嚴(yán) 同，鐘曉衛(wèi)，傅徐泉，李華琦，劉宜東，黃曉飛

(成都市第三人民醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝病科，四川 成都 610031)

甲狀腺毒癥周期性癱瘓(thyrotoxic periodic paralysis, TPP)是甲狀腺毒癥的并發(fā)癥之一，臨床上以轉(zhuǎn)移性低鉀血癥、肌肉遲緩性癱瘓為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重者可累及呼吸肌威脅生命[1-3]。盡管多種原因?qū)е碌募谞钕俣景Y均可導(dǎo)致TPP，但導(dǎo)致本癥的最常見原因還是Graves病[1, 4-5]。與Graves病發(fā)病全球性的分布不同，TPP主要發(fā)生在亞洲人，包括：中國(guó)人、日本人、越南人、菲律賓人和韓國(guó)人[1-2, 6]。其他人群雖然也有TPP的病例報(bào)道，但發(fā)病較亞洲人罕見[7-8]。TPP的常見誘因包括：高碳水化合物攝入、劇烈運(yùn)動(dòng)、高鹽飲食、創(chuàng)傷、糖皮質(zhì)激素應(yīng)用和β-腎上腺能氣管擴(kuò)張劑使用[6]。

對(duì)于TPP的發(fā)病機(jī)制，目前比較清楚的是體內(nèi)總鉀不缺乏，是由于細(xì)胞外鉀轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)所致。目前認(rèn)為如下機(jī)制均可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性低鉀血癥：(1)甲狀腺激素通過作用于Na+-K+-ATP酶基因的甲狀腺素反應(yīng)元件(thyroid hormone response elements, TREs)上調(diào)該基因的表達(dá)，從而增加骨骼肌Na+-K+-ATP酶合成，這就導(dǎo)致細(xì)胞膜上有更多的Na+-K+-ATP酶；(2)甲狀腺激素通過激動(dòng)β2-腎上腺素能受體促進(jìn)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷酸(cAMP)生成從而增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶活性；(3)TPP發(fā)作期間有高胰島素血癥的現(xiàn)象，胰島素有促進(jìn)K+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和增加細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶密度的作用[9]。上述機(jī)制雖然能部分解釋甲狀腺毒癥時(shí)轉(zhuǎn)移性低鉀血癥的機(jī)制，但無法解釋為什么亞洲人群高發(fā)TPP這一人種發(fā)病不一致的現(xiàn)象。除了無甲狀腺毒癥以外，家族性低鉀性周期性癱瘓(familial hypokalemia periodic paralysis，F(xiàn)HPP)和TPP在臨床表現(xiàn)上有很多相似之處，故有學(xué)者推測(cè)TPP也屬于一種離子通道病。Ryan等[10]發(fā)現(xiàn)TPP患者存在編碼鉀通道Kir2.6的KCNJ18基因突變。和Na+-K+-ATP酶作用相反，Kir2.6有促進(jìn)K+外流的作用[9]，這就可以解釋盡管甲狀腺毒癥患者Na+-K+-ATP活性增強(qiáng)時(shí)盡管K+內(nèi)流增多，只要Kir2.6能同時(shí)保存適當(dāng)?shù)腒+外流，細(xì)胞外鉀的水平可以保持恒定，這似乎就可以解釋為什么不是所有的甲狀腺毒癥患者都發(fā)生TPP。但隨后國(guó)內(nèi)Li等[11]的研究發(fā)現(xiàn)僅有3.1%的TPP患者存在KCNJ18突變，這個(gè)現(xiàn)象說明除了Kir2.6以外，很可能還存在其他離子通道突變導(dǎo)致TPP的發(fā)生。

2012年，Jongjaroenprasert等[12]和Cheung等[13]先后利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)的手段發(fā)現(xiàn)KCNJ2基因下游非編碼序列rs312691單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是導(dǎo)致泰國(guó)和中國(guó)香港地區(qū)Graves病患者發(fā)生TPP的原因。rs312691位于KCNJ2基因下游150kb，該位點(diǎn)野生型的堿基為T，突變型為C。該位點(diǎn)堿基從野生型的T突變?yōu)镃，Graves病患者更容易發(fā)生TPP。為此，本研究通過meta分析，系統(tǒng)評(píng)價(jià)rs312691 SNP與TPP易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1檢索策略 檢索PubMed、Embase、萬方、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)，時(shí)間為建庫至2019年4月。英文檢索詞：rs312691, Graves disease, hyperthyroidism, hypokalemic periodic paralysis, thyrotoxic periodic paralysis, variant, mutation, polymorphism, single nucleotide polymorphism, SNP, KCNJ2。中文檢索詞：基因多態(tài)性、位點(diǎn)、低鉀性周期性癱瘓、甲狀腺毒癥性周期性癱瘓、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、Graves病。根據(jù)檢索到的參考文獻(xiàn)，追溯查到引文，盡量增加查全率。

1.2文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn) (1)截至2019年4月公開發(fā)表的關(guān)于rs312691 T>C多態(tài)性與TPP關(guān)聯(lián)性的病例對(duì)照研究；(2)病例組定義：發(fā)生TPP的Graves病或其他原因甲狀腺毒癥患者；對(duì)照組定義：沒有TPP發(fā)生史的Graves病或其他原因甲狀腺毒癥患者；(3)對(duì)于重復(fù)研究的文獻(xiàn)，本研究?jī)H選擇公開刊物已發(fā)表的涵蓋人數(shù)最全的1篇納入。

1.3文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn) (1)重復(fù)報(bào)道的文獻(xiàn)；(2)綜述類文獻(xiàn)；(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；(4)非病例對(duì)照研究；(5)原始數(shù)據(jù)不完整，不能直接獲取病例組和對(duì)照組的觀察例數(shù)及rs312691基因型(CC、CT、TT)在病例組及對(duì)照組的具體分布情況的研究，且也無法通過電子郵件聯(lián)系作者獲??；(6)非rs312691位點(diǎn)的研究。

1.4資料提取與質(zhì)量控制 檢索完成后，由2名研究者按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)對(duì)文獻(xiàn)摘要獨(dú)立篩選并提取數(shù)據(jù)資料，存在判斷分歧時(shí)由第3名研究者協(xié)助評(píng)價(jià)解決。對(duì)病例組和對(duì)照組分別進(jìn)行哈-溫遺傳平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢驗(yàn)。各納入文獻(xiàn)均采用Newcastle-Ottawa量表進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，≥5分為高質(zhì)量研究文獻(xiàn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究所用的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Stata 14.1進(jìn)行。執(zhí)行Q檢驗(yàn)評(píng)價(jià)研究間的異質(zhì)性，若P≥0.1，I2<50%采用固定效應(yīng)模型計(jì)算合并OR值及其95%可信區(qū)間，反之則采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并計(jì)算統(tǒng)計(jì)量，比較病例組和對(duì)照組rs312691等位基因和基因型的分布頻率。本研究分別針對(duì)如下5種基因模型分別進(jìn)行meta分析：(1)等位基因模型：C vs T；(2)隱性模型：CC vs CT+TT；(3)共顯性模型：CC vs TT；(4)顯性模型：CC+CT vs TT；(5)超顯性模型：CC+TT vs CT。采用Egger檢驗(yàn)和Begg檢驗(yàn)分析納入研究是否存在發(fā)表偏倚，Egger檢驗(yàn)和Begg檢驗(yàn)P>0.1認(rèn)為無發(fā)表偏倚。最后使用敏感性分析評(píng)估m(xù)eta分析結(jié)果的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1檢索結(jié)果及納入文獻(xiàn)的一般特征 共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)104篇，其中PubMed數(shù)據(jù)庫檢索到英文文獻(xiàn)41篇，Embase數(shù)據(jù)庫檢索到英文文獻(xiàn)46篇，萬方和CNKI數(shù)據(jù)庫檢索到中文文獻(xiàn)17篇。查重后得到文獻(xiàn)82篇，閱讀題目和摘要后排除67篇無關(guān)文獻(xiàn)，納入15篇文獻(xiàn)進(jìn)行全文閱讀，閱讀全文后排除8篇文獻(xiàn)(其中會(huì)議論文1篇，病例報(bào)道1篇，動(dòng)物研究1篇，其他位點(diǎn)的研究5篇)，最終納入7篇文獻(xiàn)進(jìn)行meta分析，見圖1。英文文獻(xiàn)6篇，中文文獻(xiàn)1篇。納入文獻(xiàn)來自亞洲的6篇(泰國(guó)1篇，中國(guó)香港2篇，中國(guó)內(nèi)地2篇，韓國(guó)1篇)，南美洲1篇(巴西)。所有對(duì)照組患者均來自醫(yī)院就診的病例。所有研究均闡明了甲狀腺毒癥(Graves病及其他原因)與TPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。除了Wang等[5]以外，其余研究均明確僅納入Graves 病的患者[11-16]，Wang等[5]研究納入了Graves病和多結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進(jìn)癥的患者，其中TPP組和對(duì)照組分別有32%和36%確診為Graves病，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cheung等[13]和Jongjaroenprasert等[12]采用DNA測(cè)序法確認(rèn)多態(tài)性，其他納入的研究均采用PCR法確認(rèn)多態(tài)性[5, 11, 14-16]。納入文獻(xiàn)經(jīng)Newcastle-Ottawa量表評(píng)分后高質(zhì)量研究6篇[11-16]，低質(zhì)量研究1篇[5]。

本研究共納入TPP組患者610例，對(duì)照組351例。各納入研究TPP組和對(duì)照組基因型分布見表1。按等位基因模型(OR=3.072，95%CI2.590-3.643，P<0.01)、隱性模型(OR=6.050，95%CI4.616-7.929，P<0.01)、共顯性模型(OR=10.585，95%CI7.150-15.670，P<0.01)、顯性模型(OR=4.005，95%CI2.874-5.580，P<0.01)和超顯性模型(OR=1.985，95%CI1.298-3.035，P=0.002)，合并OR值均顯示rs312691 T>C多態(tài)性是Graves病患者發(fā)生TPP的危險(xiǎn)因素，見表2。

2.2亞組分析結(jié)果 由于Li等[11]和Park等[16]研究納入對(duì)照組基因頻率不符合HWE，P值分別為0.0026和0.0076。進(jìn)一步根據(jù)對(duì)照組基因頻率是否符合HWE進(jìn)行分層分析。對(duì)照組符合HWE，meta分析結(jié)果顯示：等位基因模型OR=2.804(95%CI2.304-3.413，P<0.01)、隱性模型OR=4.969(95%CI3.658-6.750，P<0.01)、共顯性模型OR=9.348(95%CI6.045-14.456，P<0.001)、顯性模型OR=4.168(95%CI2.857-6.081，P<0.01)和超顯性模型OR=1.647(95%CI1.263-2.149，P<0.01)?？梢?，剔除對(duì)照組不符合HWE的研究后再次進(jìn)行meta分析仍然顯示，rs312691 T>C多態(tài)性是導(dǎo)致Graves病患者發(fā)生TPP的危險(xiǎn)因素。

表1 納入研究的基本特征

表2 rs312691多態(tài)性與甲狀腺毒癥周期性癱瘓關(guān)聯(lián)性的meta分析

TPP常見于亞洲男性，其他地區(qū)本病相對(duì)少見[1]。進(jìn)一步根據(jù)病例來自地區(qū)不同進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示：亞洲人群等位基因模型OR=3.117(95%CI2.613-3.717，P<0.01)、隱性模型OR=6.338(95%CI4.805-8.361，P<0.01)、共顯性模型OR=10.883(95%CI7.251-16.334，P<0.01)、顯性模型OR=3.915(95%CI2.771-5.532，P<0.01)和超顯性模型OR=2.276(95%CI1.793-2.890，P<0.01)。南美洲人群等位基因模型OR=2.471(95%CI1.248-4.891，P=0.009)、隱性模型OR=2.414(95%CI0.678-8.599，P=0.174)、共顯性模型OR=7.000(95%CI1.493-32.818，P=0.014)、顯性模型OR=5.829(95%CI1.641-17.042，P=0.005)和超顯性模型OR=0.486(95%CI0.188-1.258，P=0.137)?？梢?，亞洲患者所有遺傳模型meta分析差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但南美洲患者隱性模型和超顯性模型meta分析顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3發(fā)表偏倚與敏感性分析 Egger檢驗(yàn)P值介于0.303～0.822之間，Begg檢驗(yàn)P值介于0.293～0.881之間，可見納入的研究不存在發(fā)表偏倚，見表3。敏感性分析依次剔除納入研究后關(guān)聯(lián)性結(jié)論均不受影響，這顯示本研究的結(jié)果具有可靠性。

表3 各基因模型發(fā)表偏倚的Egger檢驗(yàn)和Begg檢驗(yàn)

3 討 論

本研究通過meta分析的方法探討了rs312691多態(tài)性和TPP發(fā)病之間的關(guān)系。結(jié)果顯示該位點(diǎn)堿基由T突變?yōu)镃會(huì)導(dǎo)致TPP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高2.072倍，若該位點(diǎn)兩個(gè)等位基因均突變(CC)，和野生型純合子(TT)相比，TPP風(fēng)險(xiǎn)升高9.585倍。其他基因模型也有相同的發(fā)現(xiàn)。可見rs312691多態(tài)性和TPP發(fā)病有關(guān)。

由于本研究納入的Li等[11]和Park等[16]研究對(duì)照組基因頻率不符合HWE，為了排除這兩項(xiàng)研究對(duì)meta分析結(jié)果的影響，排除這兩項(xiàng)研究后再次進(jìn)行meta分析仍然顯示rs312691多態(tài)性和TPP發(fā)病有相關(guān)性( 等位基因模型OR=2.804，95%CI2.304-3.413，P<0.001)。前面提到Wang等[5]的研究納入了Graves病和多結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進(jìn)癥的患者，其他納入meta分析的研究均僅納入了Graves病的患者[11-16]，為排除納入人群不一致對(duì)meta分析結(jié)果的可能影響，進(jìn)一步排除該研究的敏感性分析顯示等位基因模型OR=3.071(95%CI2.539-3.713，P<0.01)，這與排除前的合并結(jié)果基本一致(OR=3.072，95%CI2.590-3.643，P<0.01)?？梢娕懦齏ang等[5]的研究對(duì)meta分析結(jié)論無影響。既往有學(xué)者提出TPP是否發(fā)生與甲狀腺毒癥類型無關(guān)[5]，本研究進(jìn)行的敏感性分析也說明這一觀點(diǎn)，無論是Graves病還是多結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴甲亢導(dǎo)致的甲狀腺毒癥，只要出現(xiàn)rs312691位點(diǎn)由野生型的T突變?yōu)镃，就會(huì)導(dǎo)致TPP發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。由于TPP主要發(fā)生在亞洲人群，本研究的亞組分析顯示Melo等[15]針對(duì)巴西患者TPP發(fā)生危險(xiǎn)因素R 研究結(jié)果也和亞洲患者一致。綜合以上，經(jīng)過納入上述7項(xiàng)研究共961例患者的meta分析顯示rs312691多態(tài)性和TPP發(fā)生有關(guān)聯(lián)。

盡管meta分析顯示rs312691和TPP的發(fā)病有關(guān)，但是由于該位點(diǎn)本身位于17q24.3的非編碼區(qū)[13]，該位點(diǎn)很可能是通過間接途徑而不是直接影響K+細(xì)胞內(nèi)外平衡導(dǎo)致TPP發(fā)生。rs312691位于KCNJ2基因(編碼鉀通道Kir2.1)下游150kb和KCNJ16基因(編碼鉀通道Kir5.1)下游195 kb[13]，故推測(cè)rs312691可能通過調(diào)控上述基因表達(dá)促發(fā)TPP的發(fā)生。KCNJ16編碼的Kir5.1主要在腎臟、胰腺和甲狀腺表達(dá)，主要作用為調(diào)節(jié)液體和pH平衡[17]，故KCNJ16和TPP發(fā)生關(guān)系不大。與KCNJ16不同，編碼Kir2.1的KCNJ2基因在骨骼肌和心肌有表達(dá)[18]，該基因的功能失活突變(loss-of-function mutation)會(huì)導(dǎo)致1型Andersen-Tawil綜合征(Andersen-Tawil syndrome，ATS)[19]。1型ATS一個(gè)特征性表現(xiàn)就是發(fā)作性的周期性癱瘓和肌無力，且多數(shù)情況下在癥狀發(fā)生時(shí)會(huì)伴隨低鉀血癥，運(yùn)動(dòng)為發(fā)作的常見誘因[19]，1型ATS的這些特征和TPP的臨床表現(xiàn)非常類似。簡(jiǎn)要來講，1型ATS上述癥狀發(fā)生的機(jī)制為Kir2.1表達(dá)下降導(dǎo)致的K+外流受限，結(jié)果就是K+在細(xì)胞內(nèi)蓄積從而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性低鉀血癥和癱瘓。上述證據(jù)顯示rs312691很可能是通過調(diào)控KCNJ2基因而不是KNCJ16基因促進(jìn)TPP的發(fā)生。Li等[11]對(duì)中國(guó)大陸TPP患者進(jìn)行研究無一例患者存在KCNJ2基因突變，這也說明盡管TPP和1型ATS有類似的臨床表現(xiàn)，但TPP患者發(fā)病并不是因?yàn)镵CNJ2基因本身所致。

Meta分析可以說明rs312691多態(tài)性和TPP的發(fā)生有關(guān)，但卻無法解釋為何該突變位點(diǎn)攜帶者只在甲狀腺毒癥期間才會(huì)發(fā)生TPP，甲狀腺毒癥一旦解除，即使是突變位點(diǎn)攜帶者患者也不會(huì)再次出現(xiàn)TPP，這是TPP和1型ATS臨床表現(xiàn)的區(qū)別之處。對(duì)于這一現(xiàn)象的原因，學(xué)界推測(cè)可能是rs312691對(duì)KCNJ2基因調(diào)控作用需要在血液中甲狀腺激素濃度升高的情況下才能體現(xiàn)出來[13]。為了驗(yàn)證這一假說，Melo等[15]研究觀察到rs312691位點(diǎn)TC雜合子患者在TPP發(fā)作期間有長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long intergenic noncoding RNA，lincRNA)CTD-2378E21.1、反義KCNJ2基因(antisense KCNJ2，AS-KCNJ2)表達(dá)升高和KCNJ2表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象；另一方面，rs312691位點(diǎn)TC雜合子患者甲狀腺毒癥恢復(fù)以后lincRNA CTD-2378E21.1以及AS-KCNJ2又與rs312691位點(diǎn)TT純合子患者表達(dá)水平一致。在排除KCNJ2基因突變的情況下，Song等[20]一項(xiàng)針對(duì)臺(tái)灣TPP患者的研究也顯示lincRNA CTD-2378E21.1和KCNJ2基因表達(dá)有負(fù)相關(guān)的關(guān)系。上述證據(jù)顯示在甲狀腺激素水平升高的情況下，rs312691位點(diǎn)一旦由野生型的T突變?yōu)镃，lincRNA CTD-2378E21.1和AS-KCNJ2基因上調(diào)會(huì)導(dǎo)致KCNJ2基因下調(diào)，從而導(dǎo)致Kir2.1表達(dá)下降，影響K+外流。前面已經(jīng)提到，甲狀腺毒癥本身由于Na+-K+-ATP酶活性增加，會(huì)有K+內(nèi)流增多的現(xiàn)象。綜合以上，在體內(nèi)甲狀腺素增多的情況下，rs312691位點(diǎn)突變型的甲狀腺毒癥患者不僅存在K+流入增多，還存在K+流出減少，兩方面的綜合影響下，就會(huì)導(dǎo)致低鉀血癥和癱瘓的出現(xiàn)。甲狀腺毒癥一旦緩解，上述對(duì)K+影響的因素被去除，從而不再出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性低鉀血癥和癱瘓。

亞洲人群有更高的發(fā)生TPP的風(fēng)險(xiǎn)，既往數(shù)據(jù)顯示中國(guó)男性甲狀腺毒癥患者發(fā)生TPP的比例高達(dá)13%，女性也有0.17%[1]。本研究顯示rs312691位點(diǎn)堿基由T突變?yōu)镃會(huì)導(dǎo)致TPP風(fēng)險(xiǎn)升高，以目前的分子生物學(xué)技術(shù)水平，rs312691突變檢測(cè)結(jié)果已經(jīng)可以非?？焖俚牡玫絒5]。因此，對(duì)于國(guó)內(nèi)甲狀腺毒癥患者，尤其是男性Graves病患者進(jìn)行rs312691多態(tài)性檢測(cè)有助于提前發(fā)現(xiàn)TPP高風(fēng)險(xiǎn)人群，對(duì)于篩查該位點(diǎn)C基因型攜帶者進(jìn)行針對(duì)性的預(yù)防和患者教育可能會(huì)有助于避免發(fā)生TPP。

由于既往TPP的病例多發(fā)生在亞洲地區(qū)，其他地區(qū)納入人群較少，如果有更多人群該位點(diǎn)多態(tài)性的數(shù)據(jù)，就能夠知道該位點(diǎn)在不同人群中的變異是否有差異。此外，本次meta分析納入的研究都是病例對(duì)照研究，未來如果能對(duì)Graves病或其他原因甲狀腺毒癥攜帶rs312691位點(diǎn)突變和野生型的患者進(jìn)行前瞻性的隨訪，比較兩組發(fā)生TPP的差異，這樣的研究就能更進(jìn)一步提高結(jié)論的說服力。

總之，本研究顯示rs312691位點(diǎn)的堿基由野生型T突變?yōu)镃以后會(huì)導(dǎo)致甲狀腺毒癥患者發(fā)生TPP風(fēng)險(xiǎn)升高。其機(jī)制可能為在過多甲狀腺激素存在的情況下，該位點(diǎn)能上調(diào)lincRNA CTD-2378E21.1和AS-KCNJ2的表達(dá)，下調(diào)KCNJ2的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜鉀通道Kir2.1減少，K+外流減少。上述機(jī)制與甲狀腺毒癥伴隨存在的Na+-K+-ATP酶活性增強(qiáng)所導(dǎo)致K+內(nèi)流增加共同作用的結(jié)果就是細(xì)胞外K+水平下降和TPP的發(fā)生。