江紹鋒，趙 美，舒燦偉，周而勛*

（1.華南農業(yè)大學 農學院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.桂林醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院，廣西 桂林 541000）

【研究意義】水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起的水稻三大真菌病害之一，它是一種重要的土壤傳播的植物病原真菌病害。黑色素是植物病原真菌重要的毒力因子。生物體內氨基酸是黑色素形成的主要前體物質，不僅與形成的黑色素類型和色素沉淀深淺密切相關，同時也影響到生物的健康狀況。氨基酸在水稻紋枯病菌黑色素形成中起著重要的作用，對水稻紋枯病菌防治具有潛在價值。【前人研究進展】氨基酸不僅是生物合成蛋白質的重要原料，也是生物進行正常生長，維持生命的重要物質組成基礎，生物調節(jié)自身新陳代謝的關鍵就是通過氨基酸相關代謝途徑合理的轉化和轉換[1]。某些氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸等）在相應的氧化還原酶催化下發(fā)生棕色化反應，形成對生物具有重要新陳代謝影響的吡嗪、吡咯和呋喃類化合物[2-4]。苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶（phenylalamine hyolroxylase）的催化作用下引入羥基，由葉酸還原酶催化生成二氫生物喋呤，再通過輔酶（四氫生物嘌呤），在NADPH和H+存在的條件下還原為四氫化合物，苯丙氨酸羥化酶的催化反應是不可逆的，不能夠由體內酪氨酸轉變?yōu)楸奖彼醄5]。酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下羥化合成多巴，然后多巴再經氧化作用形成多巴醌，多巴醌進一步通過環(huán)化和脫羧作用生成吲哚醌，最終進入合成黑色素的代謝途徑。人和小鼠等動物若缺乏酪氨酸酶，體內黑色素合成代謝發(fā)生障礙，就會使皮膚、毛發(fā)變“白”，出現(xiàn)白化?。╝lbinism）[6-10]。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase）催化酪氨酸成為3，4-二羥基苯丙氨酸，又稱為多巴（3，4-dihydroxyphenylalanineL，DOPA）。酪氨酸羥化酶也是通過以四氫生物喋呤為輔酶的單加氧酶，然后多巴在多巴脫羧酶的作用下催化生成多巴胺（dopamine）；多巴胺需要在多巴胺-β-氧化酶（dopamine-β-oxidase）的催化下使β-碳原子羥化，得到去甲腎上腺素（norepinephrine）；最終通過去甲腎上腺素甲基化合成腎上腺素（epinephrine）[11]。以上的多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素三者統(tǒng)稱為兒茶酚胺（catecholamine）[12]。在黑色素細胞中，酪氨酸羥化酶是兒茶酚胺合成最重要的限速酶，同時會受到終產物的反饋調控。【本研究切入點】水稻紋枯病菌過氧化氫酶（RsCat）受到兒茶酚的負調控，隨著外源兒茶酚質量濃度的升高，酶活力降低[13]；而兒茶酚是水稻紋枯病菌苯酚2-單加氧酶（RsPhm）催化的底物，在菌核和黑色素形成中起著重要的作用[14]。Abdelmotaal等[15]研究表明莨菪堿會引起稻瘟病菌和立枯絲核菌菌絲體電解質的泄露，進而抑制孢子萌發(fā)和附著胞的形成，400 μg/mL質量濃度的莨菪堿使稻瘟病菌附著胞死亡率約為10%，而當莨菪堿濃度為1 000 μg/mL時，附著胞死亡率高達70%。兒茶酚是一種抗氧化劑，有抗衰老和抗真菌的效果。實驗前期研究發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基添加300 μg/mL質量濃度的莨菪堿促進紋枯病菌菌絲和菌核的生長，而50 μg/mL質量濃度的兒茶酚抑制紋枯病菌菌絲和菌核生長，這兩種物質對水稻紋枯病菌菌絲和菌核表型的影響明顯，是非常好的黑白表型對照[16]?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過比較水稻紋枯病菌菌絲體和發(fā)酵液中的游離氨基酸含量和組成的差異，篩選可能與水稻紋枯病菌黑色素存在密切關聯(lián)的氨基酸，為進一步揭示氨基酸在水稻紋枯病菌黑色素形成中的作用提供參考，對未來防治水稻紋枯病具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株信息和培養(yǎng)基

水稻紋枯病菌（R.solaniAG1-IA）GD-118來源于本實驗室保存的強致病力菌株[17]。

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：葡萄糖20.0 g，馬鈴薯200.0 g，雙蒸水1 000.0 mL，瓊脂粉18.0 g；馬鈴薯液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：葡萄糖20.0 g，馬鈴薯200.0 g，雙蒸水1 000.0 mL。用高壓蒸汽滅菌鍋在121℃、105 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 主要儀器和試劑

氨基酸分析儀（日立L-8800型），氨基酸標準品。

1.3 水稻紋枯病菌培養(yǎng)

從斜面平板上挑取水稻紋枯病菌（R.solaniAG1-IA）GD-118菌株在PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)2 d。

1.4 水稻紋枯病菌樣品的收集

利用打孔器（直徑5.0 mm）在生長2 d菌齡的水稻紋枯病菌GD-118菌株的菌落邊沿對PDA培養(yǎng)基打孔，用滅菌的牙簽挑取菌絲塊，然后把10個菌絲塊轉移到含有終濃度為50 μg/mL質量濃度的兒茶酚組（RsC），300 μg/mL質量濃度的莨菪堿組（RsH）的150 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，對照組（Rs）不做任何處理（空白PDB）。接菌后，將3種處理的培養(yǎng)基置于搖床，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d后，用抽氣泵過濾，分別收集菌絲體和發(fā)酵液樣品，稱量菌絲體的重量，然后用無菌水洗滌菌絲體2～3次，最后再用滅菌濾紙吸干菌絲體樣品表面多余的水分，菌絲體和發(fā)酵液樣品分別用于下一步的氨基酸分析。

1.5 樣品的前處理

將樣品分別定量后放入水解管中，往菌絲體的水解管中分別加入6 mol/L 10 mL鹽酸，5 mL發(fā)酵液的水解管中分別加入5 mL濃鹽酸（12 mol/L），然后接在真空泵抽氣管上，使水解管減壓后封口，再把封好的水解管放入恒溫干燥箱（110±1）℃進行水解22 h后，拿出冷卻。打開水解管，過濾，取出1 mL濾液，置于濃縮器中干燥，殘留物用1 mL去離子水溶解后蒸干，如此重復3次，再加入1 mL緩沖溶液（pH 2.2）混合溶解，最終由氨基酸自動分析儀進行測定。

1.6 氨基酸的定性和定量分析

根據(jù)GB/T18246—2000《飼料中氨基酸的測定》標準中的測定方法進行檢測。氨基酸的定性應用氨基酸標準品的保留時間進行檢測。氨基酸定量利用建立外標法的標準曲線來定量分析。氨基酸混標液濃度為50 μmol/L，進樣量為20 μL，重復3次，然后再按照每個氨基酸濃度和峰面積繪制氨基酸標準曲線，最終利用建立的標準曲線對樣品中氨基酸的含量進行定量。在相同的色譜條件下對水稻紋枯病菌菌絲體和發(fā)酵液樣品進行定量分析。

1.7 檢測條件

柱溫：程序恒溫57℃；色譜柱：日立855-350型；反應柱溫：135℃；檸檬酸（鈉）pH緩沖液梯度洗脫；檢測波長：570 nm，440 nm；流速：洗脫泵0.40 mL/min，衍生泵0.35 mL/min；分析時間：59 min。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所得數(shù)據(jù)利用SPSS Statistics 19.0軟件采用方差分析（ANOVA），采用LSD多重分析進行統(tǒng)計檢驗，所有數(shù)據(jù)都在5%的水平上進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 水稻紋枯病菌菌絲體重量的分析

水稻紋枯病菌在28℃搖床振蕩培養(yǎng)3 d后，對照組的水稻紋枯病菌菌絲體重量與50 μg/mL質量濃度的兒茶酚處理組沒有顯著差異，但與300 μg/mL質量濃度的莨菪堿處理組有極顯著差異（圖1）。

2.2 標準曲線及標準氨基酸含量

通過氨基酸自動分析儀分析17種氨基酸標準液色譜結果如圖2所示。從圖2可以看出，標準液中各個氨基酸組分都有很好的分離。圖2A是用于檢測除Pro（脯氨酸）以外的其它16種氨基酸，吸收峰為570 nm，圖2B用于檢測Pro，吸收峰為440 nm。

通過氨基酸混標液進行分析，以氨基酸標準品質量濃度為橫坐標，根據(jù)每個氨基酸出峰時間來判斷氨基酸種類，以峰面積為標準氨基酸標準品的質量濃度，建立17種氨基酸的標準曲線，分析結果如表1所示。

圖1 水稻紋枯病菌在不同培養(yǎng)條件下菌絲體重量的比較Fig.1 Comparison of mycelial weight of R.solani AG-1 IA under different cultural conditions

圖2 標準氨基酸色譜Fig.2 Chromatogram of standard amino acids

2.3 菌絲體氨基酸含量與組成差異分析

水稻紋枯病菌菌絲體氨基酸含量與組成差異分析見表2。由表2可以看出，影響黑色素形成的前體物質苯丙氨酸，在對照組和50 μg/mL質量濃度的兒茶酚處理組中沒有顯著差異，但是在300 μg/mL質量濃度的莨菪堿處理組中與對照組和兒茶酚處理組中都存在顯著差異，并且莨菪堿處理組的總氨基酸含量與對照組和兒茶酚處理組也存在顯著差異。而另一個影響黑色素形成的前體物質酪氨酸，3種處理（組別）間的差異不顯著。同時也發(fā)現(xiàn)天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸和精氨酸共10種氨基酸在兒茶酚處理組和莨菪堿處理組存在顯著差異。在3種處理中，水稻紋枯病菌菌絲體天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸3種氨基酸含量相對比較豐富，分別達到了總氨基酸的9.44%，15.49%和9.61%，而甲硫氨酸占總氨基酸的含量最低，只有1.44%。

表2 水稻紋枯病菌菌絲體氨基酸組成分析Tab.2 Analysis of the amino acid composition of mycelia of R.solani AG-1 IA

2.4 發(fā)酵液氨基酸含量與組成差異分析

水稻紋枯病菌發(fā)酵液氨基酸含量與組成差異分析見表3。影響黑色素形成的前體物質酪氨酸在對照組和50 μg/mL質量濃度的兒茶酚處理組沒有顯著差異，但是300 μg/mL質量濃度的莨菪堿處理組與對照組和兒茶酚處理組都存在顯著差異，另一種黑色素的前體物質苯丙氨酸在3個組別間的差異不顯著，同時水稻紋枯病菌發(fā)酵液中其它11種氨基酸（賴氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、脯氨酸）也不存在顯著差異。在水稻紋枯病菌發(fā)酵液游離的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量相對遠遠高于其它氨基酸含量，分別達到了總氨基酸的17.83%和58.21%，而苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸含量相對較低，不到總氨基酸的1%。水稻紋枯病菌發(fā)酵液中總氨基酸含量不存在顯著差異。

表3 水稻紋枯病菌發(fā)酵液氨基酸組成分析Tab.3 Analysis of amino acid composition in the fermentation broth of R.solani AG-1 IA

3 結論與討論

黑色素是植物病原真菌至關重要的毒力因子，而氨基酸是病原真菌黑色素形成的主要前體物質，它不僅影響著黑色素的形成，同時也影響了生物的健康。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚可以促進水稻紋枯病菌細胞壁的黑色素合成，進而有助于水稻紋枯病菌侵染水稻組織。Jiang等[10]研究表明兒茶酚可以促進水稻紋枯病菌黑化，同時也增強了水稻紋枯病菌對水稻的致病力。

通過對經2種化學藥劑（莨菪堿和兒茶酚）處理后的水稻紋枯病菌的菌絲體和發(fā)酵液進行氨基酸含量和組成差異分析，結果發(fā)現(xiàn)菌絲體和發(fā)酵液游離的氨基酸含量差異有很大的不同，發(fā)酵液的游離氨基酸含量遠遠比水稻紋枯病菌菌絲體的氨基酸含量豐富。水稻紋枯病菌發(fā)酵液中各游離的氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸）含量存在不同程度的差異，而絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸等的差異相對較小。不管是水稻紋枯病菌菌絲體，還是發(fā)酵液，一般來說對于同一種氨基酸，對照組和處理組之間同一種氨基酸含量比其它氨基酸含量的一致性高。在培養(yǎng)基上添加含硫氨基酸，如組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或酪氨酸等，水稻紋枯病菌會減少甚至不形成菌核[19]。

在水稻紋枯病菌菌絲體中天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸3種氨基酸含量相對比較豐富，分別達到了總氨基酸的9.44%，15.49%和9.61%，其中谷氨酸的含量最高，這與畢韻梅等[20]的研究結果一致。而水稻紋枯病菌發(fā)酵液中天冬氨酸和谷氨酸含量分別占到總氨基酸含量的17.83%和58.21%，結果表明不管是水稻紋枯病菌菌絲體還是發(fā)酵液都是谷氨酸和天冬氨酸最為豐富。谷氨酸作為生物體含量最大的一種氨基酸，小麥中的蛋白質中谷氨酸含量為30%～35%，飲食中95%的谷氨酸是由腸道細胞代謝[21]。在果蠅中發(fā)現(xiàn)胞外的谷氨酸通過受體脫敏過程調節(jié)突觸谷氨酸受體，同時在伏隔核刺激代謝性的谷氨酸受體，進而減少細胞外谷氨酸水平，這說明細胞外的谷氨酸水平在生物體新陳代謝平衡系統(tǒng)中起著“內分泌”的作用[22-23]。

莨菪堿是一種生物堿。在300 μg/mL質量濃度的莨菪堿處理組中，影響水稻紋枯病菌菌絲體黑色素形成的前體物質苯丙氨酸跟對照組和兒茶酚處理組都存在顯著差異，對照組和50 μg/mL質量濃度兒茶酚處理組沒有顯著差異，而前體物質酪氨酸在三者菌絲體比較中沒有顯著差異，可能的原因是苯丙氨酸羥化酶的催化反應是不可逆，體內的苯丙氨酸可以轉變?yōu)槔野彼?，但是體內酪氨酸不能夠轉變?yōu)楸奖彼?。水稻紋枯病菌發(fā)酵液中對照組和50 μg/mL質量濃度的兒茶酚處理組酪氨酸含量沒有顯著差異，但是300 μg/mL質量濃度的莨菪堿處理組跟對照組和兒茶酚處理組酪氨酸含量都存在顯著差異，而苯丙氨酸在發(fā)酵液中不存在顯著差異。綜上，研究發(fā)現(xiàn)影響水稻紋枯病菌菌絲體和發(fā)酵液黑色素形成的氨基酸不同，在菌絲體中苯丙氨酸對黑色素形成更加重要，而在發(fā)酵液中，則是酪氨酸對黑色素形成更為關鍵，造成這些氨基酸差異的原因有待進一步研究和探討，這為后續(xù)防治水稻紋枯病設計農藥靶點提供了基礎數(shù)據(jù)。