洪麗婷，劉秀棉，陳 丹*，黃慶德，蔡 晶，余文靜，熊朝棟

（1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122）

蓯蓉舒痙顆粒由蓯蓉、黃精等中藥組成，是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代最新研究成果，針對帕金森病肌強(qiáng)直開發(fā)研制的顆粒劑［1］。 研究表明，蓯蓉舒痙顆粒的多糖組分是抗帕金森病肌強(qiáng)直作用的重要藥效部位［2-3］。 多糖作為生命的有機(jī)體，與維持生命的種種生理機(jī)能有著密切的聯(lián)系，它一般是由10 個以上醛糖和（或）酮糖通過糖苷鍵連接在一起的聚合物。 為確保蓯蓉舒痙顆粒成品質(zhì)量，需要在生產(chǎn)過程中建立有效控制顆粒劑中間體總多糖含量的測定方法。 故本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖為對照品，蒽酮-硫酸溶液為顯色劑，在582 nm 波長處測定蓯蓉舒痙顆粒中間體總多糖含量，并對三批蓯蓉舒痙顆粒中間體樣本進(jìn)行含量檢測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS 205 十萬分之一電子天平、AR 2140萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；HH-S 型水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-4802 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.2 試藥 蓯蓉舒痙顆粒中間體（自制，批號20190403，20190405，20190407）；D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201707）；蒽酮（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20180111）；硫酸、無水乙醇等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.34 mg／mL 的對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 取蓯蓉舒痙顆粒中間體粉末約0.25 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，加入5 mL 水，超聲15 min 使溶解，加入20 mL 無水乙醇，快攪慢加，置4 ℃冰箱中靜置12 h，以4 000 r／min離心15 min，棄上清液，殘?jiān)?0%乙醇洗滌2 次，每次2 mL，殘?jiān)娓?，加水適量使溶解，定量轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 蒽酮-硫酸溶液配制 稱取0.20 g 蒽酮，用濃硫酸溶解并制得0.2%蒽酮-硫酸溶液，注意避光保存，臨用新配。

2.4 測定波長的選擇 精密吸取對照品溶液0.4 mL、供試品溶液1.0 mL 及蒸餾水（即空白對照溶液）1.0 mL，分別置10 mL 潔凈干燥的具塞刻度試管中，加水補(bǔ)至2 mL，振蕩搖勻，在冰水浴中緩緩滴加新鮮配制的0.2%蒽酮-硫酸溶液8 mL，混勻，放冷后置沸水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出。 分別在500～800 nm 波長范圍進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖對照品溶液和供試品溶液在582 nm 波長處均有最大吸收，空白溶液無干擾，故選定582 nm 為測定顆粒劑中間體總多糖的測定波長，見圖1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mL，分別置于10 mL 潔凈干燥的具塞刻度試管中，按“2.4”項(xiàng)下自“加水補(bǔ)至2 mL……”起，同法操作，在582 nm 波長處測定吸光度值A(chǔ)，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，無水葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回歸方程A＝3.727×102C＋4.465×102，r＝0.998 8。 無水葡萄糖質(zhì)量濃度在3.41～27.26 μg／mL 范圍內(nèi)與吸光度A 呈良好的線性關(guān)系。 結(jié)果見表1、圖2。

圖1 顯色后吸收光譜圖

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液0.5 mL，置10 mL 具塞干燥試管中，按“2.4”項(xiàng)下自“加水補(bǔ)至2 mL……”起，同法操作，在582 nm 波長處連續(xù)測定吸光度值6 次。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸光度分別為0.675 6、0.675 6、0.675 5、0.675 5、0.675 5、0.675 4，RSD 值為0.01%，儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下自“加水補(bǔ)至2 mL……”起，同法操作，在室溫下避光放置，分別在0、30、60、90、120、150、180 min 時(shí)，在582 nm 波長處測定吸光度A。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸光度分別為0.448 0、0.446 4、0.441 4、0.441 6、0.437 7、0.437 6、0.437 8，RSD 值為0.96%，供試品溶液顯色后在室溫避光放置3 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取蓯蓉舒痙顆粒中間體粉末（批號20190405）約0.25 g，6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下自“加水補(bǔ)至2 mL……”起，同法操作，在582 nm 波長處測定吸光度，計(jì)算總多糖含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總多糖平均含量為21.85 mg／g，RSD 值為1.00%，該方法重復(fù)性良好。 見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)考察結(jié)果

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知總多糖含量（21.85 mg／g）的蓯蓉舒痙顆粒中間體粉末（批號20190405）約0.125 g，6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，并分別精密加入濃度為2.36 mg／mL 的無水葡萄糖對照品溶液1.0 mL，繼續(xù)加水至刻度線，搖勻，即得回收率測定的供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下自“加水補(bǔ)至2 mL……”起，同法操作，于582 nm處測定吸光度并計(jì)算總多糖含量，計(jì)算回收率。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果測得的平均回收率為98.32%，RSD 值為1.65%。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法準(zhǔn)確度較高。 見表3。

2.10 樣品含量測定 取三批蓯蓉舒痙顆粒中間體，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下自“加水補(bǔ)至2 mL……”起，同法操作，在582 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總多糖含量，每批次平行試驗(yàn)3 次。 見表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 樣品總多糖含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討 論

現(xiàn)在普遍采用的多糖含量測定方法，是利用多糖在強(qiáng)酸性條件下水解生成單糖，繼續(xù)脫水成糠醛或者糠醛類衍生物，然后再與酚類或胺類化合物縮合， 生成有特殊顏色物質(zhì)后用分光光度法測定，其顯色深度與多糖的含量呈線性關(guān)系，這類方法有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法和地衣酚-硫酸法。預(yù)實(shí)驗(yàn)曾比較以常用的蒽酮-硫酸法及苯酚-硫酸法測定蓯蓉舒痙顆粒中間體總多糖含量，由于苯酚易氧化，苯酚用前最好需重蒸，操作較繁瑣，且采用苯酚-硫酸法測定時(shí)含量結(jié)果數(shù)據(jù)變化較大，穩(wěn)定性稍差。因此，實(shí)驗(yàn)選用《中國藥典》2015 年版黃精“含量測定”項(xiàng)下所采用的蒽酮-硫酸法作為蓯蓉舒痙顆粒中間體的總多糖含量測定方法［4］，經(jīng)方法學(xué)考察結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確且重復(fù)性良好。 實(shí)驗(yàn)過程，蒽酮-硫酸溶液宜新鮮配制，避光保存；待測液需放置時(shí)應(yīng)避光、干燥放置，避免蒽酮-硫酸試劑吸水、分解，導(dǎo)致結(jié)果波動。 試驗(yàn)應(yīng)平行操作，避免環(huán)境、試劑批次對測定結(jié)果的影響。

課題組制備的蓯蓉舒痙顆粒是由黃精等中藥組成，據(jù)文獻(xiàn)［5］報(bào)道，黃精多糖的單糖組成主要含有葡萄糖、果糖、半乳糖等，且《中國藥典》2015 年版的中藥黃精多糖含量測定方法以無水葡萄糖為對照品［4］，故蓯蓉舒痙顆粒中間體總多糖含量測定選擇以葡萄糖為對照。

蓯蓉舒痙顆粒劑的輔料之一為糊精，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著糊精比例的增加，顆粒劑總多糖含量增加，可能是糊精在測定條件下被水解成單糖，干擾蓯蓉舒痙顆粒劑的多糖含量測定，引起誤差［6-7］。 因此，在蓯蓉舒痙顆粒制備工藝研究過程對其中間體進(jìn)行總多糖的含量測定，在關(guān)鍵環(huán)節(jié)控制蓯蓉舒痙顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定，確保最終成品質(zhì)量，為蓯蓉舒痙顆?？偠嗵琴|(zhì)量控制方法的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。