王統(tǒng)苗，張 莘，劉本帥，陳博雯，常國(guó)斌，白 皓，江 勇，張 揚(yáng)，王志秀，陳國(guó)宏*

（1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

【研究意義】微衛(wèi)星（Microsatellite）也稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是一種短串聯(lián)重復(fù)序列，包括核心序列和側(cè)翼序列，核心序列重復(fù)數(shù)是2～7 bp，重復(fù)數(shù)的不同就形成了微衛(wèi)星高度的多態(tài)性，微衛(wèi)星標(biāo)記因其多態(tài)性高、共顯性遺傳且易于檢測(cè)，現(xiàn)已經(jīng)大量應(yīng)用于品種品系的鑒定[1]。我國(guó)是世界上鴨品種資源分布最為豐富的國(guó)家，但是因?yàn)榇罅恳胪鈦?lái)品種，許多地方品種與其雜交，純種不斷減少，我國(guó)地方鴨品種資源的保種亟需改善。為了解引進(jìn)品種的遺傳特征，更有效地保證純種鴨的資源，有必要對(duì)引進(jìn)品種進(jìn)行遺傳學(xué)分析，而微衛(wèi)星標(biāo)記已成為遺傳多樣性常用的方法[2]。與其他形態(tài)學(xué)和生化標(biāo)記相比，微衛(wèi)星分子標(biāo)記能夠直接反映DNA水平上的變化，它的遺傳不受環(huán)境和基因表達(dá)的限制，是動(dòng)物品種鑒別的理想選擇[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】陳贏(yíng)男等[4]利用10對(duì)微衛(wèi)星引物鑒別油茶品種；李智軍等[5]對(duì)5對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，并通過(guò)對(duì)有效等位基因數(shù)的差異顯著性分析輔以各品種特有基因型可以初步鑒別3個(gè)馬匹品種；韓宏曉等[6]利用65個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)主要包括的15個(gè)基因座位基于貝葉斯方法、位點(diǎn)頻率法和遺傳距離法等遺傳分析方法進(jìn)行個(gè)體歸類(lèi)準(zhǔn)確性分析，發(fā)現(xiàn)篩選出的微衛(wèi)星位點(diǎn)可用于純種犬的品種鑒定，完成了對(duì)常見(jiàn)寵物犬品種鑒定的初步應(yīng)用研究；李顯耀[7]從20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中篩選出7個(gè)標(biāo)記可以達(dá)到鑒定H蛋雞配套系品系鑒定的目的；張麗娟等[8]利用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)引進(jìn)國(guó)外的w-98白殼蛋雞配套系的四個(gè)系進(jìn)行了品系鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)攸縣麻鴨、三穗鴨、金定鴨、麻旺鴨、紹興鴨、荊江麻鴨、山麻鴨等7個(gè)品種進(jìn)行品種鑒定，主要因?yàn)檫@7個(gè)品種都屬于蛋鴨品種，且均為麻鴨，僅僅用肉眼難以辨認(rèn)出正確的品種，因此本文利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)這7個(gè)鴨品種的初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

7個(gè)鴨品種分別是三穗鴨、麻旺鴨、紹興鴨（福建省石獅國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)）、荊江麻鴨、攸縣麻鴨、山麻鴨、金定鴨（泰州國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)），每個(gè)品種各30只，公母各半。這些鴨品種采用家系保種法進(jìn)行“家系等量隨機(jī)選配”的繼代繁育。每一世代的保種群規(guī)模70個(gè)家系（其中40個(gè)家系為保種核心群），每一家系飼養(yǎng)14♀，2♂，其中2♀1♂作為備用，下一世代留種時(shí)每家系保持12♀1♂。

1.2 樣本量確定

本研究通過(guò)從70只麻旺鴨分別抽取10、20、30、40、50、60只樣本量，每個(gè)樣本量重復(fù)抽樣10次，取其平均值，統(tǒng)計(jì)基因型頻率，確定樣本量。

1.3 鴨基因組DNA提取

于鴨翅靜脈處采血，用傳統(tǒng)酚-氯仿法提取基因組總DNA[9]，測(cè)DNA濃度和純度，將濃度稀釋到100 ng/L，保存在-20℃冰箱中。

1.4 微衛(wèi)星位點(diǎn)

根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]提供的5對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)AJ515884、CMO11、AJ515898、AJ515893、AJ272579作為試驗(yàn)位點(diǎn)，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 PCR反應(yīng)體系與產(chǎn)物擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：TaqMaster Mix（Dye Plus）10 μL，超純水7 μL，10 pmol/μL上下游引物各1 μL，100 ng/L DNA模板1.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，53～73℃退火30 s（因座位而異），72℃延伸30 s，共30～35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.6 STR分型測(cè)序

將PCR產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，利用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行STR分型測(cè)序。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

GeneMapper4.0軟件生成獨(dú)立的圖譜文件并讀出峰值的大小、片段長(zhǎng)度的大小、峰面積的大小，同時(shí)判斷純合子（單峰）或雜合子（雙峰）。利用Microsatellite-Toolkit軟件計(jì)算等位基因頻率、期望雜合度與觀(guān)察雜合度，根據(jù)Botstein等[12]的公式計(jì)算每個(gè)品種的多態(tài)信息含量。利用Excel表格構(gòu)建柱狀圖。

1.8 聚類(lèi)方法

采用了UPGMA聚類(lèi)方法，以奈氏遺傳距離（DA）為依據(jù)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本采集量

從圖1中可以看出，當(dāng)樣本量為10時(shí)，離散程度最大，變異最大；隨著樣本量的增大，離散程度不斷減小。不同樣本量抽樣10次的平均基因型頻率相近。

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記

5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記最優(yōu)化條件見(jiàn)表1。

2.3 STR分型測(cè)序圖

基于A(yíng)BI-3730XL型DNA測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行掃描。部分位點(diǎn)的擴(kuò)增分型效果見(jiàn)圖2。

圖1 基因型頻率Fig.1 Genotype frequency

2.4 所選微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性

5對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在個(gè)體層面上的遺傳學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2，5對(duì)引物在7個(gè)群體中共檢測(cè)到62個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)12.4個(gè)，其中有3個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)超過(guò)10個(gè)，其中CMO11位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，為17個(gè)；AJ515898位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)最少，為8個(gè)，7個(gè)鴨品種各個(gè)微衛(wèi)星基因座的有效等位基因數(shù)的變化范圍為1.330～2.762，其中微衛(wèi)星標(biāo)記AJ515898的有效等位基因數(shù)最多，達(dá)2.762；最少的微衛(wèi)星標(biāo)記是AJ272579，只有1.330個(gè)。5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均為中高度多態(tài)位點(diǎn)，其中AJ515884、AJ515898標(biāo)記為高度多態(tài)位點(diǎn)，其它3個(gè)標(biāo)記為中度多態(tài)位點(diǎn)。

2.5 5個(gè)微衛(wèi)星基因座在各品種中的多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和群體雜合度（H）

從表3可以看出，麻旺鴨的多態(tài)信息含量最高，其次是荊江鴨、山麻鴨、紹興鴨、攸縣麻鴨、三穗鴨，而金定鴨最低；麻旺鴨的有效等位基因數(shù)最多，攸縣麻鴨最少；麻旺鴨群體雜合度最大，攸縣麻鴨群體雜合度最小。由此可知麻旺鴨的遺傳變異最大。

表1 5對(duì)熒光引物的最優(yōu)化反應(yīng)條件Tab.1 The optimize reaction conditions of 5 pairs fluorescence primers

圖2 金定鴨D07個(gè)體在A(yíng)J515884位點(diǎn)的STR分型結(jié)果Fig.2 STR genotyping result of AJ515884 locus of Jin Ding duck individual D07

表2 5對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳學(xué)參數(shù)Tab.2 Genetic parameters of 5 pairs of SSR primers

2.6 7個(gè)鴨品種的基因型頻率

表4列出了7個(gè)鴨品種的基因型頻率。

2.7 7個(gè)鴨品種間的聚類(lèi)分析

從圖3可以看出，這7個(gè)鴨品種總共分為三大類(lèi)，金定鴨先與紹興鴨聚為一類(lèi)，再與荊江鴨聚為一類(lèi)；山麻鴨與麻旺鴨聚為一類(lèi)，攸縣麻鴨與三穗鴨聚為一類(lèi)。

2.8 鴨品種的初步鑒定

圖4分別是攸縣麻鴨、三穗鴨、金定鴨、麻旺鴨、紹興鴨、荊江麻鴨、山麻鴨根據(jù)等位基因型頻率作的柱狀圖，Y軸為基因型頻率，從圖中可以看出，7個(gè)鴨品種的柱狀圖完全不同，可以明顯的區(qū)分這7個(gè)鴨品種。

表3 5個(gè)微衛(wèi)星座位在各品種中的多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和群體雜合度（H）Tab.3 Polymorphism information content，the number of effective alleles and heterozygosisty of 5 microsatellite loci in each breeds

表4 7個(gè)鴨品種的基因型頻率Tab.4 Genotypic frequencies of 7 duck breeds

圖3 基于Da遺傳距離構(gòu)建的7個(gè)群體的UPGMA聚類(lèi)分析Fig.3 Phylogenetic tree of 7 duck breeds by UPGMA based on Da genetic distance

圖4 鴨品種鑒定Fig.4 Identification of duck breeds

3 討 論

3.1 樣品采集

Mathur（1994）通過(guò)模擬2～10 000個(gè)個(gè)體的DNA指紋后指出在應(yīng)用DNA指紋標(biāo)記時(shí)，每個(gè)品種有15～20個(gè)個(gè)體就可獲得遺傳變異合理的估計(jì)值[13]。本研究通過(guò)計(jì)算不同樣本量的基因型頻率，發(fā)現(xiàn)樣本量越多，基因型頻率越能代表整個(gè)群體的基因型頻率，本研究選取樣本量為30進(jìn)行試驗(yàn)，基本可以獲得群體基因型頻率的合理估計(jì)值。

3.2 遺傳參數(shù)分析

有效等位基因數(shù)（Ne）、雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）都可用于估算群體內(nèi)的遺傳變異，其值的高低顯示了群體內(nèi)個(gè)體的遺傳變異程度，其值越高，變異程度越大[14]。每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有高多態(tài)性，能夠準(zhǔn)確地反映各品種內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)品種的鑒定結(jié)果有很強(qiáng)的說(shuō)服力[15]。有效等位基因數(shù)（Ne）是反映不同群體間和群體內(nèi)不同基因位點(diǎn)間遺傳變異程度的一個(gè)指標(biāo)[17]。實(shí)驗(yàn)5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，通過(guò)STR分型測(cè)序，7個(gè)鴨品種在5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中檢測(cè)到等位基因數(shù)范圍為8～17，且平均有效等位基因數(shù)為1.812，根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因數(shù)大于或等于4非常適合用于遺傳多樣性評(píng)估。試驗(yàn)所選取的5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，在7個(gè)鴨品種中均達(dá)到了中高度多態(tài)，因此上述選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記利于遺傳多樣性分析，為品種鑒定奠定基礎(chǔ)。

3.3 聚類(lèi)分析

遺傳距離是體現(xiàn)各品種間遺傳差異程度的重要指標(biāo)。本研究基于Da遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看，金定鴨、紹興鴨和荊江鴨聚為一類(lèi)，可能是因?yàn)榻鸲喪歉＝ǖ胤进喥贩N、紹興鴨為浙江地方鴨品種，荊江鴨則因?yàn)檫@三個(gè)地方地理位置較近，過(guò)去可能發(fā)生過(guò)基因交流。山麻鴨與麻旺鴨聚為一類(lèi)，攸縣麻鴨與三穗鴨聚為一類(lèi)。

3.4 品種鑒別

傳統(tǒng)品種鑒定是根據(jù)動(dòng)物的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)等特征來(lái)鑒定。分子標(biāo)記是根據(jù)蛋白質(zhì)、核酸分子的變異，檢測(cè)遺傳結(jié)構(gòu)及其變異直接反映了DNA水平上遺傳變異，這種標(biāo)記數(shù)量很多，分布整個(gè)基因組，不受環(huán)境和基因表達(dá)的影響，分子標(biāo)記常用于畜禽品種鑒定，而微衛(wèi)星標(biāo)記是分子標(biāo)記的一種常用方法[3]。中國(guó)豬品種志中寫(xiě)到，遺傳穩(wěn)定性是品種必須具備的，所以品種鑒定必須基于基因型特征[17]。試驗(yàn)將這種方法，運(yùn)用到攸縣麻鴨、三穗鴨、金定鴨、麻旺鴨、紹興鴨、荊江麻鴨、山麻鴨的鑒定中。選擇的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在7個(gè)鴨品種中都具有共有基因型，但是由于一些微衛(wèi)星標(biāo)記在不同品種間的等位基因頻率具有明顯差異，因此可以用這些標(biāo)記對(duì)各品種區(qū)分。文中利用不同的基因型頻率繪制的柱狀圖可以明顯的看出這7個(gè)品種各不相同可以很好的鑒別這7個(gè)品種。