育，分離突變結(jié)合的dCas9復(fù)合物，待解離后，并將捕獲的DNA純化用于下游使用(圖3)。針對(duì)非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)的3種最常見(jiàn)的表皮生長(zhǎng)因子受體突變(外顯子19缺失，T790M，L858R)，該方法實(shí)現(xiàn)了等位基因頻率的20倍增加，并通過(guò)使用qPCR可檢測(cè)到0.1%等位基因頻率。在18個(gè)NSCLC患者衍生的cfDNA樣本中，該方法能夠檢測(cè)13個(gè)突變中的8個(gè)，而這些突變未被qPCR檢測(cè)到[30]。

3 基于Cas9 Nicking 酶的基因檢測(cè)方法

突變Cas9的兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域的任意一個(gè)，如RuvC(D10A)或HNH核酸酶(H840A)，可以獲得Cas9 Nicking酶，也叫Cas9切口核酸內(nèi)切酶。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)雖然是最廣泛使用的DNA擴(kuò)增方法，但熱循環(huán)的要求限制了其非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的應(yīng)用。因此，等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)對(duì)于代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR的現(xiàn)場(chǎng)診斷應(yīng)用是有價(jià)值的。在這里，Zhou等[31]描述了基于CRISPR-Cas9觸發(fā)的切口核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增方法(即CRISDA)擴(kuò)增和檢測(cè)雙鏈DNA的等溫?cái)U(kuò)增方法。CRISDA利用CRISPR的高靈敏度/特異性和獨(dú)特的構(gòu)象重排來(lái)識(shí)別靶DNA，并結(jié)合肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)侵襲介導(dǎo)的終點(diǎn)測(cè)量法。該方法在復(fù)雜樣品背景下檢測(cè)各種DNA靶標(biāo)時(shí)展現(xiàn)出阿摩爾靈敏度和單核苷酸特異性。此外，通過(guò)將該技術(shù)與Cas9介導(dǎo)的靶向富集方法相結(jié)合，CRISDA可以達(dá)到亞阿摩爾靈敏度。

近來(lái)，Wang等[32]發(fā)展了另一種稱(chēng)為基于Cas9切口酶的擴(kuò)增反應(yīng)(Cas9nAR)。該方法可以在37 ℃的恒定溫度下從基因組DNA中擴(kuò)增靶片段。Cas9nAR使用具有單鏈切口特性的sgRNA：Cas9復(fù)合物，在鏈置換DNA聚合酶作用下,通過(guò)引發(fā)，延伸，切口和置換的循環(huán)過(guò)程促進(jìn)重復(fù)的DNA復(fù)制(圖4)。Cas9nAR在60 min內(nèi)獲得zeptomolar檢測(cè)限(在20 μL反應(yīng)體系中2個(gè)拷貝)和單堿基鑒別能力。更重要的是，Cas9nAR提供了引物設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)單性和應(yīng)用中的通用性。由于其優(yōu)異的靈敏度和特異性，以及易于實(shí)施，快速和等溫的特征，Cas9nAR具有成為基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中核酸定量檢測(cè)的巨大潛力。

圖3 基于dCas9進(jìn)行等位基因富集的總體工作流程[30]Fig.3 Overall work flow for dCas9 enrichment of rare alleles[30](a)重組6x-His標(biāo)簽綴合的dCas9蛋白可以與靶向目標(biāo)突變的sgRNA復(fù)合;(b)將它們與突變和野生等位基因以及與抗6x His抗體綴合的磁珠的混合物一起溫育。dCas9復(fù)合物與各自的DNA靶標(biāo)結(jié)合;(c)通過(guò)磁分離從溶液中提取;(d)解離和純化DNA之后，可以通過(guò)下游分析方法(如定量PCR)分析所得的富集DNA(a)Recombinant 6x-His Tag conjugated dCas9 protein can be complexed with sgRNAs targeting mutations of interest;(b)These are incubated with a mixture of both mutant and WT alleles and magnetic beads conjugated with anti-6x His antibodies. dCas9 complexes bind to their respective DNA targets;(c)Extracted from solution by magnetic separation;(d)Following dissociation and DNA purification, resulting enriched DNA can be analyzed by a method of downstream analysis, in this case allele-specific qPCR

圖4 Cas9nAR方法從基因組DNA擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段的示意圖[32]Fig.4 Schematic of the proposed Cas9nAR for amplification of a DNA fragment of interest from genomic DNA[32]

4 基于sgRNA和Cas9改造的基因檢測(cè)方法

基于對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行工程改造，Qiu等[33]發(fā)明了一種均相的miRNA檢測(cè)策略。該策略使用滾環(huán)擴(kuò)增作為輸入miRNA信號(hào)的主放大器，以產(chǎn)生具有重復(fù)miRNA互補(bǔ)序列和規(guī)則莖環(huán)結(jié)構(gòu)的大DNA片段。在RCA中，設(shè)計(jì)啞鈴狀探針特異性結(jié)合靶miRNA以引發(fā)鏈置換反應(yīng)并將其結(jié)構(gòu)改變?yōu)閜hi-29酶介導(dǎo)的RCA的合適底物。隨后，引入基于CRISPR-dCas9的技術(shù)靶向來(lái)自第一步擴(kuò)增的產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)二次擴(kuò)增和信號(hào)輸出。在該方案中，dCas9蛋白預(yù)先與半分裂的辣根過(guò)氧化酶(HRP)報(bào)告片段融合。在特異性sgRNA的指導(dǎo)下，可以在RCA產(chǎn)物的支架樣結(jié)構(gòu)周?chē)技至袶RP-dCas9融合蛋白，從而重構(gòu)辣根過(guò)氧化酶活性。可以使用3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)HRP活性，從而實(shí)現(xiàn)靶miRNA的檢測(cè)。

目前，大多數(shù)刺激響應(yīng)的CRISPR系統(tǒng)是基于Cas9蛋白構(gòu)建的，并且外部刺激手段仍然主要限于小分子和光。為了構(gòu)建更精確和易于構(gòu)建的響應(yīng)CRISPR系統(tǒng)并拓寬其響應(yīng)范圍，Li等[34]設(shè)計(jì)了一種條件性sgRNA而不是Cas9蛋白來(lái)介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于邏輯操作條件的CRISPR。該方法通過(guò)sgRNA重構(gòu)和立足介導(dǎo)的鏈置換來(lái)構(gòu)建mRNA感應(yīng)的CRISPR系統(tǒng)，且其中每個(gè)靶位點(diǎn)可以獨(dú)立控制。該研究表明響應(yīng)開(kāi)關(guān)可以嵌入到sgRNA中并用作RNA傳感器，能夠正交檢測(cè)多個(gè)mRNA輸入并提供CRISPR/Cas9響應(yīng)的輸出。并構(gòu)造了NOR和NAND邏輯門(mén)，展示了其正交性和可編程性。該策略有望用于構(gòu)建遺傳電路以檢測(cè)內(nèi)源性RNA。

細(xì)胞中線粒體DNA(mtDNA)突變的積累與衰老相關(guān)疾病密切相關(guān)。mtDNA中單核苷酸變異的檢測(cè)對(duì)于理解具有致病性變化的mtDNA的異質(zhì)性是至關(guān)重要的。Zhang等[35]設(shè)計(jì)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的鄰近連接測(cè)定法(CasPLA)，用于直接觀察單細(xì)胞mtDNA中的ND4和ND5基因。該方法設(shè)計(jì)了一對(duì)稱(chēng)為CasPLA的Cas9/sgRNA探針，可識(shí)別基因組附近的序列。當(dāng)配對(duì)的CasPLA探針彼此緊密結(jié)合時(shí)，它們可以引導(dǎo)隨后添加的線性寡核苷酸形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，隨后被連接酶共價(jià)連接稱(chēng)環(huán)化DNA。通過(guò)RCA擴(kuò)增環(huán)化的DNA，然后原位合成的RCA產(chǎn)物與熒光標(biāo)記的探針雜交，這使得擴(kuò)增的產(chǎn)物信號(hào)能夠與背景區(qū)分開(kāi)。利用CRISPR/Cas9的高特異性，CasPLA可用于以單分子分辨率對(duì)ND4基因中的SNV成像。使用CasPLA，也觀察到不同細(xì)胞之間的mtDNA轉(zhuǎn)移過(guò)程，這可能解釋了mtDNA異質(zhì)性的擴(kuò)散。此外，該方法證明了CasPLA策略可以應(yīng)用于核基因組中單拷貝基因組位點(diǎn)(KRAS基因)的成像。

5 總結(jié)與展望

自實(shí)現(xiàn)體外的DNA切割試驗(yàn)以來(lái)，CRISPR/Cas9技術(shù)展現(xiàn)其巨大的潛力并應(yīng)用于很多生物技術(shù)領(lǐng)域，比如基因編輯、基因表達(dá)與調(diào)控、染色體重排、基因成像、基因治療、基因檢測(cè)等。特別是CRISPR/Cas9技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)領(lǐng)域，并取得了諸多進(jìn)展。譬如，CRISPR識(shí)別技術(shù)可以達(dá)到單堿基分辨率水平，實(shí)現(xiàn)寨卡病毒譜系檢測(cè)。CRISPR技術(shù)的這種特異性可以促使在將來(lái)的單堿基核苷多態(tài)性分析領(lǐng)域大有作為。例如，可以實(shí)現(xiàn)一些定點(diǎn)的堿基突變檢測(cè)，為腫瘤的早期檢測(cè)，細(xì)菌的分型提供極其有用的工具。此外，可以預(yù)見(jiàn)，通過(guò)對(duì)DNA進(jìn)行雙硫轉(zhuǎn)化也可以實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率的DNA甲基化檢測(cè)。利用Cas9的結(jié)合功能，CRISPR技術(shù)也可以應(yīng)用于基因測(cè)序前的富集，使得測(cè)序深度進(jìn)一步提高。理論上，CRISPR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)任何基因的富集，只需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的sgRNA即可。Cas9和sgRNA也可以被工程化，例如，可以對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行生物標(biāo)記，從而使得其帶有功能化的標(biāo)簽，為生物傳感技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供了多樣性。同樣，也可以對(duì)sgRNA改造而不影響其功能，從而得以實(shí)現(xiàn)新型的探針體系。CRISPR技術(shù)對(duì)基因的識(shí)別是可以在常溫條件下實(shí)現(xiàn)的，所以基于CRISPR技術(shù)的基因檢測(cè)無(wú)需嚴(yán)格的溫控條件，這一點(diǎn)為將來(lái)開(kāi)發(fā)可現(xiàn)場(chǎng)使用的基因檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)?？傊珻RISPR技術(shù)正在迅速發(fā)展，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)和方法的理解將有助于發(fā)展更新一代的基因檢測(cè)技術(shù)。