譚 巍 任 澎

(1. 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊 830000)(2. 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，烏魯木齊 830000)

心力衰竭(Heart Failure，HF)為一類發(fā)病機制復雜的臨床綜合征，主要由心功能及心臟結構受損導致的心室充盈或泵血能力障礙，影響著患者的生存質量及遠期預后。多年來，由于人類對心力衰竭發(fā)病機制的探究越來越全面，對其預防及治療也有了更深入的了解，而建立合適的心衰模型對心衰的進一步研究也有著重要指導意義，其中，大鼠價格低廉，操作簡便，被用于心血管動物實驗研究已有多年?？s窄大鼠腹主動脈或升主動脈法致大鼠心衰與人類慢性心衰過程相似，都是較常用的制作大鼠心力衰竭的方法。本文將進一步研究將大鼠腹主動脈縮窄至不同程度對其血流動力學、心肌組織形態(tài)學的影響，為今后研究者建立大鼠心衰模型提供更為有效的制作方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠50只，由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(新)2011-0004，體質量(200±20)g，隨機分成3組：A組為假手術組(n=10)，B組縮窄腹主動脈直徑至0.45 mm(n=20),C組縮窄腹主動脈直徑至0.7 mm(n=20)。

1.2 儀器

超聲診斷儀(惠普M2424 A)；12 MHz高頻探頭(飛利浦21380 A)；電子天平(上海寺岡電子有限公司 DS-425)；手術顯微鏡(德國卡爾蔡司S100/

OPMIPico)；10%水合氯醛(上海萊江生物科技有限公司 R00635)；注射用青霉素鈉(石藥集團 H13021634)；4%多聚甲醛(博士德生物 AR1069)。

1.3 建立模型方法

所有大鼠術前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，手術區(qū)域備皮、消毒。沿腹白線逐層切開皮膚及肌肉組織至劍突，充分暴露腹腔，在左腎動脈上方鈍性分離腹主動脈，A組只分離腹主動脈，不結扎；B組將4.5號注射針頭(直徑0.45 mm)與腹主動脈平行放置，用6號PROLENE手術線將兩者一起結扎(圖1)，可見左腎缺血變白，然后抽出針頭，將內(nèi)臟歸位；C組用U型銀夾(銀夾內(nèi)徑0.7 mm)造成腹主動脈部分狹窄(圖2)，分層關閉腹腔，3號慕斯線逐層縫合肌肉及皮膚；所有大鼠術后均給予青霉素80萬U/只，連續(xù)3 d肌肉注射，預防感染。

圖1 縮窄腹主動脈至0.45 mmFig.1 Narrowed abdominal aortadiameter up to 0.45 mm

圖2 縮窄腹主動脈至0.7 mmFig.2 Narrowed abdominal aortadiameter up to 0.7 mm

1.4 超聲心動檢測

大鼠造模第4周和第8周分別行超聲心動圖檢測，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，胸部備皮，使用12 MHz高頻探頭取胸骨旁左室短軸切面，由二維超聲引導M型曲線進行測量。測量指標：舒張末期室間隔厚度(IVSd)、舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)和射血分數(shù)(LVEF)。以上指標均在連續(xù)測量3個心動周期后取平均值。

1.5 心臟標本處理

超聲心動圖檢測后將大鼠由腹主動脈放血處死，打開胸、腹腔后迅速剪下心臟、肺臟，用生理鹽水沖洗殘余血液，濾紙吸干水分，去除多余組織，用電子天平秤取全心質量(HW)、左心室質量(LVWI)、肺質量，與體質量比值分別得出左心室質量指數(shù)LVWI、心/體比、肺/體比。

1.6 心肌組織形態(tài)學改變

將心肌組織沿室間隔切除右心室，只保留左心室，剪取左室冠狀面中部環(huán)狀心肌組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水后浸蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅染色 (hematoxylin-eosin staining，HE)，在400倍倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 一般情況

手術后A組大鼠死亡0只，存活率100%。B組大鼠1周內(nèi)死亡6只，2周內(nèi)死亡3只，存活率55%。C組大鼠1周內(nèi)死亡3只，2周內(nèi)死亡3只，存活率70%。8周時行腹主動脈縮窄的大鼠均表現(xiàn)出脫毛、易怒、肺水腫、體質量增長緩慢，活動能力下降，對外界刺激反應遲鈍等表現(xiàn)。

2.2 造模后超聲心動圖檢查結果

術后4周，B組與A組各項指標均有極顯著差異(P<0.01)，C組與A組相比，IVSd、LVPWd、LVEDs、EF有顯著差異(P<0.05)，而LVEDd有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，C組與B組相比，IVSd、LVPWd、LVEDs差異極顯著(P<0.01)，LVEDd、EF也有顯著差異(P<0.05)，見表1；8周時，B組和C組大鼠與假手術組相比IVSd、LVPWd、LVEDs、 LVEDd明顯增加(P<0.05)，EF顯著降低(P<0.01)；C組大鼠IVSd、LVPWd、LVEDs、LVEDd、EF變化程度沒有B組明顯，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。3組大鼠超聲心動圖見圖3～圖8。

表1 4周大鼠超聲心動圖指標比較Table 1 Comparison of echocardiographic indexes at 4

表2 8周大鼠超聲心動圖指標比較Table 2 Comparison of echocardiographic indexes at

圖3 A組4周Fig.3 Echocardiographic of group A at 4 weeks

圖4 B組4周Fig.4 Echocardiographic of group B at 4 weeks

圖5 C組4周Fig.5 Echocardiographic of group C at 4 weeks

圖6 A組8周Fig.6 echocardiographic of group A at 8 weeks

圖7 B組8周Fig.7 Echocardiographic of group B at 8 weeks

圖8 C組8周Fig.8 echocardiographic of group C at 8 weeks

2.3 病理學指標

術后8周B組和C組與A組相比，LVWI、心/體比、肺/體比均有明顯增大(P<0.01)；C組與B組相比LVWI、心/體比有顯著差異(P<0.05)，肺/體比差異極顯著(P<0.01)，見表3。

表3 腹主動脈縮窄組大鼠病理學指標的比較Table 3 Comparison of LVWI,heart/body ratio andlung/body ratio in each

2.4 心肌HE染色

在顯微鏡下觀察心肌細胞的形態(tài)學改變,假手術組心肌細胞排列整齊，肌纖維紋理清晰，染色均勻(圖9)；與假手術組相比，B組心肌纖維變粗，排列紊亂，染色不均，心肌細胞間隙明顯增寬，細胞呈部分水腫，細胞核固縮，深染，間質纖維組織增生伴有炎癥細胞浸潤(圖10)；而C組組織改變程度與A組、B組相比較，心肌纖維排列整齊程度、心肌細胞肥大程度、細胞間隙寬度，介于兩者之間，局部細胞核深染(圖11)。

圖9 A組大鼠心肌(×400)Fig.9 Myocardium of group A(×400)

圖10 B組大鼠心肌(×400)Fig.10 Myocardium of group B(×400)

圖11 C組大鼠心肌(×400)Fig.11 Myocardium of group C(×400)

3 討論

常用的大鼠心衰造模方法主要有以下幾種：①壓力超負荷型：縮窄大鼠主動脈、肺動脈、腹主動脈，該方法初期大鼠心臟代償性增厚，后期心室壁厚度變薄、射血分數(shù)下降, 出現(xiàn)心力衰竭的癥狀。操作過程中控制血管縮窄程度是造模成功的關鍵因素[1]。②容量超負荷型：動靜脈造瘺可行成急性容量負荷增加，該法可研究舒張功能障礙性心力衰竭[2]；③快速起搏法：適合充血性心臟衰竭的評價，便于連續(xù)觀察心衰進展。雖然該方法手術創(chuàng)傷小，試驗周期短，在幾周后就可出現(xiàn)心功能障礙，但成本較高[3]。④化學因素法：部分藥物等可通過影響心率、心肌細胞通道受體影響心功能[4]。⑤造成心肌缺血/梗死模型法：通過結扎冠脈動脈或冠狀動脈微栓塞誘導心肌缺血、梗死，該法創(chuàng)傷大，實驗動物死亡率高，對手術操作也有較高的要求。

有研究者實驗證實不同時限縮窄大鼠腹主動脈與模擬心室肥大到心衰過程密切相關[5]。還有研究者通過雙重縮窄腹主動脈[6]或者在雙腎上縮窄腹主動脈[7]，對比常規(guī)左腎上縮窄都取得了較好的造模成果。本實驗中采用的動脈縮窄法是壓力超負荷型的一種，通過人為縮小大鼠腹主動脈直徑，引起心臟后負荷增加，心肌代償性肥厚，長期后負荷過重，最終心臟功能失代償，形成心力衰竭[8]。此外，腹主動脈縮窄法還可通過引起腎血流灌注不足，激活腎素-血管緊張素-醛固酮(RASS)系統(tǒng)，形成水鈉潴留，激活血管緊張素轉化酶(ACE)，引起AngⅡ增加，收縮血管，加重心臟負荷，形成心衰惡性循環(huán)，故能較好地模擬神經(jīng)內(nèi)分系統(tǒng)改變[9]。

國內(nèi)實驗有采用0.6 mm針頭、0.8 mm針頭、0.7 mm銀夾縮窄，4周時大鼠心衰成模率較低，觀察5周可出現(xiàn)收縮壓、舒張壓、心指數(shù)增加、心室肥厚，8～12周左右時成模率可有所升高[1、5、10]。本實驗中分別采用0.45 mm針頭和0.7 mm銀夾在左腎上方縮窄腹主動脈，結果顯示：4周時，0.45 mm針頭縮窄組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了明顯心肌向心性肥厚改變，心室腔內(nèi)徑縮小，射血分數(shù)有所降低，但此時射血分數(shù)仍在正常范圍內(nèi)，說明此時還處于心功能代償階段。0.7 mm銀夾縮窄組大鼠在第4周時與對照組相比和IVSd、LVPWd、LVEDs稍有增加(P<0.05)，LVEDd雖有增加趨勢但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，射血分數(shù)也稍有降低，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明此階段0.7 mm銀夾縮窄組大鼠心肌開始逐漸向心肌肥厚發(fā)生轉變，但尚未出現(xiàn)明顯病理生理改變。8周后，用0.45 mm針頭縮窄組大鼠室間隔、左室后壁厚度進一步增加，左室腔內(nèi)徑增大，同時射血分數(shù)已減低至心衰水平，此時心臟收縮功能障礙，進入心衰失代償階段；而用0.7 mm銀夾縮窄組此時才出現(xiàn)明顯心肌肥厚，射血分數(shù)顯著降低，但各項指標變化沒有縮窄至0.45 mm組顯著。提示腹主動脈縮窄法造大鼠心衰模型的與對縮窄程度的把控及縮窄時限的影響相關。

心肌質量指數(shù)(LVWI)是衡量心力衰竭程度的指標之一[11]，8周后的病理學指標顯示：用0.45 mm針頭縮窄組大鼠和用0.7 mm銀夾縮窄組大鼠與假手術組相比均出現(xiàn)了明顯左室心肌質量指數(shù)(LVWI)和心/體比增加，且0.45 mm針頭縮窄組大鼠增加程度更為顯著。心力衰竭時由于肺循環(huán)淤血，造成肺水腫，肺/體比可反映大鼠肺水腫程度，從實驗數(shù)據(jù)可以看出實驗后期0.45 mm針頭縮窄組和0.7 mm銀夾縮窄組都發(fā)生了嚴重肺水腫，0.45 mm針頭縮窄組肺水腫程度明顯高于0.7 mm銀夾縮窄組。由此，說明從大鼠心肌肥厚發(fā)展至心力衰竭的進程中，0.7 mm銀夾縮窄組無論是時限還是心衰程度都要明顯落后于用0.45 mm針頭縮窄組的大鼠，但由于用0.45 mm針頭縮窄組大鼠對腹主動脈縮窄程度更大，易在術后發(fā)生急性心力衰竭，故死亡率也較高，而用0.7 mm銀夾縮窄組對血流動力學影響較用0.45 mm針頭縮窄組弱，形成心肌肥大和心力衰竭時間較長。

在本次研究的早期實驗中，依照文獻[12]使用升主動脈縮窄法模擬心衰模型，存活率僅為20%，分析死亡原因為手術操作不夠熟練，手術過程復雜，對大鼠生理機能損傷較大，無法耐受，易致急性呼吸衰竭、心力衰竭等綜合原因導致。另外，該方法無法模擬神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)激活及左室收縮功能障礙[13]。綜上因素考慮，放棄升主動脈縮窄法，采用腹主動脈縮窄法。

綜上所述，相較其他心衰造模方法，腹主動脈縮窄法對大鼠損傷小，操作方法簡便，成模確切性高，是比較理想的造模方法。用0.45 mm針頭縮窄腹主動脈可在短時間內(nèi)形成典型心肌肥厚，心衰成模所需時間也有所縮短，但死亡率較高。每種造模方法都有其各自的優(yōu)勢與局限性，研究者可根據(jù)實驗方向選擇適合的方法，為心力衰竭的研究提供更多理論資料。