楊 明，袁 悅，李憲臻，楊 帆

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

【研究意義】纖維素是地球上最豐富的有機(jī)聚合物，平均占植物生物量的30%～50%[1-2]。研究纖維素降解相關(guān)菌群對(duì)于解決農(nóng)業(yè)廢棄物的回收利用、可再生能源的開發(fā)等環(huán)境和能源問題有著重要意義[3-4]。纖維素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接構(gòu)成，由于聚合度高加之結(jié)晶度高的特性，導(dǎo)致其難以降解，極大地限制了纖維素在上述相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用[5]。纖維素的生物降解需要多種纖維素酶協(xié)同完成，包括內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶等[6-7]。纖維素酶是由纖維素降解菌合成分泌，纖維素降解菌廣泛存在于自然界中，多分布在纖維素聚集和降解的環(huán)境[8]。這些環(huán)境中多以微生物復(fù)合菌系協(xié)同作用的方式完成纖維素的降解，因此研究環(huán)境細(xì)菌多樣性對(duì)于闡明纖維素生物降解機(jī)理顯得尤為重要。【前人研究進(jìn)展】瘤胃、堆肥和森林土壤等是研究的較多的纖維素降解環(huán)境[9]，其中含有大量能夠降解纖維素的微生物。目前已有很多關(guān)于纖維素酶產(chǎn)生菌的研究報(bào)道，其中大多數(shù)中篩選自動(dòng)物瘤胃、堆肥、森林土壤等環(huán)境[10-11]。然而，基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)分析方法存在很大的局限性，自然界中超過99%的微生物都是不可培養(yǎng)的[12]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，16S rDNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序分析技術(shù)可直接針對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行分析，基于16S rDNA的高變區(qū)序列信息對(duì)微生物群落中的細(xì)菌進(jìn)行物種種類和豐度的鑒定[13]，能夠更全面地分析微生物多樣性。Li等[14]應(yīng)用16S rDNA基因測(cè)序方法對(duì)牛瘤胃菌群進(jìn)行了分析，獲得了以45個(gè)核心微生物屬為主的共107個(gè)細(xì)菌屬，展現(xiàn)出豐富的菌群多樣性。Ren等[15]對(duì)牛糞堆肥中的微生物群落進(jìn)行了16S r DNA基因高通量測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)菌門包括擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，并且發(fā)酵的不同階段具有不同的細(xì)菌。王志方等[16]應(yīng)用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)棉秸稈自然腐解過程中不同時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在第7天時(shí)細(xì)菌群落多樣性在屬水平上與腐解起始階段差異顯著（P＜0.05），隨著腐解時(shí)間延長，菌落多樣性趨于一致；在整個(gè)腐熟過程中始終存在5個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，功能預(yù)測(cè)為降解纖維素、木質(zhì)素、果膠類物質(zhì)以及提供氮素營養(yǎng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，測(cè)序技術(shù)以超摩爾定律的速度在不斷發(fā)展，測(cè)序成本越來越低[17]，16S rDNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)也在不斷加速積累，且海量的數(shù)據(jù)被公開于NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫，這其中也包括瘤胃、堆肥、土壤等不同自然環(huán)境下纖維素降解菌群數(shù)據(jù)。此外，盡管16S rDNA基因測(cè)序技術(shù)在纖維素降解菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性研究方面取得了進(jìn)展，但這些研究多數(shù)僅僅關(guān)注的是來自某種特定環(huán)境的纖維素降解菌群，卻很少有研究對(duì)不同環(huán)境下的纖維素降解菌群進(jìn)行比較分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選取了來自NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫中的牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤3種代表性的纖維素降解菌群和作為對(duì)照的家犬腸道微生物群落共102個(gè)的16S rDNA樣本的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了細(xì)菌群落多樣性的共性和差異分析，以評(píng)估不同來源的纖維素降解菌群在各個(gè)分類級(jí)別上的共性和差異特征，鑒定各類菌群的生物標(biāo)志物，對(duì)功能主導(dǎo)性菌群進(jìn)行挖掘，為進(jìn)一步探索纖維素降解菌群的功能、研究纖維素降解生物學(xué)機(jī)制以及開發(fā)有利用價(jià)值的微生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 數(shù)據(jù)采集 16S rDNA Illumina Miseq高通量測(cè)序數(shù)據(jù)搜索自NCBI（National Center of Biotechnology Information）的SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫中收錄的牛瘤胃BR（SRA ID：SRP156364）、牛糞堆肥CDC（SRA ID：SRP074428）、森林土壤FS（SRA ID：SRP125392）和家犬糞便DF（SRA ID：SRP092477）4個(gè)項(xiàng)目的樣本數(shù)據(jù)。

1.1.2 數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn) 將搜索到的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，保留16S rDNA數(shù)據(jù)篩選均需符合下列生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：（1）牛瘤胃菌群來自愛爾蘭米斯郡歐洲農(nóng)業(yè)食品有限公司的健康牛瘤胃；（2）牛糞堆肥菌群來自加拿大農(nóng)業(yè)與食品學(xué)會(huì)的牛糞好氧堆肥；（3）森林土壤菌群FS采集自中國遼寧省撫順市林場(chǎng)的針葉林表層土（深度不超過10 cm）細(xì)菌；（4）家犬糞便DF微生物樣本為未作處理的健康狀態(tài)下家犬的新鮮糞便樣本，來自密蘇里大學(xué)（美國密蘇里州哥倫比亞）。技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)：（1）16S rDNA基因擴(kuò)增序列為V4區(qū)；（2）測(cè)序平臺(tái)為Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)；（3）測(cè)序數(shù)據(jù)量不小于30 Mbp。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

應(yīng)用SRA Toolkit軟件中的fastq-dump命令將sra格式的文件轉(zhuǎn)換為FastQ格式[18]。FastQ格式的雙末端reads經(jīng)過濾獲得高質(zhì)量reads[19]。應(yīng)用FLASH軟件[20]將雙末端reads拼接成Tags，并去除沒有overlap關(guān)系的reads，低質(zhì)量的Tags（雙末端reads最小重疊長度為15 bp，其重疊區(qū)域錯(cuò)配率＞10%）以及攜帶的引物序列的Tags，從而得到高質(zhì)量Tags。應(yīng)用SRA Toolkit軟件中的fastq-dump命令下載SRA格式的文件并轉(zhuǎn)換為FastQ格式。應(yīng)用USEARCH GLOBAL方法，將Tags重新比對(duì)回OTU序列得到每個(gè)樣品在每個(gè)OTU的豐度統(tǒng)計(jì)表[24]。應(yīng)用RDP classifier（v2.2）[25]將OTU與Greengenes數(shù)據(jù)庫[26]比對(duì)進(jìn)行物種注釋（如果Tag長度大于等于250 bp，置信度閾值設(shè)置為0.8，否則設(shè)置為0.5），去除沒有注釋結(jié)果和非細(xì)菌物種的OTU，并根據(jù)注釋結(jié)果計(jì)算每個(gè)樣本組在各分類水平（門、綱、目、科和屬）的群落組成結(jié)構(gòu)信息。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

Alpha多樣性反映了單個(gè)樣本內(nèi)物種的多樣性。mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性的觀察指數(shù)（observed species index）、趙氏指數(shù)（chao1 index）、艾斯指數(shù)（abundance-based coverage estimator index，ACE index）、香農(nóng)-維納指數(shù)（shannon-wiener index）和辛普森指數(shù)（simpson index）。觀察指數(shù)反映的是已經(jīng)檢測(cè)到的物種數(shù)量；趙氏指數(shù)和艾斯指數(shù)則是基于物種和豐度值對(duì)真實(shí)物種數(shù)的推測(cè)；香農(nóng)-維納指數(shù)和辛普森指數(shù)則反映群落的多樣性，是物種數(shù)量和豐度分布均一性的綜合反映。Beta多樣性分析用于評(píng)估樣品在物種復(fù)雜性上的差異距離。通過QIIME（v1.80）[27]計(jì)算加權(quán)和非加權(quán)Unifrac距離[28]，主坐標(biāo)分析（PCoA）使用的是R軟件（v3.0.3）的WGCNA，stats和ggplot2軟件包，即將加權(quán)或非加權(quán)UniFrac距離矩陣轉(zhuǎn)化為一組新的正交軸，其中最大變異的因子作為第一主坐標(biāo)，第二大變異因子作為第二主坐標(biāo)表示。R軟件的VennDiagram包用于繪制Venn圖，ggplot2包用于繪制箱線圖和柱狀圖。Metastats軟件（http://metastats.cbcb.umd.edu）用于組間顯著性差異分析。統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)均以α=0.05為標(biāo)準(zhǔn)界定是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LEfSe（v1.0）[29]用于發(fā)現(xiàn)各組中物種生物標(biāo)志物（Biomarker），其LDA分?jǐn)?shù)的閾值設(shè)為4。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同纖維素降解環(huán)境菌群多樣性分析與比較

牛瘤胃BR、牛糞堆肥CDC、森林土壤FS和家犬糞便DF 4個(gè)組共102個(gè)樣本的16S rDNA基因擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過前處理，共獲得8 122 885條高質(zhì)量16S rDNA標(biāo)簽序列，平均每個(gè)樣本的數(shù)量約為79 636，在97%的相似水平上進(jìn)行操作分類單元（OTU）序列聚類，共獲得80 386個(gè)OTU類群。觀察物種指數(shù)（observed species index）結(jié)果顯示物種平均豐富度由高到低為牛糞堆肥、家犬糞便、牛瘤胃，森林土壤僅顯著低于牛糞堆肥，但與其他兩組無顯著差異。趙氏指數(shù)（chao1 index）和艾斯指數(shù)（ACE index）結(jié)果均顯示平均物種豐富度最高為牛糞堆肥，其次為家犬糞便和牛瘤胃，而森林土壤與其他環(huán)境未表現(xiàn)出顯著差異。香農(nóng)-維納指數(shù)（shannon-wiener index）和辛普森指數(shù)（simpson index）均可以用來估算細(xì)菌多樣性。香農(nóng)-維納指數(shù)值越大，細(xì)菌多樣性越高；辛普森指數(shù)介于0和1之間，與香農(nóng)-維納指數(shù)相反，數(shù)值越低細(xì)菌的多樣性越高。因此，這兩個(gè)細(xì)菌多樣性指數(shù)均顯示牛糞堆肥菌群多樣性顯著高于其他環(huán)境，且牛瘤胃的香農(nóng)-維納指數(shù)顯著高于家犬糞便。

本研究對(duì)4個(gè)群落的Unifrac Beta多樣性進(jìn)行分析并用主坐標(biāo)分析（PCoA）的可視化方式進(jìn)行展示，以評(píng)估各樣本之間的相似度和差異。如圖2所示，非加權(quán)Unifrac PCoA的第一主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率達(dá)19.6%，第二主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率達(dá)15.2%，共代表總變量的34.8%；加權(quán)Unifrac PCoA的第一主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率達(dá)31.2%，第二主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率達(dá)16.3%，共代表總變量的47.5%?；贠TU豐度數(shù)據(jù)可以把同一個(gè)樣本組的菌群樣本聚集在一定區(qū)域內(nèi)，而不同樣本組間獲得了很好的分離。

2.2 不同纖維素降解環(huán)境菌群的組成差異

所有樣本組中總共檢測(cè)出55個(gè)門，其中Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria是4個(gè)最優(yōu)勢(shì)門，他們均在牛瘤胃和牛糞堆肥中均占有很大比例（圖3a）。作為對(duì)照的家犬糞便菌群以Bacteroidetes、Firmicutes、梭桿菌門（Fusobacteria）和Proteobacteria為最優(yōu)勢(shì)門，F(xiàn)usobacteria是其特有門，另外存在極少量的Actinobacteria。牛糞堆肥中Bacteroidetes相對(duì)豐度顯著低于其他菌群（圖3d），而Actinobacteria的相對(duì)豐度顯著高于其他菌群（圖3e）。與牛瘤胃和牛糞堆肥不同，森林土壤環(huán)境中的Proteobacteria顯著高于其他纖維素降解環(huán)境（圖3b），僅存在極低豐度的Firmicutes（圖3c）。

屬水平上所有樣本中總共檢測(cè)到1 936個(gè)屬，選取相對(duì)豐度最高的前17個(gè)屬（不包括Unclassified、Others和Uncultured）進(jìn)行了比較（圖4a）。家犬糞便中的優(yōu)勢(shì)屬包括梭桿菌屬（Fusobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、Prevotella-9和乳酸菌屬（Lactobacillus），除了Lactobacillus外其余均為家犬糞便中的特有菌屬。牛瘤胃中相對(duì)豐度較高的屬有琥珀酸弧菌UCG-001屬（SuccinivibrionaceaeUCG-001）、Prevotella-7、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、Succiniclasticum、Prevotella-1和少量的Lactobacillus，其中SuccinivibrionaceaeUCG-001和Succiniclasticum僅在牛瘤胃中被觀察到，而Prevotella在動(dòng)物消化道來源的環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)，不同的是Prevotella-7和Prevotella-1存在于牛瘤胃中，而Prevotella-9存在于家犬糞便中。Methanobrevibacter在牛瘤胃和牛糞堆肥中均被檢測(cè)到，牛糞堆肥中的相對(duì)豐度較低。牛糞堆肥中的觀察到的特有菌屬包括Halocella、Limnochordaceae-ge和氫孢菌屬（Hydrogenispora）。另外，Pseudomonas僅在牛糞堆肥和森林土壤中被檢測(cè)到，且在前者中相對(duì)豐度極顯著低于后者（P＜0.01）。此外，黃桿菌屬（Flavobacterium）、NS3a海洋菌屬（NS3amarine group）和假噬纖維菌屬（Pseudarcicella）屬為森林土壤中所特有。

圖3 不同環(huán)境菌群門水平相對(duì)豐度分布和優(yōu)勢(shì)菌門差異比較Fig.3 Relative abundance distribution at phylum level and the difference of relative abundance of dominant phylum in different environments

圖4 不同環(huán)境菌群下屬水平優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度分布和Venn圖Fig.4 Relative abundance distribution and Venn diagram at genus level in different environments

韋恩圖分析（圖4b）表明僅有73（4.44%）個(gè)屬是4類菌群共有的，86個(gè)屬是3類纖維素降解菌群共有的。而森林土壤和牛糞堆肥中的特有屬較多，分別為677和224個(gè)；牛瘤胃和家犬糞便中的特有的屬分別僅觀察到10和56個(gè)。屬水平統(tǒng)計(jì)的物種豐富度從高到低表現(xiàn)為森林土壤、牛糞堆肥、牛瘤胃、家犬糞便，分別檢測(cè)到1 413、1 044、414和269個(gè)屬。

圖5 不同環(huán)境菌群的LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis of bacterial communities from different environments

2.3 不同纖維素降解環(huán)境菌群生物標(biāo)志物分析

為了更進(jìn)一步考察不同環(huán)境中纖維素降解菌的差異尋找不同環(huán)境的關(guān)鍵菌群，本研究對(duì)物種注釋后獲得的OTUs豐度譜進(jìn)行了線性判別分析效應(yīng)值（LEfSe）分析（圖5）。LEfSe為最近出現(xiàn)的一種基于線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)量（effect size）的分析方法，其本質(zhì)是將非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis多組檢驗(yàn)與Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）與線性判別分析相結(jié)合，從而篩選關(guān)鍵的生物標(biāo)志物（比如關(guān)鍵功能類群/物種）[30]。結(jié)果顯示，牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤及家犬糞便組間具有顯著差異的不同級(jí)別分類單元重要的生物標(biāo)志物數(shù)量分別為12、5、9和13。由于不同分類級(jí)別的生物標(biāo)志物之間存在從屬關(guān)系，表1對(duì)LEfSe分析結(jié)果進(jìn)行了整理，并對(duì)各個(gè)生物標(biāo)志物的相對(duì)豐度進(jìn)行標(biāo)識(shí)，以直觀展示不同環(huán)境中重要生物標(biāo)志性物種及其相對(duì)豐度。生物標(biāo)志物將以門水平和最低級(jí)別分類水平加以描述。對(duì)照組家犬糞便的生物標(biāo)志物包括Bacteroidetes的Bacteroides、Fusobacteria的Fusobacterium以及來自Firmicutes的Faecalibacterium。與對(duì)照組同為動(dòng)物消化系統(tǒng)直接來源菌群，牛瘤胃組中的生物標(biāo)志物包括廣古菌門（Euryarchaeota）、來自Proteobacteria的SuccinivibrionaceaeUCG-001、來自Bacteroidetes的Prevotella-7、來自Firmicutes的Selenomonadales和Lachnospiraceae；作為動(dòng)物消化系統(tǒng)和體外環(huán)境來源的混合菌群，牛糞堆肥組的生物標(biāo)志物為來自Actinobacteria門Actinobacteria綱和來自Firmicutes的Bacillales；作為體外環(huán)境來源菌群森林土壤組生物標(biāo)志物以Proteobacteria為主，包括Pseudomonas、Alphaproteobacteria、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）以及Bacteroidetes門的Flavobacteriaceae。

表1 不同環(huán)境菌群的生物標(biāo)志物及其相對(duì)豐度*Tab.1 Relative abundance of biomarkers from different environments

3 討論

隨著二代測(cè)序技術(shù)成本逐漸降低和技術(shù)的不斷更新，16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)被廣泛用于纖維素降解菌群多樣性的研究中，加強(qiáng)了人們對(duì)纖維素降解菌群結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)知。然而大多數(shù)研究者僅關(guān)注于單一環(huán)境類型中的纖維素降解菌群，卻鮮有對(duì)不同環(huán)境下的纖維素降解菌群進(jìn)行分析。本研究以家犬糞便菌群16S rDNA序列數(shù)據(jù)為對(duì)照，選擇來自牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤的3類菌群數(shù)據(jù)作為不同環(huán)境條件下的纖維素降解菌群，對(duì)其菌群結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行對(duì)比分析，旨在闡明菌群的結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步挖掘有潛在應(yīng)用價(jià)值的纖維素降解菌以及解析纖維素降解功能奠定理論基礎(chǔ)。

菌群多樣性分析發(fā)現(xiàn)，牛糞堆肥菌群在物種種類和物種豐度的均一性上均高于其他組別，牛糞堆肥菌群是來自于厭氧牛體內(nèi)環(huán)境和體外環(huán)境的混合菌群，這可能是造成上述現(xiàn)象的一個(gè)原因。森林土壤組內(nèi)樣本的alpha多樣性指數(shù)之間差異較大，可能與其復(fù)雜多變的環(huán)境和采樣的時(shí)間地點(diǎn)有關(guān)，菌群多樣性高可能更有利于應(yīng)對(duì)復(fù)雜多變環(huán)境，比如對(duì)溫差、濕度等的適應(yīng)性。此外，物種豐度分析顯示森林土壤中屬的數(shù)量高于牛糞堆肥，可能是由森林土壤組內(nèi)樣本差異大造成。PCoA分析結(jié)果充分說明了樣本分組的可靠性，同時(shí)表明來源于不同環(huán)境的菌群之間的群落多樣性存在較大差異。

本研究檢測(cè)到Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria 4個(gè)來自纖維素降解菌群的優(yōu)勢(shì)門，這與先前的許多報(bào)道一致[31-34]。Firmicutes存在大量纖維素降解菌[35]，可能是牛瘤胃和牛糞堆肥菌群中降解纖維素的主要門。Bacteroidetes對(duì)多糖等碳水化合物具有較好的降解能力[36]，在4個(gè)菌群中均大量存在，是家犬腸道中的生物標(biāo)志物。有研究表明，Actinobacteria是降解木質(zhì)素與纖維素的主要功能菌門[2，37]。在土壤有機(jī)層中豐度最高的門為Proteobacteria和Bacteroidetes，而Firmicutes則更多的存在于礦物土壤中[38]，這與本研究結(jié)果一致，說明Proteobacteria是森林土壤中纖維素降解重要門。此外，Euryarchaeota常被發(fā)現(xiàn)于牛瘤胃中，然而很少有證據(jù)證明其纖維素降解能力，盡管Sorokin等[39]首次鹽古菌（Haloarchaea）具備降解幾丁質(zhì)和纖維素的能力，然而本研究中并未檢出鹽古菌。

LEfSe分析可幫助研究者發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物，但也存在靈敏度不足的情況導(dǎo)致一些特異性的功能性細(xì)菌漏檢，因此對(duì)LEfSe分析結(jié)果和環(huán)境特異性屬進(jìn)行整合可作為一種優(yōu)化的方法鑒定環(huán)境特異性纖維素降解菌。家犬糞便以Fusobacterium、Bacteroides和Faecalibacterium為生物標(biāo)志物，其特有優(yōu)勢(shì)菌屬為Prevotella-9和Lactobacillus，均為雜食性哺乳動(dòng)物腸道常見菌株[40]。牛瘤胃的生物標(biāo)志物包括Lachnospiraceae、Euryarchaeota、SuccinivibrionaceaeUCG-001、Prevotella-7和Selenomonadales，除此之外其特有優(yōu)勢(shì)菌屬還包括Prevotella-1，Succiniclasticum和Methanobrevibacter。Clostridiales是瘤胃中纖維小體的主要生產(chǎn)者[41]。Lachnospiraceae屬于Clostridiales，是牛瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌，存在能夠降解纖維素的細(xì)菌，如丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）和互養(yǎng)球菌屬（Syntrophococcus）等[42]。另外，Seshadri等[43]在410個(gè)瘤胃細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)大量參與形成纖維素體的Clostridiales細(xì)菌。SuccinivibrionaceaeUCG-001是Aeromonadales中的最優(yōu)勢(shì)屬，Succinivibrionaceae可發(fā)酵淀粉等碳水化合物產(chǎn)生琥珀酸和醋酸鹽，有可能參與纖維素代謝中間產(chǎn)物的降解，但尚未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道該科可降解纖維素。Prevotella是纖維素降解過程中的優(yōu)勢(shì)屬[44-46]，Prevotella的細(xì)菌（如P.ruminicola等）可直接生產(chǎn)纖維素酶，厭氧環(huán)境中可與其他纖維素降解菌協(xié)同降解纖維素[35，47]。Selenomonadales來自厭氧菌綱（Negativicutes）最優(yōu)勢(shì)的屬為月形單胞菌屬（Selenomonas），以降解淀粉為主[48]，但某些菌株（如S.ruminantium）具備纖維素降解功能[49]。Succiniclastium是典型的纖維降解菌，能發(fā)酵降解纖維素或纖維二糖產(chǎn)生琥珀酸、乙酸和二氧化碳等[50]。Methanobrevibacter是Euryarchaeota門的最優(yōu)勢(shì)屬，是一類產(chǎn)甲烷菌[51]。牛糞堆肥中的生物標(biāo)志物為Actinobacteria和Bacillales。Bacillales中存在較多纖維素降解菌，比如常見的來源于堆肥或土壤纖維素降解菌Bacillus等[52]。Actinobacteria（綱）有著基因組GC含量高以及細(xì)胞壁厚的特點(diǎn)，能適應(yīng)高溫、強(qiáng)堿等極端環(huán)境，其中很多細(xì)菌具有纖維素降解能力，如Actinanyces cellulose、諾卡氏菌屬（Nocardia）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等[53-55]，因此Actinobacteria可能是牛糞堆肥中重要的纖維素降解菌。另外，牛糞堆肥中特有優(yōu)勢(shì)菌屬包括Halocella、Limnochordaceae-ge和Hydrogenispora，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Halocella包括H.cellulosilytica和H.sp.SP3-1，可在高鹽環(huán)境下生存，均具備降解纖維素和纖維二糖的能力[56-57]。Hydrogenispora來自梭菌綱（Clostridia），與Clostridiumsp.6-31較為近緣，能夠發(fā)酵降解多種碳水化合物[58]，但尚無充分證據(jù)支持其纖維素降解能力。有關(guān)Limnochordaceae-ge屬的相關(guān)報(bào)道并不多，有待于進(jìn)一步研究。森林土壤組的生物標(biāo)志物包括Alphaproteobacteria、Pseudomonas、Flavobacteriaceae以及Burkholderiaceae。Pseudomonas屬于嚴(yán)格好氧型纖維素降解菌，可產(chǎn)生纖維素酶[59-60]，在牛糞堆肥中的豐度低于森林土壤，可能是森林土壤和牛糞堆肥的重要的纖維素降解菌。Flavobacteriaceae的優(yōu)勢(shì)屬為NS3amarine group和Flavobacterium，僅發(fā)現(xiàn)于森林土壤。Flavobacterium能夠降解復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)如纖維素、半纖維素、幾丁質(zhì)等有機(jī)聚合物[61-63]。NS3amarine group常常在海洋藻類中與Flavobacterium一起被發(fā)現(xiàn)[64]，推測(cè)其可能具備纖維素降解功能。Alphaproteobacteria在森林土壤中被大量發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)勢(shì)屬包括Brevundimonas、生絲單胞菌屬（Hyphomonas）和紫桿菌屬（Porphyrobacter）等，物種種類較為豐富，但各屬的相對(duì)豐度較低，但其中也存在纖維素降解菌，比如Rhodobacterales中Brevundimonas和Hyphomonas均具備降解纖維素能力，其中Brevundimonas可在低溫環(huán)境下產(chǎn)生纖維素酶[65-66]。森林土壤樣本中的Burkholderiaceae的諸多細(xì)菌具備降解纖維素的能力如伯克氏菌屬（Burkholderia）[67]。Pseudarcicella屬是2012年K?mpfer等[68]在醫(yī)用水蛭皮膚上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新屬，被歸屬于噬纖維菌科（Cytophagaceae），其中絕大多數(shù)物種均有纖維素降解功能[69]，故推測(cè)其具備纖維素降解功能。

4 結(jié)論

本研究對(duì)4組來自于不同環(huán)境的共102個(gè)環(huán)境微生物群落樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。Alpha多樣性顯示，牛糞堆肥中物種種類和豐度的alpha多樣性指數(shù)顯著高于其他兩種纖維素降解菌群?；诜羌訖?quán)和加權(quán)Unifrac距離的PCoA分析說明不同環(huán)境中的纖維素降解菌群的微生物多樣性差異較大。Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria是本研究在各類環(huán)境菌群間檢測(cè)到的最具優(yōu)勢(shì)的4個(gè)門，不同環(huán)境間在門水平就存在著顯著差異，表現(xiàn)出了特異性。各類環(huán)境菌群間在屬水平上差異極大，絕大多數(shù)屬表現(xiàn)出有和無的定性差異，進(jìn)一步說明不同樣本的纖維素降解菌群多樣性的不同。LEfSe分析鑒定到了牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤中的生物標(biāo)志物分別有5、2和4個(gè)。最后，LEfSe結(jié)果、屬水平相對(duì)豐度信息以及先前的文獻(xiàn)報(bào)道的綜合分析和討論，鑒定到牛瘤胃、牛糞堆肥、森林土壤中同時(shí)具備環(huán)境特異性和纖維素降解功能的細(xì)菌分類單元分別有4，3和5個(gè)。本研究從宏觀層面即來自不同環(huán)境的纖維素降解菌群的多樣性和差異進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步闡明天然細(xì)菌群落的纖維素降解的協(xié)同作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為構(gòu)建具備相應(yīng)環(huán)境適應(yīng)性的纖維素降解菌群以及篩選在生產(chǎn)生活中有應(yīng)用價(jià)值的菌株提供了理論指導(dǎo)。