李小芳, 馮小強, 朱元成, 王彥博

(天水師范學(xué)院 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院, 甘肅 天水 741001)

通過調(diào)控中心金屬離子和配體可合成結(jié)構(gòu)多樣的功能配合物. 金屬配合物結(jié)構(gòu)新穎、 性能優(yōu)異[1-2], 在磁性、 熒光、 催化、 生物化學(xué)和生物制藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛. 由于配合物與脫氧核糖核酸(DNA)間的嵌插作用對抗癌、 防癌藥物發(fā)揮藥效影響較大[3], 因此, 研究DNA與配合物間的相互作用, 對定向設(shè)計及構(gòu)筑新型抗癌藥物有重要意義.

銅是機體必需的微量元素, 具有重要的生理作用[4], 銅配合物具有抗糖尿病、 抗誘變劑、 抗?jié)兒涂拱┳饔茫?莫慧雯等[5]合成了以 5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑為主配體的銅(Ⅱ)混配配合物[Cu(HPBM)(Gly)(H2O)]ClO4·0.5H2O(HPBM=5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑, Gly=甘氨酸根), 通過溝槽結(jié)合方式與DNA結(jié)合及線粒體功能失調(diào)途徑誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡, 對癌細(xì)胞Eca-109,HeLa和A549具有顯著的抑制作用(IC50<10 μmol/L)， 配合物與DNA間存在較強的嵌插作用, 且強于配體間的相互作用[5]; Lü等[6]合成了配合物[Cu(L)Br]·DMF, [Cu(L)Cl]·2H2O和[Cu2(L)2(SO4)]·H2O·CH3OH(HL為3-乙基-2-乙酰吡嗪縮4-甲基氨基硫脲), 研究表明， 配合物與DNA強于配體間的相互作用； 嚴(yán)世承等[7]研究表明， 以4-甲基-1,2,3-噻二唑-5-甲酸與氯化銅合成的配合物[CuNa(L)3]n屬于三斜晶系, Cu2+的配位數(shù)為4, 構(gòu)成一個變形的平面四邊形結(jié)構(gòu), Na+的配位數(shù)為6, 構(gòu)成一個略變形的八面體結(jié)構(gòu), 最終形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 何大青等[8]以5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺和芹菜素為配體合成了銅配合物, 研究表明, 當(dāng)不加還原劑時, 配合物呈核酸酶的特性, 對DNA有明顯的切割作用； 寇瑩瑩等[9]合成了單核銅配合物[Cu(L)(5-Cl-sal)(DMF)] ClO4·DMF(5-Cl-Hsal=5-氯-水楊醛), 配合物以嵌插作用與CT-DNA結(jié)合, 配合物在H2O2存在下可將pBR322質(zhì)粒DNA切割為開環(huán)缺口型 DNA和線型DNA, 配合物濃度越大切割效果越好.

氨基酸作為一種重要的生理活性物質(zhì), 具有較好的生物兼容性及抗氧化和抗腫瘤等活性, 作為配體可提高配合物的生物活性并改善配合物在溶液中的溶解性, 從而提高其生物利用率, 降低其毒副作用[10]. 由于磺基水楊酸(5-sulfosalicylic acid, SSA)的水溶性較好、 穩(wěn)定、 無毒, 對過渡金屬和重金屬離子具有較強的配合能力, 在醫(yī)藥中間體、 染料工業(yè)、 有機合成工業(yè)、 制造表面活性劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛, 因此， 本文以精氨酸(L-Arg)和磺基水楊酸為配體制備Cu(Ⅱ)配合物Cu2(L-Arg)2(SSA)(H2O)2(L-Arg=精氨酸, SSA=磺基水楊酸), 并用電化學(xué)法、 光譜法和黏度法研究配合物與DNA間的相互作用.

1 實 驗

1.1 藥品和儀器

磺基水楊酸(天津市化學(xué)試劑二廠); 精氨酸(上海伯奧公司); 鯡魚精DNA(美國Sigma公司), 用Tris-HCl/NaCl緩沖溶液配制, 配制后溶液的A260/A280=1.85, 表明溶液中基本不含蛋白質(zhì), 且濃度以ε260=6 600 L/(mol·cm)確定, 溶液置于4 ℃冰箱保存.

CHI660B型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)； UV-2450型紫外可見光譜儀(日本島津有限公司)； Spectrum One型Fourier紅外光譜儀(美國Perkin Elmere儀器有限公司).

1.2 配合物的制備

將0.5 mmol的CuCl2·2H2O和0.5 mmol的磺基水楊酸溶于20 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇中, 在50 ℃水浴加熱攪拌下, 將已中和的0.5 mmol精氨酸水溶液加入上述溶液中, 調(diào)節(jié)溶液 pH=4.0～5.0, 繼續(xù)加熱攪拌30 min. 反應(yīng)結(jié)束后, 將反應(yīng)液冷卻， 靜置過夜, 過濾沉淀, 并用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇洗滌3次, 于60 ℃烘干保存, 得到Cu2(L-Arg)2(SSA)(H2O)2配合物.

1.3 配合物與DNA間的作用方式

用紫外吸收光譜法、 循環(huán)伏安法和黏度法研究配合物與DNA間的作用方式, 其實驗方法參見文獻(xiàn)[11-12].

2 結(jié)果與討論

2.1 表 征

SSA,L-Arg和配合物的紅外光譜數(shù)據(jù)列于表1. 由表1可見: 配體SSA在1 671 cm-1處出現(xiàn)羧羰基的特征峰, 在形成配合物后消失; 配合物在1 329,1 596 cm-1處出現(xiàn)羧酸根的對稱和反對稱吸收峰, 二者的峰位相差267 cm-1, 表明SSA中的羧基與Cu2+以單齒形式配位[13]； SSA在1 282 cm-1處的吸收峰歸屬于Ar—OH伸縮振動峰, 在形成配合物后未發(fā)生變化, 表明酚羥基中的氧原子未參與配位； 氨基酸配體L-Arg在908 cm-1處的吸收峰歸屬于O—H伸縮振動吸收峰, 在形成配合物后消失, 表明L-Arg中氧原子參與配位； 配合物在424,502 cm-1處出現(xiàn)新吸收峰, 可歸屬于Cu—O的吸收峰.

表1 SSA,L-Arg和配合物的紅外光譜數(shù)據(jù)(cm-1)

以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為配合物的溶劑, SSA,L-Arg和配合物的紫外光譜如圖1所示. 由圖1可見： SSA的紫外光譜有兩處吸收峰, 其中λmax1=256 nm處歸屬于π-π*躍遷,λmax2=317 nm處歸屬于n-π*躍遷；L-Arg在225 nm處的吸收峰歸屬于π-π*躍遷； 當(dāng)SSA,L-Arg和Cu2+發(fā)生配位后, 在257,301 nm處出現(xiàn)兩個吸收峰譜帶, 其中配合物在257 nm處譜帶相對于配體的峰位均發(fā)生了移動, 且吸光強度增大, 表明配合物的共面性及π鍵共軛程度增大, 體系能量降低, 配合物在301 nm處譜帶相對于SSA的λmax2發(fā)生藍(lán)移, 但吸光強度減小, 表明形成配合物后, 以配體的π-π*躍遷為主[14].

測定濃度為1×10-3mol/L配合物溶液在25 ℃時的摩爾電導(dǎo)率為10.8(s·cm2)/mol, 確定配合物在DMF中以中性分子存在[15]. 用乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法測定Cu2+的濃度, 并結(jié)合元素分析、 紅外光譜和紫外光譜數(shù)據(jù)確定配合物的分子式為Cu2(L-Arg)2(SSA)(H2O)2(L-Arg=精氨酸, SSA=磺基水楊酸), 其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示.

圖1 SSA,L-Arg和配合物的紫外光譜

圖2 配合物的分子結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 配合物與鯡魚精DNA的相互作用

a～h: 描速率分別為0.1,0.2,0.4,0.5,0.7,0.8,0.9,1.0 V/s.

2.2.1 電化學(xué)法 不同掃描速率下配合物的循環(huán)伏安曲線及Ip和υ1/2的變化關(guān)系如圖3所示. 由圖3(A)可見： 當(dāng)掃描速率為0.1 V/s時, 配合物在0.124 8,-0.518 9 V處出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰, 式量電位為-0.197 1 V, 峰電位差ΔEp=0.643 7 V, 氧化還原峰的峰電流分別為2.677 8×10-5,-3.122×10-5A; 配合物的氧化還原峰電位隨掃描速率變化而變化, 峰電流隨掃描速率的增大而逐漸增大, 當(dāng)掃描速率為1.0 V/s時, 還原峰和氧化峰的峰位分別移至-0.751,0.239 V處, 對應(yīng)的峰電流分別增大至7.648×10-5,-1.514×10-4A. 由圖3(B)可見,Ip和υ1/2呈良好的線性關(guān)系, 其線性方程為

Ipa(10-5A)=0.35 +7.29υ1/2，R=0.993 6；

Ipc(10-5A)=-1.34-14.32υ1/2，R=0.990 3.

表明配合物在玻碳電極上的反應(yīng)由擴散過程控制.

DNA加入前后配合物的循環(huán)伏安曲線如圖4所示. 由圖4可見： 當(dāng)掃描速率為1.0 V/s時, 配合物在0.125,-0.603 V處出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰, 式量電位為-0.239 V； 當(dāng)DNA和配合物的濃度比為0.5時, 配合物氧化還原峰的峰位分別位于0.151,-0.501 V處, 式量電位為-0.175 V, 即配合物的式量電位較加入DNA前正移了64 mV. 若配合物與DNA間存在嵌插作用, 則配合物的式量電位發(fā)生正移[16]. 因此, 根據(jù)DNA加入前后配合物的循環(huán)伏安曲線可知, 配合物與DNA以嵌插作用結(jié)合.

為進(jìn)一步驗證循環(huán)伏安法的結(jié)論, 用差分脈沖伏安法研究配合物與鯡魚精DNA間的作用方式, 結(jié)果如圖5所示. 由圖5可見： 配合物在0.034 V處的峰電流為-6.3×10-6A, 當(dāng)R(c(DNA)/c(配合物))=1.0時, 峰電流降至-2.95×10-6A, 峰電位正移至0.12 V處; 在配合物中滴加DNA后, 配合物的峰電流降低, 峰電位逐漸正移, 與循環(huán)伏安法所得結(jié)論一致, 且峰電流降低程度及峰電位正移趨勢與DNA加入呈正相關(guān).

a: DNA加入前; b: DNA加入后.

a～e： R=0,1/5,1/3,1/2,1.

2.2.2 紫外吸收光譜 先在空白池和樣品池中分別加入3 mL Tris-HCl/NaCl緩沖溶液和50 μmol/L配合物溶液, 在波長為200～350 nm內(nèi)掃描吸收光譜, 再依次向空白池和樣品池中分別加入不同體積的2 mmol/L DNA溶液, 靜置5 min后掃描紫外吸收光譜, 結(jié)果如圖6所示. 由圖6可見, 配合物的紫外吸收光譜在滴加DNA后變化較大, 當(dāng)配合物中滴加140 μL DNA后, 在257 nm處的吸收峰位移至248 nm處, 強度降低58.6%, 在301 nm處的吸收峰未發(fā)生移動, 但吸收強度降低36%. 若小分子與DNA間存在嵌插作用, 則小分子的吸收峰峰位發(fā)生紅移, 吸收強度降低[17]. 因此, 根據(jù)DNA加入后配合物的紫外吸收光譜可知, 配合物與DNA間存在相互作用.

a～h: 加入DNA的體積分別為0,20,40,60,80,100,120,140 μL.

圖7 配合物濃度對DNA黏度的影響

2.2.3 黏度法 配合物濃度對DNA黏度的影響如圖7所示. 由圖7可見, DNA溶液的黏度隨配合物濃度的增大而增大. 這是由于配合物嵌插到DNA分子內(nèi)部, 使DNA分子鏈不斷增長, 導(dǎo)致DNA的黏度增大所致, 與文獻(xiàn)[18]結(jié)果相符.

綜上所述, 本文首先合成并表征了配合物Cu2(L-Arg)2(SSA)(H2O)2(L-Arg=精氨酸, SSA=磺基水楊酸), 然后研究了該配合物與鯡魚精DNA間的相互作用. 實驗結(jié)果表明： 當(dāng)掃描速率為0.1 V/s時, 配合物在0.124 8,-0.518 9 V處出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰, 式量電位為-0.197 1 V, 配合物在玻碳電極上的反應(yīng)由擴散過程控制； 在加入DNA后, 配合物的氧化還原峰電流逐漸降低, 式量電位呈增大趨勢, 配合物的吸收峰峰位發(fā)生位移, 吸收強度下降； DNA的黏度隨配合物濃度的增大而增大. 因此, 配合物Cu2(L-Arg)2(SSA)(H2O)2與鯡魚精DNA間存在嵌插作用.