李春冬 徐偉良 王潤元 郭梁

摘 要：為鑒定錫林郭勒盟白音錫勒地區(qū)紫花苜蓿根腐病的致病菌，采用組織分離法獲得可培養(yǎng)致病菌群，基于16S rDNA對細菌進行種屬分析，基于ITS對真菌進行種屬分析。結(jié)果表明：在紫花苜蓿根腐部分離鑒定的19株細菌中有6株成團泛菌（Pantoea agglomerans）和6株假單胞菌屬（Pseudomonas baetica）;所分離的19株真菌中有13株織球殼菌（Plectosphaerella cucumerina）。通過相關(guān)文獻的分析推測優(yōu)勢細菌成團泛菌和優(yōu)勢真菌織球殼菌為引起紫花苜蓿根腐病的主要病原菌。本研究通過微生物的分離和鑒定揭示錫林郭勒盟白音錫勒地區(qū)紫花苜?？膳囵B(yǎng)病原菌種類，以期為當?shù)刈匣ㄜ俎８『Φ脑\斷和防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：

紫花苜蓿;根腐病;16S rDNA序列;ITS序列

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200315005

紫花苜蓿（Medicago sativa），屬于薔薇目、豆科、苜蓿屬，為多年生草本植物[1]。紫花苜蓿是我國種植面積最廣泛的優(yōu)質(zhì)牧草，具有較強抗旱、抗寒、耐鹽、耐風沙、耐貧瘠等能力，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多種氨基酸、維生素和胡羅卜素[2-4]。近年來由于我國大力發(fā)展畜牧業(yè)，帶動了牧草產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，促使了紫花苜蓿集約化種植面積的不斷增加[5]。隨著紫花苜蓿種植面積的進一步擴大，伴隨而來的病害問題也極大地制約了其產(chǎn)品的質(zhì)量。紫花苜蓿病害部位主要包括莖部、葉部和根部。根部病害與莖部和葉部病害不同，根部是參與體內(nèi)物質(zhì)的吸收、合成和轉(zhuǎn)化的重要部位。由于根部病害在初期不易被察覺，在診斷上比較困難，一旦根部染病對紫花苜蓿的危害一般是不可挽回的。紫花苜蓿致病微生物有真菌、細菌、病毒和菟絲子害4大類，其中真菌病害最為普遍，對生產(chǎn)的危害最大可達總病原菌的86.6%[6]。然而，目前還沒有針對根腐病的有效預(yù)防方法。因此紫花苜蓿病原菌的研究對其產(chǎn)品的開發(fā)和生態(tài)環(huán)境的保護有著重大的意義。

紫花苜蓿根腐病原菌的分類與鑒定通常采用經(jīng)典形態(tài)學方法，根據(jù)致病微生物的形態(tài)、生長特點和孢子的結(jié)構(gòu)等特征來進行分類鑒定[7]。王多成等按照柯赫證病律對在甘肅張掖和酒泉市采集的苜蓿根腐病原菌進行病原物分離、鑒定[8]。然而，紫花苜蓿的致病菌種類眾多，種間形態(tài)特征相似難以區(qū)分，依靠形態(tài)學方法鑒定實驗操作復(fù)雜，檢測周期長，需要專業(yè)操作人員，而且并非所有植物的病原菌都能直接通過形態(tài)學特征鑒定[9]。因此，需要一種快速、準確、靈敏性高，并且能夠?qū)Υ罅繕悠愤M行鑒定的方法。而脫氧核糖核酸（DNA）作為遺傳物質(zhì)包含有全部遺傳信息，是非常理想的基因標記手段，能夠很好地進行物種標記，利用以聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的各類分子檢測方法對其擴增基因分析后，可以準確地對植物病原菌進行分類鑒定，能夠更加客觀、全面地從本質(zhì)上區(qū)分各種病原菌，使植物真菌病害的鑒定工作更加高效、準確[10]。因此，分子技術(shù)手段在植物病理研究方面有著良好的應(yīng)用前景。柏玉晶等對甘肅省武威市紫花苜蓿根腐病菌進行分離，運用分子鑒定方法對致病性最強的菌株進行了鑒定[11];梁嘉俊等對陜西省4個區(qū)縣的36株紫花苜蓿根腐病原菌利用PCR方法進行了分離鑒定[12]。

近些年，雖有學者對內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市、巴彥淖爾市臨河區(qū)和赤峰市阿魯科爾沁旗苜蓿根腐病病原菌進行鑒定和分析[13-15]，但對錫林郭勒盟地區(qū)紫花苜蓿根腐病原菌的研究還未見報道。為明確錫林郭勒盟白音錫勒部分地區(qū)紫花苜蓿根腐病原菌的主要種類及優(yōu)勢致病菌群組成，本研究通過對當?shù)刂饕匣ㄜ俎７N植區(qū)的受害苜蓿進行樣品采集并分離病原菌，運用分子檢測方法對病原菌進行鑒定，初步明確了該地區(qū)紫花苜蓿根腐病原菌種類，以期為當?shù)刈匣ㄜ俎Ｉa(chǎn)中根腐病害的診斷和防治提供理論依據(jù)。

1?實驗器材與試劑

1.1?材料

于2019年6月自錫林郭勒盟白音錫勒地區(qū)采集的紫花苜蓿根腐病樣，共3份。

1.2?培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯切片200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH7.0[16]。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L，pH7.0。

1.3?試劑

Takara快速提取試劑盒（Code No.9164）;Takara Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（Code No.9762）;乙醇為國產(chǎn)分析純。

1.4?儀器與設(shè)備

電子天平FA2004N，SW-J-2FD凈化工作臺，HWS-250BX恒溫恒濕培養(yǎng)箱，2720 Thermal Cycler PCR擴增儀，5418R臺式高速離心機，WD-9413B凝膠成像儀，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)。

2?實驗方法

2.1?紫花苜蓿病變組織致病菌分離

采用常規(guī)組織分離方法采集紫花苜蓿病變組織，先用75%酒精對紫花苜蓿表面進行消毒（或用手術(shù)刀刮除表面多余土壤），再用滅菌手術(shù)刀挑出內(nèi)部病變組織樣品，使用滅菌鑷子夾取病變組織于滅菌生理鹽水中，置于搖床上室溫150 rpm振蕩20 min，使病變組織與生理鹽水充分混合，將微生物細胞從病變組織中充分分散至生理鹽水中，從而得到病原菌懸液。

2.2?紫花苜蓿病原菌的分子鑒定

2.2.1?DNA提取

紫花苜蓿病原菌總DNA使用Takara快速提取試劑盒對其進行提取。取40 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑于滅菌的PCR管中，吸取10 μL制備的病原菌懸液，置于PCR管中并吸打混勻，將PCR管置于金屬浴上80℃熱處理15min，8000 rpm低速離心5min得到上清液，上清液即為致病菌基因組總DNA，將DNA吸出置于新的EP管中，作為PCR反應(yīng)模板。

2.2.2?病原菌16S rDNA和ITS序列分析

反應(yīng)體系為：模板DNA 2μL、引物各2μL、ddH2O 14μL、EasyTaq PCR Super Mix 20 μL。

細菌選用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1495R（5'-CTACGGCT ACCTTGTTACGA-3'）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30循環(huán);72℃末端延伸10min。

真菌選用通用引物ITS1（5'-TCCG TAGGTGAACCTGC GG-3'）和ITS4（5'-TCCTCC GCTTATTGAT ATGC-3'）。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5min;95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30循環(huán);72℃加強延伸1min。PCR擴增結(jié)果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.2.3?序列測定

PCR擴增產(chǎn)物使用Takara試劑盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）進行回收。將回收的PCR產(chǎn)物送至北京睿博生物科技有限公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)拼接后在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進行BLAST同源比對。選取最相近的序列，根據(jù)對比結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載標準菌株序列，用MEGA5軟件進行同源性分析構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2.3?紫花苜蓿致病菌的分離培養(yǎng)

取處理好的1g樣品放入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，置于搖床上室溫150 rpm振蕩20min。震蕩后使用移液槍吸取1mL，進行梯度稀釋。細菌稀釋梯度為10-3～10-5;真菌稀釋梯度為10-2～10-4。稀釋過的菌液使用移液槍吸取200μL分別在牛肉膏蛋白胨瓊脂和PDA 2種平板培養(yǎng)基上進行涂布，待完全涂勻后倒置培養(yǎng)，牛肉膏蛋白胨瓊脂平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)2～3d;PDA平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～5d，觀察菌落生長狀況。

2.4?分離菌種的分子鑒定

培養(yǎng)完成后挑選適合稀釋梯度培養(yǎng)基，在牛肉膏蛋白胨瓊脂和PDA培養(yǎng)基上分別挑取不同外觀形態(tài)的菌落，每個樣品挑取8個菌落（細菌命名為：MB-31～38、MB-41～38、MB-51～58;真菌命名為：MF-31～38、MF-41～38、MF-51～58）。將挑取的菌落置于盛有20 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑的滅菌PCR管中進行DNA的提取，將PCR管置于金屬浴上80℃熱處理15min，8000 rpm低速離心5min得到上清液，上清液即為致病菌基因組總DNA，將DNA吸出置于新的EP管中，作為PCR反應(yīng)的模板。細菌和真菌PCR擴增同“2.2.2”反應(yīng)條件。PCR產(chǎn)物測序方法同“2.2.3”反應(yīng)條件。

3?結(jié)果與分析

3.1?紫花苜蓿病原菌總DNA測定結(jié)果

采用Takara快速提取試劑盒對紫花苜蓿病原菌總DNA進行提取，細菌以27F/1495R為引物，真菌以ITS1/ITS4為引物，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的效果，結(jié)果如圖1A所示，發(fā)現(xiàn)B1、B2、B3經(jīng)過PCR擴增反應(yīng)得到1500 bp處有1條清晰條帶，符合27F/1495R為引物的目的條帶大小;F1、F2、F3可知真菌PCR擴增在550 bp處有條帶，特別是F1有2條條帶，證明紫花苜蓿病原菌中真菌種類并不單一。

由圖1B和1C可知，細菌和真菌測序結(jié)果均含有雙峰和雜峰，說明紫花苜蓿的病原菌皆不是單一的細菌或真菌。因此，還需對紫花苜蓿致病菌的真菌和細菌進行分離培養(yǎng)，進一步對所純化的菌株進行鑒定。

3.2?紫花苜蓿病原菌分離培養(yǎng)結(jié)果

將梯度稀釋好的病原菌菌液取100 μL，均勻涂布在牛肉膏蛋白胨瓊脂和PDA培養(yǎng)基上，進行病原菌分離培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如圖2。由圖2可知，紫花苜蓿致病微生物在牛肉膏蛋白胨瓊脂和PDA培養(yǎng)基上均生長旺盛，但培養(yǎng)基上菌落形態(tài)不一，說明培養(yǎng)基上細菌和真菌的種類并不單一，這與“3.1”總DNA測定的結(jié)果相同，因此，還需進一步對純化培養(yǎng)的菌株進行基因測定。

3.3?發(fā)酵劑菌種序列鑒定結(jié)果

根據(jù)菌落外觀形態(tài)的不同，每個樣品細菌和真菌各挑取8個菌落，進行DNA提取和PCR擴增，并經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將樣品送至北京睿博生物科技有限公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)拼接后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源比對，19個細菌單菌株（MB-34、MB-43、MB-52、MB-54和MB-58條帶未能回收）和19個真菌單菌株（MF-31、MF-35、MF-38、MF-46、MF-48條帶未能回收）ident均大于98%，通過MEGA 5軟件與相似度最高的標準菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

如圖3A可知，細菌19個菌株分為5個不同屬：菌株MB-35、MB-37、MB-41、MB-42、MB-45和MB-51為泛菌屬的成團泛菌（Pantoea agglomerans），菌株MB-53和MB-57為腸桿菌屬的Enterobacter cowanii，菌株MB-44、MB-46、MB-47、MB-48、MB-55、MB-56為腸桿菌屬的Enterobacter cowanii，菌株MB-36和MB-38為短桿菌屬的Brevibacterium frigoritolerans，菌株MB-31、MB-32和MB-33為芽孢桿菌屬的蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）

如圖3B可知，真菌19個菌株分為7個不同屬：菌株MF-33、MF-34、MF-36、MF-37、MF-44、MF-51、MF-52、MF-53、MF-54、MF-55、MF-57和MF-58為織球殼菌（Plectosphaerella cucumerina）、菌株MF-32為微紫青霉（Penicillium janthinellum）、菌株MF-45為隱球酵母屬（Cryptococcus chernovii）、菌株MF-47為帚梗柱孢屬（Sarocladium strictum）、菌株MF-56為Fusicolla aquaeductuum、菌株MF-41為鐮刀菌屬（Fusarium acuminatum）、菌株MF-42為亞隔孢殼屬（Didymella glomerata）。

如圖4可知，細菌Pantoea agglomerans和Pseudomonas baetica所占比例最高均為細菌優(yōu)勢菌;真菌Plectosphaerella cucumerina所占比例最高為真菌優(yōu)勢菌。

4?結(jié)論與討論

從紫花苜蓿根腐組織分離的19株細菌大多數(shù)屬于成團泛菌（P. agglomerans）和假單胞菌屬（P. baetica），其次是蠟樣芽胞桿菌、腸桿菌屬（E. cowanii）和短桿菌屬（B. frigoritolerans）。據(jù)報道成團泛菌是引起苜蓿細菌性頂腐病病原菌之一[17]。未見假單胞菌屬的P. baetica在紫花苜蓿上分離的報道，只有López等在比目魚中分離了魚類致病性病原菌[18]。黃科等從重慶地區(qū)藍莓園的發(fā)病藍莓葉片上分離得到1株蠟樣芽胞桿菌（B. cereus），研究表明B. cereu可以引發(fā)藍莓葉枯病[19]。Furtado等在馬檳榔的斑點上分離得到了腸桿菌屬，通過研究發(fā)現(xiàn)E. cowanii可引起植物幼苗葉斑病[20]。石青研究發(fā)現(xiàn)在黃頂菊根際土壤中分離耐旱短桿菌（B. frigoritolerans）可以對尖孢鐮刀菌有抑制作用，B. frigoritolerans是植物根際促生菌[21]。綜上所述，優(yōu)勢細菌成團泛菌（P. agglomerans）具有導致苜蓿根腐病的潛能。

從紫花苜蓿根腐組織分離的19株真菌大多數(shù)屬于織球殼菌（P. cucumerina），其次是微紫青霉菌（P. janthinellum）、隱球菌酵母屬（C. chernovii）、直帚枝桿孢（S. strictum）、Fusicolla aquaeductuum、銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）和莖枯病菌（D. glomerata）。徐婧等在遼寧省葫蘆島地區(qū)番茄病株上分離的P. cucumerina可引起植株萎蔫和根部腐爛[22]。謝君對在三年生健康三七根部分離的P. janthinellum進行研究，發(fā)現(xiàn)P. janthinellum代謝產(chǎn)物對三七的致病菌Alternaria brassicicola、Cylindrocarpon destrucctans和Fusarium solani均有不同程度的抑制活性[23]。Ziauddin等在兒童急性淋巴細胞白血病患者鼻腔標本培養(yǎng)物中分離得到C. chernovii，通過研究發(fā)現(xiàn)C. chernovii對卡泊芬凈、阿尼芬凈、5-氟胞嘧啶和伊曲康唑有抗性，但對兩性霉素B、泊沙康唑和伏立康唑敏感[24]。胡蘭等在遼寧省農(nóng)科院試驗地的高粱發(fā)病株中分離純化出直帚枝桿孢（S. strictum），通過實驗證明S. strictum可侵染高粱和玉米，并通過土壤和種子帶菌為主要侵染途徑引起黑束病[25]。Huang等在中國淡水環(huán)境中的真菌進行分離鑒定，首次報道了Fusicolla aquaeductuum[26]。易銘等在陜西省榆林市定邊縣牧草種植基地采集的紫花苜蓿植株根部分離得到根腐病病原菌銳頂鐮刀菌，經(jīng)EF-1α序列分析鑒定及正常紫花苜蓿根部接種試驗發(fā)現(xiàn)發(fā)病癥狀與田間根腐病發(fā)病一致[27]。張宇等對美國進境的進口高粱種子上病原菌進行分離，得到1株莖枯病菌，致病性測試結(jié)果表明D. glomerata能夠引起高粱和小麥的葉部感染[28]。綜上所述，真菌織球殼菌（P. cucumerina）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）具有導致苜蓿根腐病的潛能。又因為本研究紫花苜蓿根腐癥狀主要為病株根系發(fā)育不良，側(cè)根減少，組織壞死導致植株萎蔫，葉片自上而下干枯，最終影響植株的根部發(fā)育，降低根系對營養(yǎng)和水分吸收而導致植株萎蔫或死亡，這與徐婧報道的織球殼菌導致番茄萎蔫病癥狀相類似[29]。由于本研究在錫林郭勒地區(qū)紫花苜蓿根腐部位分離所得到，又根據(jù)文獻分析推測優(yōu)勢細菌成團泛菌（P. agglomerans）和優(yōu)勢真菌為織球殼菌（P. cucumerina）為苜蓿根腐病的主要致病菌。

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（責任編輯?賈燦）