陳旺　鄧榆　殷俊　官州　金凱　石博妹　黃廷華　姚敏

摘要：【目的】明確豬miR-124與其靶基因IQGAP2間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，以及miR-124表達(dá)水平與豬巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌數(shù)量的關(guān)聯(lián)，為揭示沙門氏菌在感染細(xì)胞內(nèi)存活與增殖的機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-124與IQGAP2基因的作用位點(diǎn);再以GM-CSF誘導(dǎo)的豬巨噬細(xì)胞和鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）為試驗(yàn)材料，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)測定沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞中miR-124和IQGAP2基因的表達(dá)及巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌的增殖情況。【結(jié)果】miR-124結(jié)合位點(diǎn)野生型載體轉(zhuǎn)染的熒光報(bào)告信號(hào)顯著低于miR-124結(jié)合位點(diǎn)突變載體（P<0.05，下同），但共轉(zhuǎn)染anti-miR-124序列后能顯著增強(qiáng)miR-124結(jié)合位點(diǎn)野生型載體的熒光報(bào)告信號(hào)。經(jīng)沙門氏菌感染后，豬巨噬細(xì)胞中的miR-124表達(dá)被激活，感染12、24和48 h后的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于沙門氏菌感染前（0 h），而IQGAP2基因表達(dá)水平呈顯著下調(diào)趨勢;在沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞內(nèi)，miR-124表達(dá)水平與IQGAP2基因表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.92）。miR-124高表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量顯著高于正常巨噬細(xì)胞，但miR-124敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量顯著低于正常巨噬細(xì)胞;IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量顯著高于正常巨噬細(xì)胞;此外，miR-124高表達(dá)+IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量與IQGAP2基因敲低表達(dá)處理組相比無顯著差異（P>0.05），但顯著高于miR-124高表達(dá)組細(xì)胞。【結(jié)論】沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞中的miR-124表達(dá)水平與IQGAP2基因表達(dá)水平及胞內(nèi)沙門氏菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，即沙門氏菌可通過上調(diào)miR-124表達(dá)靶向抑制IQGAP2基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)其在豬巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖。

關(guān)鍵詞： 豬沙門氏菌;miR-124;IQGAP2基因;胞內(nèi)增殖;流式細(xì)胞術(shù);熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)

中圖分類號(hào)： S852.61? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）12-3066-07

Abstract：【Objective】To explore the regulation relationship between miR-124 and its target gene IQGAP2， study the relationship between the expression level of miR-124 and the number of Salmonella in pig macrophages，so as to provide a theoretical basis for revealing the mechanism of survival and proliferation of Salmonella in infected cells. 【Method】The binding sitebetween miR-124 and IQGAP2 was verified by luciferase reporter gene system assay. Then， the GM-CSF induced macrophages and Salmonella typhimurium（ATCC 14028） were used as research materials. The expression of miR-124 and IQGAP2 gene and the proliferation of Salmonella in macrophages were determined by real-time quantitative PCR and flow cytometry. 【Result】The fluorescence signal of wild-type vector transfected by miR-124 binding site was significantly lower than that of miR-124 binding site mutant vector（P<0.05， the same below）， and the co-transfection of anti-miR-124 sequence could significantly enhance the fluorescence signal of wild-type vector. In the process of Salmonella infection， the expression of miR-124 was activated，the relative expression levels at 12， 24 and 48 h after infection were significantly higher than those before infection （0 h）. The expression of IQGAP2 was significantly down-regulated. In Salmonella infected macrophages， the expression levels of miR-124 were negatively correlated with IQGAP2 （r=-0.92）. The Salmonella counts in miR-124 high expression group were significantly higher than the control. The Salmonella counts in miR-124 knock down group were significantly lower than the control macrophages. The Salmonella counts in miR-124 knock-down group were significantly higher than the control macrophagesgroup. The numberof Salmonella counts in miR-124 high expression+IQGAP2 gene knockdown expression group were not significantly different compared to the IQGAP2 knockdown group（P>0.05）， but significantly higher than the miR-124 high expression group cells. 【Conclusion】The expression levels of miR-124 and IQGAP2 in Salmonella infected porcine macrophages are negatively correlated with intercellular Salmonella counts. Salmonella inhibits IQGAP2 gene expression by up-regulating miR-124 expression targeting， thereby regulating its proliferation in porcine macrophages.

Key words： porcine Salmonella; miR-124; IQGAP2 gene; intracellular proliferation; flow cytometry; luciferase reporter gene system

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31902231，31402055）; Innovation and Entrepreneurship Program of Yangtze University （2018057）

0 引言

【研究意義】沙門氏菌（Salmonella）感染豬群后通常形成急性一過性反應(yīng)和長期攜帶2種狀態(tài)（Alban and St?rk，2005;Bonardi，2017），即攜帶沙門氏菌生豬是沙門氏菌傳播感染的重要媒介（Guan and Holley，2003;李帆等，2018）。沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原菌（施開創(chuàng)等，2018），在我國的動(dòng)物源性食物中毒事件中有70%～80%是由沙門氏菌污染豬肉產(chǎn)品而引起（楊懷珍等，2016）;沙門氏菌在感染細(xì)胞（主要為吞噬細(xì)胞）內(nèi)存活并實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)增殖是其形成長期攜帶及傳播致病的重要原因（Lathrop et al.，2015）。因此，研究沙門氏菌在感染細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖發(fā)生機(jī)理及揭示相關(guān)基因在該過程中的調(diào)控作用，可為豬沙門氏菌感染的抗病育種提供分子標(biāo)記，對(duì)防控生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)中的沙門氏菌感染具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】本課題組前期通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，在沙門氏菌感染仔豬外周血中miR-124、miR-16、miR-155和miR-143等29個(gè)miRNA呈顯著差異表達(dá)，其中miR-124在沙門氏菌感染仔豬外周血中呈顯著上調(diào)表達(dá)（5.86倍）（Huang et al.，2019），暗示miR-124是沙門氏菌感染過程中的重要調(diào)節(jié)因子。miR-124在免疫器官和免疫細(xì)胞，如外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)和胸腺組織中高表達(dá)，故推測其廣泛參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)過程（Smerkova et al.，2015）。miR-124可被脂多糖（LPS）和牛分枝桿菌卡介苗誘導(dǎo)，其轉(zhuǎn)錄水平受TLR信號(hào)適配分子MyD88調(diào)控（Mehta and Baltimore，2016;Sun et al.，2016）。激活后的miR-124通過阻礙TLR6、MyD88、TNF-α、USP2、USP14、P65、TRAF6及STAT3而反作用于（抑制）TLR信號(hào)通路（Sun et al.，2013;Ma et al.，2014;Qiu et al.，2015），其在基因組中存在多個(gè)拷貝，分別為miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3，雖然三者的前體序列有所不同，但其成熟序列在人類、小鼠和豬中完全一致，說明miR-124在不同物種體內(nèi)發(fā)揮著相同的生物學(xué)功能。沙門氏菌感染仔豬外周血miRNA/mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在miR-124作用的110個(gè)候選靶基因中，沙門氏菌感染信號(hào)通路相關(guān)基因IQGAP2下調(diào)5倍，但同家族的IQGAP1和IQGAP3基因均未見顯著差異表達(dá)（Huang et al.，2019）。IQGAP2基因通過與CDC42-GTP相結(jié)合并調(diào)節(jié)CDC42的活化狀態(tài)（Brill et al.，1996），活化的CDC42進(jìn)一步激活MAPK信號(hào)通路（Chen et al.，1996;Hobbie et al.，1997;Patel and Galán，2006），進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主的免疫功能（Garrett et al.，2000;Rodriguez-Escudero et al.，2011;Lathrop et al.，2015）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】miR-124是沙門氏菌感染過程中的重要調(diào)節(jié)因子，是沙門氏菌在宿主體內(nèi)存活、建立攜帶狀態(tài)及感染致病的關(guān)鍵因素，但至今有關(guān)miR-124對(duì)下游靶基因IQGAP2的調(diào)節(jié)作用及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌增殖情況的影響機(jī)制尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)及熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)對(duì)沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞中miR-124和IQGAP2基因的表達(dá)及巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌的增殖情況進(jìn)行探討，為揭示沙門氏菌在感染細(xì)胞內(nèi)的存活與增殖機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

胎牛血清（10100154）和細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640（22400105）購自美國Gibco公司;哺乳動(dòng)物外周血單核細(xì)胞分離液Percoll（P1644）購自Sigma-Aldrich公司;重組豬GM-CSF（ab233683）購自英國Abcam公司;總RNA提取試劑盒（R1200）購自北京索萊寶科技有限公司;miR-124定量檢測試劑盒（480901_mir）購自美國ABI公司;兔抗人IQGAP2多克隆抗體（PA5-95484）和PE標(biāo)記的羊抗兔IgG（31864）購自ThermoFisher公司;FITC標(biāo)記的羊抗人CD14抗體（ABIN2478467）購自北京四正柏生物科技有限公司;動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑TransFastTM（E2431）購自美國Promega公司;IQGAP2基因siRNA序列、miR-124序列、anti-miR-124序列及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物（表1）均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成;psiCHECKTM-1、pGL3-Control、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）和Raw264.7細(xì)胞由長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1. 2 miR-124高表達(dá)或敲低表達(dá)巨噬細(xì)胞的建立

以無菌生理鹽水對(duì)仔豬外周抗凝血進(jìn)行1∶1稀釋，再使用哺乳動(dòng)物外周血單核細(xì)胞分離液Percoll分離外周血單核細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞6孔培養(yǎng)板中，經(jīng)貼壁、洗滌后，以GM-CSF（20 ng/mL）和IL-4（10 ng/mL）刺激培養(yǎng)6 d，以獲得充分分化的巨噬細(xì)胞。將IQGAP2 siRNA（10 nmol/L）、miR-124 mimics（10 nmol/L）和anti-miR-124（10 nmol/L）以TransFastTM轉(zhuǎn)染試劑包裹后分別轉(zhuǎn)染分化的巨噬細(xì)胞，傳染24 h后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞中IQGAP2基因和miR-124的轉(zhuǎn)錄水平，以證實(shí)各組細(xì)胞建模是否成功。將對(duì)數(shù)生長期的沙門氏菌與構(gòu)建的各組模型細(xì)胞按1∶1比例互作侵染，分別于感染0、12、24和48 h時(shí)收集細(xì)胞樣品用于提取總RNA，設(shè)3次重復(fù)。采用TRIzol法提取總RNA，利用Stem-Loop TaqMan檢測總RNA中的miR-124表達(dá)情況，以SYBR-Green PCR Master Mix試劑盒檢測總RNA中的IQGAP2基因表達(dá)水平。用4%甲醛重懸細(xì)胞并在室溫（20～25 ℃）下固定15 min，1×PBS離心洗滌。向預(yù)冷的細(xì)胞中緩慢加入預(yù)冷的100%甲醇，至甲醇終濃度為90%，溫和渦旋以通透細(xì)胞。BD-PharmingenTM染色緩沖液以抗CD14-FITC抗體進(jìn)行表面表型染色30 min，然后將通透處理的細(xì)胞重懸于BD PharmingenTM染色緩沖液中，加入anti-IQGAP2抗體，室溫下孵育20 min。以100 ?L稀釋的羊抗兔IgG偶聯(lián)PE二抗再次重懸細(xì)胞，并室溫孵育30 min，最后通過BD-LSRFortessaTM流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。每組細(xì)胞處理均設(shè)3次重復(fù)，流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)提交至流庫數(shù)據(jù)庫（Spidlen et al.，2012），編號(hào)FR-FCM-Z2FQ。

1. 3 胞內(nèi)沙門氏菌增殖模型

參考Huang等（2018，2019）的方法以沙門氏菌侵染巨噬細(xì)胞。正常巨噬細(xì)胞、miR-124高表達(dá)及敲低表達(dá)巨噬細(xì)胞、IQGAP2基因敲低表達(dá)巨噬細(xì)胞、miR-124高表達(dá)+IQGAP2基因敲低表達(dá)巨噬細(xì)胞及miR-124敲低表達(dá)+IQGAP2基因敲低表達(dá)巨噬細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌和重懸后，分別按1×106/孔的密度接種至細(xì)胞6孔培養(yǎng)板中，同時(shí)按1∶1比例將對(duì)數(shù)生長期的沙門氏菌接種至各組巨噬細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)板500 r/min離心10 min，使細(xì)胞和細(xì)菌聚集于培養(yǎng)底面，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，PBS漂洗3次，加入Gentamicin培養(yǎng)基（100 ?g/mL）繼續(xù)培養(yǎng)2 h，再使用無抗生素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后收集細(xì)胞樣品。自沙門氏菌與巨噬細(xì)胞互作時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別收集4、8和12 h時(shí)的細(xì)胞樣品，各3份。采用1% Tritone裂解破碎巨噬細(xì)胞，抽提DNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測沙門氏菌數(shù)量（Vinayaka et al.，2019）。

1. 4 雙螢光素酶報(bào)告分析

將含有miR-124結(jié)合位點(diǎn)（5189～5195 nt，XM_021084462）的IQGAP2基因3'-UTR序列（XM_0210 84462，4761～5860 nt）野生型或突變（5192C/G）片段克隆至psiCHECKTM-1載體質(zhì)粒海腎螢光素酶ORF下游，分別命名為psiCHECKTM-1-IQGAP2 3'-UTR（Wild-type）和psiCHECKTM-1-IQGAP2 3'-UTR（Mutant）。將RAW264.7細(xì)胞以每孔0.5×106個(gè)細(xì)胞接種至細(xì)胞6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)有60%細(xì)胞融合時(shí)采用TransFastTM轉(zhuǎn)染試劑包裹miR-124（或anti-miR-124）、psiCHECKTM-1-IQGAP2 3'-UTR（Wild-type）[或psiCHECKTM-1-IQGAP2 3'-UTR（Mutant）]，轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞。試驗(yàn)共設(shè)4組：（1）Mutant;（2）Mutant+miR-124;（3）Wilde type;（4）Wilde type+anti-miR-124。所有細(xì)胞均與轉(zhuǎn)染效率對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Control共轉(zhuǎn)染。每轉(zhuǎn)染4 h，即采用雙螢光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)測量螢光素酶活性1次（Huang et al.，2018）。每組重復(fù)3次。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中，兩組間比較采用 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 雙螢光素酶報(bào)告解析miR-124對(duì)IQGAP2基因的調(diào)控作用

將IQGAP2基因3'-UTR區(qū)插入熒光素酶基因3'-UTR區(qū)，構(gòu)建靶基因3'-UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因載體，以構(gòu)建好的熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞，通過檢測熒光素酶的表達(dá)情況分析IQGAP2基因3'-UTR區(qū)是否含有miR-124靶位點(diǎn);同時(shí)構(gòu)建miR-124結(jié)合位點(diǎn)人工點(diǎn)突變的報(bào)告基因載體。通過比較野生型和突變型報(bào)告基因的熒光素酶活性（圖1）發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染36～48 h后miR-124結(jié)合位點(diǎn)野生型載體轉(zhuǎn)染的熒光報(bào)告信號(hào)顯著低于miR-124結(jié)合位點(diǎn)突變載體（P<0.05，下同），但共轉(zhuǎn)染anti-miR-124序列后能顯著增強(qiáng)miR-124結(jié)合位點(diǎn)野生型載體的熒光報(bào)告信號(hào);miR-124結(jié)合位點(diǎn)突變載體轉(zhuǎn)染及anti-miR-124序列與miR-124結(jié)合位點(diǎn)突變載體共轉(zhuǎn)染均顯著增強(qiáng)報(bào)告基因表達(dá)，說明miR-124能作用于IQGAP2基因3'-UTR區(qū)而抑制報(bào)告基因表達(dá)。

2. 2 沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞中miR-124和IQGAP2基因的轉(zhuǎn)錄水平

經(jīng)沙門氏菌感染后，豬巨噬細(xì)胞中的miR-124表達(dá)水平明顯升高（圖2-A），感染12、24和48 h后的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于沙門氏菌感染前（0 h）;IQGAP2基因表達(dá)水平則明顯下調(diào)（圖2-B），感染12、24和48 h的相對(duì)表達(dá)量顯著低于沙門氏菌感染前（0 h）。在沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞內(nèi)，miR-124表達(dá)水平與IQGAP2基因表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.92）。

2. 3 沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞中IQGAP2蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

經(jīng)沙門氏菌感染后，豬巨噬細(xì)胞中的IQGAP2蛋白表達(dá)水平呈明顯下調(diào)趨勢。在沙門氏菌感染前（0 h）約有61.1%的IQGAP2陽性細(xì)胞，沙門氏菌感染12 h后約有43.6%的IQGAP2陽性細(xì)胞，感染24 h后約有38.2%的IQGAP2陽性細(xì)胞，感染48 h后僅有23.0%的IQGAP2陽性細(xì)胞。即沙門氏菌感染12和24 h后的IQGAP2陽性細(xì)胞約是沙門氏菌感染前（0 h）的2/3，感染48 h后的IQGAP2陽性細(xì)胞約為沙門氏菌感染前（0 h）的1/3。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見圖3。

2. 4 沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌數(shù)量的增殖規(guī)律

在沙門氏菌感染4 h后， miR-124高表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量明顯高于正常巨噬細(xì)胞（約1.5倍），IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量則是正常巨噬細(xì)胞的3.5倍。至沙門氏菌感染8 h后，miR-124高表達(dá)組和IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量持續(xù)上升，miR-124高表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量明顯高于正常巨噬細(xì)胞（約1.8倍），IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量是正常巨噬細(xì)胞的4.0倍。在沙門氏菌感染12 h后，各處理組的胞內(nèi)沙門氏菌數(shù)量均較感染8 h時(shí)有所上升，miR-124高表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量明顯高于正常巨噬細(xì)胞（約2.0倍），IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量是正常巨噬細(xì)胞的4.5倍。各感染時(shí)間點(diǎn)，miR-124敲低表達(dá)組胞內(nèi)沙門氏菌數(shù)量均顯著低于正常巨噬細(xì)胞;miR-124高表達(dá)+IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量與IQGAP2基因敲低表達(dá)處理組相比無顯著差異（P>0.05，下同），但顯著高于miR-124高表達(dá)組細(xì)胞;miR-124敲低表達(dá)+IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量與IQGAP2基因敲低表達(dá)處理組相比也無顯著差異，但顯著高于miR-124敲低表達(dá)組細(xì)胞、低于miR-124高表達(dá)+IQGAP2基因敲低表達(dá)組細(xì)胞。

3 討論

沙門氏菌通過糞口途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，部分酸耐受菌體從胃進(jìn)入小腸，穿過小腸黏膜層而作用于黏膜下層的M細(xì)胞（Prouty et al.，2004），再轉(zhuǎn)運(yùn)至腸系膜淋巴結(jié)（Chen et al.，2015）。沙門氏菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，主要通過以下3條途徑與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用：（1）來源于沙門氏菌的LPS在MD2和CD14輔助下能被TLR4受體識(shí)別，TLR4識(shí)別沙門氏菌后可激活巨噬細(xì)胞并作用于TLR4適配分子MyD88，從而激活下游TLR4信號(hào)通路和NFκB信號(hào)通路（Mastroeni et al.，2009;Deng et al.，2016）;（2）沙門氏菌通過III型分泌系統(tǒng)將菌體蛋白分泌到動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，直接（SopE和SopE2）或間接（SopB）作用于CDC42，并進(jìn)一步激活MAPK信號(hào)通路（Chen et al.，1996;Hobbie et al.，1997;Patel and Galán，2006）;（3）沙門氏菌基因組DNA可被動(dòng)物細(xì)胞的外源DNA識(shí)別蛋白（DAI、AIM2和RIG-I）所識(shí)別，進(jìn)而激活細(xì)胞質(zhì)DNA感知信號(hào)通路（Qiu et al.，2015;Mehta and Baltimore，2016）。已有的研究雖然從不同角度闡明沙門氏菌對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活機(jī)制，但仍然無法合理解釋沙門氏菌免疫逃避甚至攜帶排菌的現(xiàn)象。

miR-124在動(dòng)物免疫器官和免疫細(xì)胞，如外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)和胸腺中高表達(dá)，并廣泛參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程（Smerkova et al.，2015）。本研究結(jié)果表明，CSF誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞經(jīng)沙門氏菌感染后，miR-124呈上調(diào)表達(dá)，其上調(diào)表達(dá)機(jī)制可能與前人的相關(guān)研究結(jié)論（Mehta and Baltimore，2016;Sun et al.，2016）一致，即受沙門氏菌LPS-TLR信號(hào)的激活。IQGAP2基因的表達(dá)受甲基化和轉(zhuǎn)錄后水平等多種因素影響（Jin et al.，2008;Deng et al.，2016;Pelossof et al.，2016）。本研究的熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，IQGAP2基因3'-UTR區(qū)存在miR-124作用靶位點(diǎn)，一定程度上揭示了沙門氏菌感染仔豬巨噬細(xì)胞中miR-124與IQGAP2基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控關(guān)系。miR-124高表達(dá)及IQGAP2基因敲低表達(dá)組豬巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌數(shù)量顯著高于miR-124敲低表達(dá)組細(xì)胞，暗示miR-124可影響豬巨噬細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌數(shù)量，其機(jī)制可能是通過作用于IQGAP2信號(hào)而影響宿主細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬和加工能力，從而更有利于胞內(nèi)沙門氏菌的存活與增殖。因此，miR-124/IQGAP2路徑可能是沙門氏菌在宿主體內(nèi)存活、增殖及建立攜帶狀態(tài)的重要因素，是沙門氏菌激活宿主免疫的剎車系統(tǒng)，但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

沙門氏菌感染豬巨噬細(xì)胞中的miR-124表達(dá)水平與IQGAP2基因表達(dá)水平及胞內(nèi)沙門氏菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，即沙門氏菌可通過上調(diào)miR-124表達(dá)靶向抑制IQGAP2基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)其在豬巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）