楊藝新 紀(jì)可心 黃 銀 王思琦 李 敏*（天津師范大學(xué)，天津300387）

草履蟲（Paramecium caudatum Ehrenberg）屬原生動物門纖毛綱膜口目草履蟲科，體型較小，一般體長為180～280μm，其呈橢圓形，形狀酷似草鞋顧得名為草履蟲[1]。草履蟲的結(jié)構(gòu)比較簡單，具有起攝食作用的胞口，控制氣體進(jìn)出的表膜，分別控制營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出和遺傳生殖的作用的大小核，輔助運動的纖毛等[2-3]。其生活在淡水中，通常可以在有機(jī)質(zhì)豐富的河流、水塘中采集到它們，一般呈針尖狀發(fā)亮的白色點狀物浮動在水中[4]。草履蟲適宜的生長環(huán)境為25°C 左右，并且更喜歡生活在光線充足的水中，主要依靠取食水中的細(xì)菌和有機(jī)物來生存[1-4]。草履蟲的生殖方式主要為無性生殖和有性生殖，無性生殖即橫二分裂，有性生殖即接合生殖，它們繁殖快，生活周期較短為一周左右[5]。草履蟲的主要類別有大草履蟲、雙小核草履蟲、多小核草履蟲等。草履蟲有很多研究優(yōu)點，如結(jié)構(gòu)較簡單便于觀察，生長發(fā)育繁殖速度較快，易于在野外采集和便于實驗室培養(yǎng)等，所以草履蟲相關(guān)研究的應(yīng)用比較廣泛，例如可以用其凈化污水、作為研究細(xì)胞遺傳的材料從而在醫(yī)學(xué)方面起到診斷疾病的作用還有監(jiān)測水體的重金屬和農(nóng)藥含量等[2][6]。其在實驗室中容易飼養(yǎng)，培養(yǎng)材料配制方法簡易，通常使用的培養(yǎng)方法有稻草培養(yǎng)液培養(yǎng)法、麥粒培養(yǎng)液培養(yǎng)法、牛奶培養(yǎng)液培養(yǎng)法等[4]。

生物節(jié)律是指不論單細(xì)胞還是多細(xì)胞，動物還是植物，所有生物在其生命過程中都會呈現(xiàn)一種周期性的有規(guī)律可循的活動現(xiàn)象[7][8]。目前普遍認(rèn)為生物節(jié)律的影響因素有光照、溫度等條件[7][9][10]，已有研究表明高溫或者較高的重金屬離子濃度會影響生物體產(chǎn)生熱激蛋白進(jìn)行熱激反應(yīng)從而抵御外界環(huán)境的惡劣變化，熱激蛋白就是在動植物體內(nèi)普遍存在的一種抗逆性蛋白，這種蛋白在動植物熱激反應(yīng)過程中起著不可或缺的作用[11][12]。生物節(jié)律的研究具有十分重要的意義，如研究植物的生物節(jié)律可以使其在本不適宜其生存的地區(qū)生長繁殖從而增加生物的多樣性，研究動物的生物節(jié)律可以使其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)疾病方面的檢測和治療等[13][14][15]。

溫度是動植物生長過程中起重要作用的生長因子，每種生物生長繁殖時都需要一個較適宜的溫度來保證其生命活動的正常進(jìn)行，溫度過低會使細(xì)胞凍傷從而損傷機(jī)體，溫度過高會使蛋白質(zhì)變性失活等[10]。已有研究表明不同溫度的環(huán)境會對草履蟲的增殖有不同的影響，如草履蟲最適宜的增殖溫度為2°C左右，溫度升高會促進(jìn)草履蟲的增殖，溫度的變化對草履蟲增殖的影響較為顯著等[16][17]。重金屬在空中、水體、土壤中都可廣泛存在，常見的重金屬有汞、鉛、鎘等，它們可對環(huán)境和動植物造成極大的危害，重金屬污染是主要的污染類型之一[18]。重金屬沿著食物鏈不斷積累最終在人體內(nèi)匯集造成某些人體器官的衰竭[18]，重金屬會對微生物的結(jié)構(gòu)、種類等造成影響[19]，重金屬影響熱激蛋白和熱休克蛋白的表達(dá)等等[11][20]。其中的代表之一鎘離子對動植物的危害除了體現(xiàn)在毒害作用以外，還可能導(dǎo)致生物重金屬積累導(dǎo)致慢性中毒、骨骼軟化和致癌性等方面[21][22][23]。

本實驗欲通過不同溫度和金屬鎘離子對草履蟲增殖節(jié)律的影響，探究草履蟲的生物節(jié)律及其影響因素，為以后熱激蛋白的表達(dá)和生物節(jié)律的潛在關(guān)系探索基礎(chǔ)，對研究水體環(huán)境污染和污染物的監(jiān)測具有積極的意義，為今后對原生動物生物節(jié)律的研究積累一些數(shù)據(jù)，從而為更多生物的生物節(jié)律研究奠定基礎(chǔ)，使各種生物與人類可以一起更好的生存發(fā)展，真正達(dá)到和諧共處的目的。

1 材料與方法

1.1 供試草履蟲。野生草履蟲取自天津師范大學(xué)湖泊水中。

1.2 草履蟲的純化。首先將采集到的湖泊水原液中的草履蟲與其他原生動物進(jìn)行分離，方法是在陽光充足的地方，用干凈透明的容器盛放湖泊水并觀察，靠近水面有針狀白色點狀物浮動，用習(xí)慣吸取上層清液后置于離心管中，采用差速離心法在4000r/min 的條件下離心3min，用吸管吸取上層清液并保留離心管底部的沉淀物約1mL，得到草履蟲沉淀。

1.3 稻草培養(yǎng)液的制備。取干凈無污染的干稻草剪成3cm 長的稻草段，按照其與蒸餾水為1g：1000mL 的比例進(jìn)行配置，將配置好的溶液進(jìn)行煮沸，10 分鐘后將溶液靜置于室溫下冷卻，冷卻至室溫后用雙層紗布密封容器并放置24h。

1.4 草履蟲的培養(yǎng)。將之前得到的草履蟲純化液與稻草培養(yǎng)液按1：10 的比例進(jìn)行混合，將混合液放置于溫度為20°C，光照條件12L：12D 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 天，每天都應(yīng)加入一定量的稻草培養(yǎng)液以補充草履蟲生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)。7 天后觀察草履蟲的狀態(tài)，若其生長狀況良好并且可以正常繁殖即可開始實驗。

1.5 不同溫度對草履蟲增殖節(jié)律的影響

1.5.1 不同溫度下處理草履蟲 將已得到的草履蟲培養(yǎng)液和稻草培養(yǎng)液分別平均分為5 組，分別在室溫、26°C、30°C、33°C、37°C 下按照1：1 的比例進(jìn)行混合后置于對應(yīng)的溫度條件下飼養(yǎng)，以在室溫下培養(yǎng)的草履蟲為對照，首先在實驗開始之前分別對其進(jìn)行計數(shù)。

1.5.2 計數(shù)方法 在上午9:00 進(jìn)行第一次記數(shù)，將草履蟲混合液搖勻后用微量移液槍吸取2μL 混合液，之后用相應(yīng)溫度下的稻草培養(yǎng)液進(jìn)行等量液體補充，使混合培養(yǎng)液始終保持固定的量。將2μL 的混合培養(yǎng)液置于潔凈的載玻片上進(jìn)行觀察并計數(shù)，為防止草履蟲活動影響實驗結(jié)果的統(tǒng)計，還需在載玻片上滴加1μL 5%的稀鹽酸溶液固定草履蟲方便進(jìn)行計數(shù)。按以上計數(shù)方法每4h 進(jìn)行一次計數(shù)，即13:00 與17:00 分別進(jìn)行第二、三次計數(shù)，為了保證數(shù)據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)從而減少誤差，每次計數(shù)應(yīng)重復(fù)進(jìn)行三次并計算平均值，實驗一共進(jìn)行8h。

1.6 不同濃度的鎘離子溶液對草履蟲增殖節(jié)律的影響

1.6.1 不同濃度鎘離子處理草履蟲 首先配置濃度為0、10、20、30、40nmol/L 的鎘離子溶液，將草履蟲培養(yǎng)液和鎘離子溶液按1：1 的比例進(jìn)行混合后置于20°C、光周期為12L：12D 的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6.2 計數(shù)方法 見1.5.2，注意每次計數(shù)前都應(yīng)將混合培養(yǎng)液搖勻之后再取樣。計數(shù)結(jié)果分別見表1、表2。

1.7 統(tǒng)計與分析 主要使用SPSS19.9 軟件進(jìn)行方差分析，運用的方法是Duncan 式新負(fù)極差法，顯著性為0.05。

2 結(jié)果與分析

表2

2.1 不同溫度對草履蟲增殖數(shù)量的影響見圖1、圖2，實驗結(jié)果表明前4 個小時內(nèi)草履蟲的數(shù)量在各個溫度條件下都有所下降，30°C 時數(shù)量下降最多，且在對照、26°C、37°C 條件下草履蟲的增殖數(shù)量沒有顯著性差異，這三組與30°C 和33°C條件下的草履蟲增殖數(shù)量有顯著性差異。后4 個小時內(nèi)在30°C 時草履蟲的數(shù)量顯著增多，其他溫度條件下草履蟲數(shù)量略微減少，且在對照、37°C 條件下草履蟲的增殖數(shù)量沒有顯著性差異，這兩組與26°C 、30°C 和33°C 條件下的草履蟲增殖數(shù)量有顯著性差異。

2.2 不同濃度的鎘離子對草履蟲增殖數(shù)量的影響見圖3、圖4，實驗結(jié)果表明前4 個小時內(nèi)草履蟲的數(shù)量在各個濃度鎘離子的條件下都有所下降，對照組下降最少，且隨著鎘離子濃度增加，草履蟲下降數(shù)量逐漸增多，鎘離子濃度為20、30nmol/L 時草履蟲增殖數(shù)量沒有顯著性差異，這兩組與對照、10 和40 nmol/L條件下的草履蟲增殖數(shù)量有顯著性差異。后4 個小時內(nèi)除了20nmol/L 以外的其他組中草履蟲數(shù)量有所上升，且實驗組的草履蟲增殖數(shù)量都略低于對照組，鎘離子濃度為10、40nmol/L 時草履蟲增殖數(shù)量沒有顯著性差異，這兩組與對照、20 和30 nmol/L 條件下的草履蟲增殖數(shù)量有顯著性差異。

3 結(jié)論

圖1

圖2

在不同溫度條件下，從整體上看，草履蟲對溫度有一定程度的抗逆性，且這種抗逆性隨時間不斷提升，并且在9:00-17:00 之間，在不同溫度條件下，草履蟲有一定的增殖節(jié)律。溫度是影響生物體內(nèi)熱激蛋白含量的一個重要因素，在不同溫度下的熱激蛋白含量也會產(chǎn)生一定的變化。還有研究表明，在動物體中存在著生物節(jié)律基因來調(diào)控生物節(jié)律的變化，我們可以推測出了依靠基因來表達(dá)熱激蛋白之外，熱激蛋白的表達(dá)或許還受到生物節(jié)律基因的調(diào)控[24]。

圖3

圖4

在不同濃度的鎘離子對草履蟲的增殖節(jié)律影響實驗中，在9:00-13:00 時間段中草履蟲數(shù)量減少并且隨著鎘離子濃度增加，草履蟲死亡的數(shù)量也相應(yīng)增加，而在13:00-17:00 時間段中，草履蟲的數(shù)量有所上升，且在鎘離子濃度為30nmol/L 時草履蟲增殖量達(dá)到最高，或許是此濃度的鎘離子刺激其體內(nèi)表達(dá)了一定量的熱激蛋白從而對其自身起到了保護(hù)作用。這兩個時間段中草履蟲的增長差異性側(cè)面證明了草履蟲對鎘離子的抗性差異或許與生物節(jié)律相關(guān)。有相關(guān)研究證明，草履蟲在12L：12D的光照條件下對鎘離子的抗性會出現(xiàn)相應(yīng)的生物節(jié)律變化，鎘離子在自然界的積累會使動植物造成一定的毒害作用，從而間接影響生物的生長發(fā)育繁殖過程中的生理生化反應(yīng)。不過這種毒害作用也有反例，如在某些魚類、甲殼類生物的研究中發(fā)現(xiàn)一定量的重金屬離子可能會在某種程度上促進(jìn)這些生物的繁殖[25]。除了鎘離子之外還有許多重金屬都會對動植物體內(nèi)的熱激蛋白的表達(dá)量有一定的影響，影響熱激蛋白表達(dá)的因素除了有重金屬、高溫以外還有低溫、饑餓、甚至包括過高的種群密度[26]。

結(jié)合Hinrichsen RD 在2008 年的研究報告，本實驗通過研究草履蟲的增殖情況來驗證其體內(nèi)的熱激蛋白的表達(dá)有周期性的特點，這周周期性表達(dá)很有可能與生物節(jié)律基因的表達(dá)有關(guān)[26]。治療腫瘤的新型方法之一——熱化療法就是利用熱激蛋白的表達(dá)來提高免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性免疫作用，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[27][28]。但是溫度的升高和加熱時間過長都會對細(xì)胞有一定的損害作用，所以尋找最合適的條件是我們研究過程中的難題之一。本實驗從溫度脅迫和毒脅迫兩個方面來驗證草履蟲生物節(jié)律的變化，為以后研究熱激蛋白的表達(dá)和生物節(jié)律之間的潛在關(guān)系積累一定的數(shù)據(jù)，有助于人類關(guān)于腫瘤、癌癥等醫(yī)學(xué)方面的研究。