田惠博, 張 強, 閆 巖, 趙淑華, 王麗麗, 王 欣， 孫德燁

(1. 長春大學 理學院, 長春 130022； 2. 吉林大學 材料科學與工程學院, 長春 130012；3. 吉林大學 公共衛(wèi)生學院, 長春 130021)

石墨烯材料泛指石墨烯及其衍生物, 如氧化石墨烯(GO)與還原氧化石墨烯(rGO)等, 其具有較多的優(yōu)異性能, 在能源儲存、 生物醫(yī)藥及電子傳感等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-3], 其中石墨烯材料的抗菌特性已引起人們廣泛關(guān)注. Hu等[4]研究表明, 采用真空抽濾方法制備的紙狀GO和rGO膜可通過破壞細菌細胞膜的方式消除大腸桿菌, 具有優(yōu)異的抗菌活性. 采用真空抽濾方法制備石墨烯基膜材料, 可通過改變GO膠體用量實現(xiàn)對膜厚度的調(diào)控, 但基底應(yīng)采用特殊的濾紙材料. 研究表明, 石墨烯基涂層可作為一種新型材料應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[5].

在氧化石墨烯片層上有豐富的含氧官能團, 并具有石墨烯的層狀結(jié)構(gòu), 其中羰基和羧基主要位于GO邊緣, 環(huán)氧基和羥基主要分布在GO片表面[6-7]. 由于GO具有較高的比表面積, 同時在片層邊緣和表面有豐富的含氧官能團, 因此可作為模塊, 通過層層自組裝方式形成石墨烯基膜, 其良好的生物相容性可有效擔載第二相, 易形成多元復(fù)合材料, 充分發(fā)揮各組元的協(xié)同作用. GO與銀納米粒子(AgNPs)復(fù)合, 可減少金屬銀的用量, 降低AgNPs在生物體內(nèi)產(chǎn)生的毒副作用, 并可抑制銀納米粒子發(fā)生團聚和氧化現(xiàn)象, 從而增強AgNPs的抗菌活性. He等[8]用液-液兩相法將AgNPs復(fù)合在石墨烯納米片表面, 獲得了銀-石墨烯雜化體系, 該復(fù)合物在有機相中具有穩(wěn)定的分散性； 在復(fù)合過程中, AgNPs對石墨烯片層分散具有促進作用[9]； Cai等[10]研究表明, 納米銀/氧化石墨烯復(fù)合材料可降低AgNPs的釋放速率, 從而使銀/石墨烯復(fù)合材料的毒性較低, 且可在較長時間內(nèi)保持優(yōu)異的殺菌特性; Faria等[11]以GO為載體, 檸檬酸鈉為還原劑, 用原位還原方法還原AgNO3制備的銀/石墨烯復(fù)合材料, 抗菌測試表明, 該材料對大腸桿菌具有較高的抗菌活性； Fan等[12]通過加入交聯(lián)劑與葡萄糖還原方法, 合成了銀/石墨烯復(fù)合凝膠, 其作為傷口敷料具有較高的殺菌率, 并有助于傷口愈合. 基于細菌細胞內(nèi)外的復(fù)雜機制[13], 石墨烯負載銀納米粒子復(fù)合材料通過破壞細菌的外層結(jié)構(gòu)(如細胞膜和細胞壁)進入細胞, 影響細胞的新陳代謝和細胞繁殖, 從而殺死或抑制細菌繁殖和生長, 當細菌細胞失活后, 銀離子可從細菌中釋放, 繼續(xù)殺滅其他細菌的活性, 從而具有相對持久的抗菌作用.

目前, 制備銀/石墨烯復(fù)合材料的方法較多, 包括電化學沉積法[14]、 化學還原法[15]、 水熱法[16-19]和自組裝法[20]等, 在制備石墨烯基復(fù)合涂層過程中, 使用較多有毒的還原劑或在強堿條件下合成材料[21]. 用綠色化學方法合成復(fù)合抗菌材料或用天然物質(zhì)替代化學還原劑, 將有助于生物相容性材料的開發(fā)和生物應(yīng)用[22]. 本文在不添加分散劑、 黏結(jié)劑和有毒還原劑的條件下, 制備石墨烯基涂層, 并復(fù)合銀納米粒子, 制備具有抑菌和殺菌作用的石墨烯基抗菌復(fù)合膜. 該銀/石墨烯復(fù)合抗菌膜制備簡單易控、 成本較低, 有利于工業(yè)化生產(chǎn). 根據(jù)需要可設(shè)計不同厚度、 形狀和尺寸的復(fù)合膜, 這些復(fù)合膜在生物醫(yī)藥、 能源及航天航空等領(lǐng)域均具有廣闊的應(yīng)用前景.

1 實 驗

1.1 材 料

石墨粉(質(zhì)量分數(shù)為99.999 5%, 上海Afla Aesar有限責任公司), AgNO3(質(zhì)量分數(shù)為88.8%)、 NH3(分析純)、 H3PO4(優(yōu)級純)和C6H12O6·H2O(分析純)均購于北京國藥集團, 濃H2SO4(分析純)、 濃HNO3(分析純)、 濃HCI(分析純)、 NaOH(分析純)、 C2H6O(分析純)、 H2O2(體積分數(shù)為30%)、 CH3COCH3(分析純)和KMnO4(分析純)均購于北京化工廠.

1.2 儀 器

BS423S型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司); HC-3514型高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司); DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司); 080ST型超聲波清洗機(深圳市華策科技有限公司); BPZ-6123型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司); D8 Tools X型X射線衍射儀(德國Bruker公司); JSM-6335F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子公司); TECNAI G2 F20型透射電子顯微鏡(美國FEI公司); Frontier變換紅外線光譜儀(美國PerkinElmer公司); JJC-I型潤濕角測量儀(長春光學儀器廠).

1.3 氧化石墨烯的制備

先將360 mL濃H2SO4和40 mL濃H3PO4依次倒入錐形瓶內(nèi), 再加入3 g石墨粉, 充分攪拌后, 緩慢加入18 g KMnO4. 于50 ℃水浴中加熱12 h, 并快速攪拌, 隨水浴鍋冷卻至室溫后, 先將錐形瓶內(nèi)的溶液混合400 mL冰水, 再逐滴加入H2O2至無氣泡產(chǎn)生. 將產(chǎn)物高速離心, 去除上清液, 先用稀HCl(質(zhì)量分數(shù)為10%)離心酸洗3次沉淀物, 再用去離子水洗至中性, 得到一定質(zhì)量濃度的氧化石墨烯膠體, 待用. 在700 W的條件下, 將超純水稀釋配制的25 mL(2 mg/mL)氧化石墨烯膠體超聲攪拌30 min, 得到氧化石墨烯分散液.

1.4 銀/石墨烯復(fù)合抗菌膜的制備

稱取一定質(zhì)量的AgNO3粉末溶解于去離子水中, 將純氨水稀釋質(zhì)量分數(shù)為2%后, 緩慢滴加到AgNO3溶液中, 至溶液變無色, 得到銀氨溶液. 將銀氨溶液加入氧化石墨烯溶液中, 于60 ℃攪拌均勻后, 加入還原劑葡萄糖溶液, 常溫靜置90 min, 得到原位還原的Ag納米粒子. 按V(H2SO4)∶V(H3PO4)=4配制食人魚洗液, 將基底材料親水化處理后, 用去離子水反復(fù)沖洗. 將Ag/GO混合分散液滴涂到基底上, 真空干燥, 得到Ag/GO復(fù)合膜. 用等面積的載玻片覆蓋在干燥后的Ag/GO膜上, 真空下經(jīng)100 ℃低溫退火處理, 得到基于還原氧化石墨烯(rGO)的復(fù)合膜Ag/rGO.

1.5 表征與性能測試

用X射線衍射(XRD)測定膜樣品的相結(jié)構(gòu), 測試采用Cu靶,λ=0.154 nm, 掃速為2°/min, 掃描范圍為10°～80°； 用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察樣品的微觀形貌； 用Fourier變換紅外線光譜儀(FTIR)分析樣品的分子結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的官能團, 掃描分辨率為1 cm-1, 光譜范圍為500～4 000 cm-1； 用潤濕角測量儀測試膜樣品的表面親/疏水性, 滴液高度為3 mm, 液滴體積為3～5 μL, 直徑為1～2 mm； 用抑菌環(huán)法評估膜樣品的抗菌性能. 先將銀/石墨烯復(fù)合抗菌膜制成直徑為6 mm的圓片, 再置于菌液濃度為106～107cfu/mL(cfu定義為單位體積內(nèi)的細菌群落總數(shù))的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面上, 恒溫37 ℃培養(yǎng)12 h, 觀察并測量抑菌環(huán)直徑. 實驗重復(fù)3次以檢測樣品的抗菌性能.

2 結(jié)果與討論

2.1 涂層的形貌

圖1 Ag/GO膜(A)和Ag/rGO膜(B)的光學照片

復(fù)合膜的光學照片如圖1的示. 由圖1可見, 石墨烯基復(fù)合膜與玻璃基底緊密結(jié)合, 其附著性和鋪展性優(yōu)異, 未見氣泡和針孔, 成膜狀態(tài)良好, 有利于抗菌涂層的涂覆與應(yīng)用. Ag/GO膜的外觀為均一的棕黃色, 低溫退火后的復(fù)合膜呈黑色, 這是由于氧化時增加了石墨烯的層間距, 使氧化石墨烯顏色變淺所致.

Ag/rGO膜的形貌如圖2所示. 圖2(A)為rGO膜表面的SEM照片, 由圖2(A)可見, 石墨烯膜表面為典型的褶皺狀, 成膜顯示其連續(xù)性較好. 圖2(B)為Ag/rGO膜表面的SEM照片, 由圖2(B)可見, Ag納米粒子呈球狀, 均勻分散于石墨烯片層之間. 圖2 (C)和(D)為Ag/rGO膜表面的TEM照片, 可進一步觀測到GO片層上Ag納米粒子的性狀、 尺寸及分布. 統(tǒng)計結(jié)果表明, 納米粒子大小較均一, 粒徑約為20～50 nm, 未出現(xiàn)明顯的團聚現(xiàn)象, 納米顆粒在石墨烯膜褶皺處附著較多. 這是由于還原石墨烯褶皺處官能團數(shù)量較多, 可為復(fù)合Ag納米粒子提供更多的有效結(jié)合位點所致.

圖2 Ag/rGO膜的形貌

GO膜、 rGO膜、 Ag/GO膜和Ag/rGO膜的接觸角如圖3所示. 由圖3可見: 其接觸角分別為63.2°,93.7°,53.4°,85.6°; GO膜經(jīng)部分還原后所得rGO膜的接觸角從63.2°增加到93.7°, 這是由于還原后的GO膜表面含氧官能團減少, 使膜的親水性下降所致; 加入Ag納米粒子, GO和rGO膜的接觸角減小, 潤濕性增強, 分別高于其相應(yīng)的純相材料. 潤濕性增強有利于提高細菌和菌落與復(fù)合材料接觸時的附著性, 從而增強了復(fù)合材料的抗菌性能.

圖3 GO膜(A)、 rGO膜(B)、 Ag/GO膜(C)和Ag/rGO膜(D)的接觸角

2.2 涂層的結(jié)構(gòu)

Ag/GO和Ag/rGO膜的XRD譜如圖4所示. 由圖4可見, Ag的面心立方特征峰位于(111),(200),(220),(311)處, 表明Ag納米粒子已與氧化石墨烯和還原石墨烯納米片復(fù)合. 該合成方法可降低單獨用Ag納米粒子對人體的毒副作用, 且有助于提高Ag納米粒子的分散性及利用Ag納米粒子作為高效抗菌劑制備抗菌膜的優(yōu)點. Ag/GO膜在10.1°處出現(xiàn)GO的特征峰, 其邊緣攜帶的大量含氧官能團增加了片層間距, 可有效提高Ag納米粒子的分散性. 退火處理后的GO(002)峰強明顯下降, 但Ag粒子XRD的峰形、 峰強和峰位均無明顯變化, 表明低溫加熱還原處理未明顯改變Ag粒子的大小和含量.

圖4 Ag/GO和Ag/rGO膜樣品的XRD譜

圖5 Ag/GO和Ag/rGO膜的FTIR譜

2.3 涂層的抗菌活性

用金黃色葡萄球菌(S.aureus)和大腸桿菌(E.coli)評估GO,rGO,Ag/GO和Ag/rGO膜抗菌活性的光學照片如圖6所示, 其中培養(yǎng)基上的顆粒即為細菌菌落, 膜片周圍的無菌生長圓環(huán)即為抑菌環(huán), 抑菌環(huán)的大小可定性反映復(fù)合材料的抗菌效果.

圖6 GO,rGO,Ag/GO和Ag/rGO膜對金黃色葡萄球菌(S.aureus)及大腸桿菌(E.coli)的抗菌活性光學照片

由圖6可見： 在GO和rGO膜上均未出現(xiàn)抑菌環(huán), 但樣品表面沒有細菌繁殖； Ag/GO膜上出現(xiàn)明顯的抑菌環(huán), 低溫退火處理后的抑菌環(huán)增大, 分別由12.5 mm增加到15.3 mm(大腸桿菌)以及從12 mm增加到14 mm(金黃色葡萄球菌), 表明其抗菌活性增強. Ag/GO膜對金黃色葡萄球菌比大腸桿菌的抗菌活性差, 該結(jié)果與文獻[25]的結(jié)果一致. 這是由于Ag納米粒子的抗菌機制及陰性菌與陽性菌細胞膜差異有關(guān), Ag納米粒子對陰性菌的抗菌效果更明顯, 抗菌活性與Ag納米粒子的粒徑、 劑量/濃度和形狀等因素有關(guān)[26]. Morones等[27]研究了不同粒徑的Ag納米粒子的抗菌活性, 結(jié)果表明, Ag納米粒子粒徑越小抗菌性能越強. 這是由于粒徑小的Ag納米粒子具有更大的比表面積, 容易釋放更多具有殺菌性能的Ag+, 并可產(chǎn)生較多的活性氧自由基, 導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)加快細菌死亡. 此外, 粒徑小的Ag納米粒子更易進入細菌的細胞質(zhì), 降解破壞細菌的DNA, 從而殺死細菌[28]. Tang等[29]研究表明, 當氧化石墨烯與Ag納米粒子質(zhì)量比為1時, 復(fù)合材料的抗菌活性最強.

綜上, 本文用SEM,TEM,XRD,FTIR和潤濕角測量等方法對石墨烯基復(fù)合膜材料進行了表征. 測試結(jié)果表明： 制備的復(fù)合膜在滴膜干燥過程中可較好地平鋪于基底表面, 成膜質(zhì)量良好； Ag/GO和Ag/rGO膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較好的抗菌活性； 退火處理有助于提高Ag/GO復(fù)合膜的抗菌性能.